UN CANDIDATO A VACUNA CONTRA LA SÍFILIS DEFINIDO INHIBE LA DISEMINACIÓN DE TREPONEMA PALLIDUM SUBESPECIE PALLIDUM La sífilis es una enfermedