Subido por Wilson Toro

PROYECTO FARMACOLOGÍA- ANTIBIOGRAMA- TORO WILSON

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UNIVERSIDAD TÉCNICA DE MACHALA
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
INGENIERÍA ACUÍCOLA
ELABORACIÓN DE ANTIBIOGRAMA APLICANDO 2 SUSTANCIAS
FRENTE A VIBRIOS SP.
Wilson Daniel Toro Proaño
Ing. Acuac. Sorroza Ochoa Lita Scarlett, Phd
Farmacología
EL ORO – MACHALA
2020
Índice de Contenido
I.
INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 4
II. OBJETIVOS ............................................................................................................... 5
2.1.
Objetivos General ................................................................................................ 5
2.2.
Objetivo Específicos ............................................................................................ 5
III.
DESARROLLO ...................................................................................................... 6
3.1.
Método del antibiograma disco-placa ................................................................... 6
3.2.
VIBRIOSIS ......................................................................................................... 6
3.3.
Descripción del AGAR TCBS.............................................................................. 7
3.4.
PRODUCTOS ..................................................................................................... 7
3.4.1.
PROTACID .................................................................................................. 7
3.4.2.
FLORFENICOL ........................................................................................... 8
IV.
MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................. 10
4.1.
MATERIALES .................................................................................................. 10
4.2.
MÉTODOS........................................................................................................ 10
4.2.1.
Preparación del AGAR TCBS ..................................................................... 10
4.2.2.
Siembra de Vibrios ..................................................................................... 11
4.2.3.
Aplicación de Sustancias ............................................................................ 11
V. RESULTADOS ........................................................................................................ 13
5.1.
PROTACID ....................................................................................................... 13
5.2.
FLORFENICOL ................................................................................................ 13
VI.
DISCUSIÓN ......................................................................................................... 15
VII.
CONCLUSIÓN ..................................................................................................... 16
VIII. REFERENCIAS .................................................................................................... 17
IX.
BIBLIOGRAFÍA................................................................................................... 18
ANEXOS ......................................................................................................................... 20
2
Índice de Figuras
Figura 1. PROTACID POR GALÓN ............................................................................................. 7
Figura 2. FLORFENICOL ............................................................................................................. 8
Figura 3.Diámetro de halo de réplica 1 y 2 de Protacid ................................................................. 13
Figura 4. Diámetro de halo de réplica 1 y 2 de Florfenicol ............................................................ 14
Figura 5. Florfenicol y Protacid .................................................................................................... 20
Figura 6. Aplicación de Agar a placas petri .................................................................................. 20
Figura 7. Preparado de Florfenicol al 0,5 % .................................................................................. 20
Figura 8. Antibiograma Replica 2................................................................................................. 21
Figura 9. Antibiograma Replica 1................................................................................................. 21
3
I.
INTRODUCCIÓN
La acuicultura, camaronicultura o producción de camarones en cautiverio, es una actividad
de cultivo en medio acuático, con fines de producción y comercialización como meta final,
industrializada por medio de la tecnología. El incremento en la producción de camarón ha
provocado un detrimento en la calidad de aguas, propiciando que las condiciones presentes
en los estanques pueden beneficiar el desarrollo de algunas comunidades específicas de
bacterias; mismas que pueden ser causa de serios problemas patológicos para los cultivos,
especialmente en los estadios larvales de los camarones. Los problemas que pueden llegar a
detectarse durante el muestreo son: camarón acalambrado, deformación del rostro y cuerpo,
camarón de leche, necrosis-Melanización branquial y cuticular, urópodos necrosados o
dañados, antenas rotas o deformes, coloración extraña en los organismos. Se debe registrar
cualquier signo anormal que se observe en los camarones. El diagnostico de las enfermedades
se vuelve cada vez más en una exigencia nacional e internacional, siendo relevante lograr un
diagnóstico rápido y oportuno a fin de mejorar las opciones para hacer frente a los diferentes
patógenos que hay en el camarón de cultivo (virus, bacterias, parásitos, hongos, etc)
(Aguilera-Díaz, 2002).
Es por ello que existen diferentes tipos de sustancias para el
tratamiento de dichas enfermedades como los fármacos los cuales se los puede extraer de
diferentes medios y su efectividad dependerá de las pruebas de laboratorio que se realice. En
este documento repasaremos el proceso de un antibiograma con respecto a sustancias para
probar su efectividad contra patógenos bacterianos.
4
II.
OBJETIVOS
2.1. Objetivos General
 Realizar un antibiograma utilizando dos sustancias contra Vibrios sp.
2.2. Objetivo Específicos
 Determinar la efectividad de las sustancias contra el patógeno.
 Discutir con diferentes autores de acuerdo a la efectividad de las sustancias
5
III.
DESARROLLO
3.1.Método del antibiograma disco-placa
El antibiograma disco-placa basado en el trabajo de Bauer, Kirby y colaboradores es uno de
los métodos que el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)
recomienda para la determinación de la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos. El
antibiograma disco-placa consiste en depositar, en la superficie de agar de una placa de petri
previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel secante impregnados con los
diferentes antibióticos. Tan pronto el disco impregnado de antibiótico se pone en contacto
con la superficie húmeda del agar, el filtro absorbe agua y el antibiótico difunde al agar. El
antibiótico difunde radialmente a través del espesor del agar a partir del disco formándose un
gradiente de concentración. Transcurridas 18-24 horas de incubación los discos aparecen
rodeados por una zona de inhibición (Picazo, 2010).
3.2.VIBRIOSIS
La Vibriosis es una enfermedad bacteriana, causada por cepas patógenas extracelulares de
varias especies pertenecientes al género Vibrio. Estas bacterias tienen en algunos casos una
patogénesis desconocida. En camarones penaeidos sólo se ha demostrado patogenicidad de
unas pocas especies de vibrios, a pesar de que se ha observado la existencia de muchas
bacterias en camarones enfermos. La Vibriosis como patología de etiología bacteriana, ha
sido la causa de mortalidades en cultivos de camarón en países productores del mundo entero
y afecta tanto en larvicultura como en fase de engorde en estanques de cultivo. Los brotes de
Vibriosis suelen darse cuando hay un cambio súbito de las condiciones ambientales,
produciéndose un aumento en la velocidad de la reproducción bacteriana, superándose así las
cargas toleradas por el organismo de los camarones. Las Vibriosis en camarones pueden
presentarse como Vibriosis Oral, Vibriosis Entérica, Enfermedad de la Concha, Vibriosis
Localizadas en las Heridas, Necrosis Séptica del Hepatopáncreas, Vibriosis Cuticular y de
los Apéndices, Necrosis de la Cola, Síndrome de la Concha Suelta (SLSS), Enfermedad del
Intestino Blanco (WGD), Enfermedad Roja y Vibriosis Sistémica. (Cuéllar-Anjel, 2013).
6
3.3.Descripción del AGAR TCBS
TCBS Agar (agar tiosulfato citrato bilis sacarosa) es un medio selectivo de diferenciación
para el aislamiento y cultivo de Vibrio cholerae y otras especies Vibrio a partir de muestras
clínicas y de otras clases. En BD TCBS Agar, el extracto de levadura y la peptona
proporcionan el nitrógeno y las vitaminas. El citrato sódico, el tiosulfato sódico, la bilis de
buey y el colato son agentes selectivos que proporcionan un pH alcalino para inhibir los
organismos gram positivos y suprimir los organismos coliformes. El pH del medio se
incrementa para favorecer el crecimiento de Vibrio cholerae porque este organismo es
sensible a los entornos ácidos. La alta concentración de sodio favorece el crecimiento de
Vibrio cholerae que es halotolerante y de otras especies de Vibrio, cuya mayoría es halofílica.
La sacarosa es un carbohidrato fermentable, y el cloruro sódico estimula el crecimiento. El
tiosulfato sódico es una fuente de azufre y actúa con el citrato férrico como indicador para
detectar la producción de ácido sulfhídrico. El azul de bromotimol y el azul de timol son
indicadores de pH.
3.4.PRODUCTOS
3.4.1. PROTACID
Figura 1. PROTACID POR
GALÓN
Protacid OX es un potente bactericida a base de Ácidos Orgánicos (Ácido Fórmico y Acido
Lignosulfonico) que controla el pH en alimentos balanceados de uso acuícola © inhibe por
contacto el desarrollo de bacterias patógenas como Vibrio sp. y Pseudomonas sp
TECNOLOGIA PROTEC®
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Protacid OX es fabricado mediante tecnología PROTEC®, que incorpora Acido
Lignosulfonico y que permite reducir la corrosividad de los acidificantes. A través de este
método, se logra una mayor concentraci6n de ácido fórmico, rninirnizando su corrosividad
hasta en un 95% y disminuyendo su volatilidad hasta un 70%.
Como resultado, Protacid OX es un acidificante altamente eficaz y de fácil manipulaci6n, en
comparaci6n con otros productos compuestos por sales de ácidos orgánicos. También es una
alternativa para reemplazar pre-mezclas que contengan formaldehido.
Presentación de caneca de 25 Kg. La Dosis recomendada en de 5 – 8 ml por Kilo de
Balanceado (AgroAndres, 2019).
3.4.2. FLORFENICOL
Figura 2. FLORFENICOL
Florfenicol, es un bacteriostático que inhibe la síntesis de proteínas mediante la unión a
subunidades ribosomales de bacterias susceptibles que conduce a la inhibición de la peptidil
transferasa y evitando de este modo la transferencia de aminoácidos a las crecientes cadenas
peptídicas y la formación posterior de proteínas, incluyendo muchos organismos gram
8
negativas y gram positivas, sin embargo, el florfenicol no tiene riesgo de inducir anemia
aplásica humana.
Almacenamiento
Florfenicol seguirá siendo viable para su uso por un período de 2 años a partir de la fecha de
fabricación. Conservar en un lugar fresco y seco. Evitar la exposición directa y prolongada
de la luz solar. Manténgase fuera del alcance de los niños.
Aplicación
Dosifique 3 a 5 kg del producto por tonelada de balanceado. La dosis de uso puede variar
con la directa recomendación de su técnico acuícola.
Importante: Periodo de retiro 30 días desde la última administración del producto (Prilabsa,
2018).
9
IV.
MATERIALES Y MÉTODOS
4.1.MATERIALES
 Agua destilada
 Vaso precipitación
 Erlenmeyer
 Mandil
 Guantes
 Mascarilla
 Cinta
 Gramera digital
 Aluminio
 Alcohol
 Cocineta Eléctrica
 Florfenicol
 Protacid
 Hisopos esterilizados
 Encendedor
 Discos
 Medio de cultivo: Agar TCBS
 Caja Petri
4.2.MÉTODOS
4.2.1. Preparación del AGAR TCBS
1. Esta práctica se realizó a las 13:00 el día jueves, 12 de noviembre en el
Laboratorio de microbiología a cargo del Dr. Mario Loaiza.
2. Cabe recalcar que para la elaboración del antibiograma se debe realizar con el
medio de cultivo Mueller Hinton pero por otros factores se desarrolló con este
medio de cultivo.
3. Para realizar el medio de cultivo se utiliza 89,9 gr por Litro de Agua Destilada, se
hizo una relación por 30 ml es decir se usó 2,7 g de Agar.
10
4. Utilizamos el Erlenmeyer manteniéndolo en constante agitación para evitar lo
grumos y que la solución realice ebullición ya hecho esto se colocó en 2 cajas
Petri del Medio TCBS y se dejó solidificar abriendo un poco la tapa.
4.2.2. Siembra de Vibrios
1. Anteriormente ya tenían cepas de Vibrios sembrados en una placa de las cuales
hicimos uso de los hisopos previamente esterilizados.
2. Utilizando estos y ya el medio TCBS solidificado con delicadeza se procedió a tomar
una buena cantidad del patógeno.
3. Se utilizó la técnica del rayado por duplicado es decir una en cada placa.
4.2.3. Aplicación de Sustancias

PROTACID
1. Con la ayuda de una pinza extraemos dos discos para el antibiograma en el
producto Protacid directamente por un tiempo corto.
2. Esto se hace para que el disco absorba la mayor cantidad de sustancia posible
3. Debido a que su aplicación fue directa al producto no se diluyo o preparo una
solución con la sustancia.
4. Luego se extrajo del producto y con la pinza se colocó en la placa con cuidado
5. Con el lado opuesto se presionó para que quede sujeta al medio de cultivo
6. Se procedió a hacer lo mismo en la segunda placa

FLORFENICOL
1. Para la preparación de esta solución nos basamos en su dosificación de 3-5 kg/T
de balanceado.
2. Realizamos la dosis de 5 kg/T lo mismo que comprimimos para 100 ml de la
siguiente manera:
5
kg
1T
1000 g
g
1L
x
x
=5 x
x100ml = 0,5 %
T 1000 L 1 Kg
L 1000ml
3. Procedimos a utilizar la Gramera para pesar y una vez obtenido el grameaje
colocamos en los 100 ml de agua destilada
4. Homogenizamos bien y realizamos el mismo proceso de los discos sumergidos
en la solución para posteriormente colocarlos en ambas placas
11
5. Como último paso utilizamos un marcador para dividir las placas donde se habían
aplicado varias soluciones y proceder con el etiquetado
6. Se cubrió con papel de aluminio y se dejó las placas a temperatura ambiente por
24 horas para observar los primeros resultados.
12
V.
RESULTADOS
5.1.PROTACID
# Réplica
Diámetro de Halo
1
29, 8 mm
2
33 mm
Figura 3.Diámetro de halo de réplica 1 y 2 de Protacid
5.2.FLORFENICOL
# Réplica
Diámetro de Halo
1
32,5 mm
2
32,7 mm
13
Figura 4. Diámetro de halo de réplica 1 y 2 de Florfenicol
Debido a que ambas placas se observó un halo de inhibición mayor de 20 mm se comprueba
la efectividad de Protacid y Florfenicol contra el patógeno.
14
VI.
DISCUSIÓN
En cuanto a la utilización de ácido fórmico (Mine y Boopathy, 2013) expresa El ácido
fórmico es el ácido órganico con mayor inhibición de bacterias V. alginolyticus, V. cholearae,
V. harveyi, V. parahaemolyticus y V. vulnificus. En el resultado obtenido del antibiograma se
ve reflejado la efectividad, aunque desconozco la concentración de ácido fórmico del
producto debido a que se colocó directamente en la sustancia, una idea en cuanto a la
concentración se observa en el estudio de (Adams & Boopathy, 2013) que indican la
Concentración efectiva para Vibrios es de 0,04%.
(Reyes, 2018) trabajaron con 7 especies de Vibrios, predominando V. harveyi y V.
alginolyticus con un 33 y 29% respectivamente, seguido de V. owensii, V. campbellii, con un
10% y V. sp, V. natriegens y V. inhibens con un 5%, donde el MIC de florfenicol en el 81%
de las cepas analizadas en este estudio varió entre 5 y 10 ppm. La sensibilidad de los aislados
fue del 100% de las cepas a 30 μg. Al contrario de (Rosado Salazar, 2018) donde con cepas
de la misma especie usando 30 ug de Florfenicol hubo sensibilidad del 71.9 %. (SotoRodríguez, Armenta & Gomez-Gil, 2006) probaron concentraciones de Florfenicol 5-60
ug/ml en Zoea 1 y 2 de Penaeus vannamei resultaron efectivas contra Vibrios, pero con un
CL50 a partir de 20 ug/ml. En nuestro estudio reflejo la efectividad a concentraciones de
5000 ppm lo cual contrasta con la mayoría de los autores lo cual indica la aplicación excesiva.
15
VII. CONCLUSIÓN
De acuerdo al proyecto realizado concluyo que se deben realizar análisis más detallados de
las Concentraciones mínimas inhibitorias ya que esto se ve detallado en la mala dosificación
de antibióticos a los piensos o al medio de cultivo lo que genera resistencia de los patógenos,
de manera que una alternativa usada son los tratamientos con ácidos orgánicos aunque de
una u otra manera también se debe de controlar adecuadamente la dosificación de estos, los
efectos que causa a las enfermedades en camarones y el impacto ambiental que puede causar.
16

VIII. REFERENCIAS
Mover constantemente el Agar mientras se prepara para evitar la formación de
grumos, así como la precipitación del mismo

Evitar aplicar mucha fuerza al sembrar el patógeno en el agar ya que este puede
desintegrarse.

Esterilizar las pinzas cada vez que se colocó un disco con distinta sustancia

Lavarse las manos ya que se trabaja con patógenos directamente
17
IX.

BIBLIOGRAFÍA
AgroAndres. (2019). Obtenido de PROTACID: https://agroandres.com.ec/productoagropecuario/acidos-organicos/protacid/

Adams, D., & Boopathy, R. (2013). Use of formic acid to control vibriosis in shrimp
aquaculture.
Biologia,
68(6),
1017-1021.
Obtenido
de
https://www.degruyter.com/view/journals/biolog/68/6/article-p1017.xml

Aguilera-Díaz, M. M. (2002). Los cultivos de camarón en la Costa Caribe
colombiana. Capítulo 5. Los cultivos de camarón en la Costa Caribe colombiana.
Pág.:
198-233.
Obtenido
de
https://www.researchgate.net/publication/5007450_Los_cultivos_de_camarones_en
_la_Costa_Caribe_Colombiana

Mine, S., & Boopathy, R. (2013, Julio). Effect of Organic Acids on Shrimp Pathogen,
Vibrio harveyi. Current Microbiology, 63, 1-7. doi:10.10007/s00284-011-9932-2

Picazo, J. (2010). Procedimientos en Microbiología Clínica. Obtenido de Metodos
básicos
para
el
estudio
de
la
sensibilidad
antimicrobiana:
https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiol
ogia/seimc-procedimientomicrobiologia11.pdf

Prilabsa.
(2018).
Obtenido
de
Florfenicol:
https://prilabsa.com/productos/aditivos/florfenicol/
 Reyes Delgado, J. K. (2018). Sensibilidad bacteriana a agentes terapéuticos
utilizados para controlar problemas bacterianos en larvicultura de Penaeus
(Litopenaeus) vannamei (Bachelor's thesis, La Libertad: Universidad Estatal
Península
de
Santa
Elena,
2018.).
Obtenido
de
https://repositorio.upse.edu.ec/xmlui/handle/46000/4432

Rosado Salazar, A. A. (2018). Resistencia Antimicrobiana de bacterias del género
Vibrio en langostino blanco (Litopenaeus vannamei) en centros de cultivo de la
región Tumbes. Obtenido de http://repositorio.urp.edu.pe/handle/URP/1686

Soto-Rodríguez, S., Armenta, M., & Gomez-Gil, B. (2006). Effects of enrofloxacin
and florfenicol on survival and bacterial population in an experimental infection with
luminescent Vibrio campbellii in shrimp larvae of Litopenaeus vannamei.
18
Aquaculture,
255(1-4),
48-54.
Obtenido
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0044848605007362
19
de
ANEXOS
Figura 5. Florfenicol y Protacid
Figura 6. Aplicación de
Agar a placas petri
Figura 7. Preparado de
Florfenicol al 0,5 %
20
Figura 9. Antibiograma Replica 1
Figura 8. Antibiograma Replica 2
21
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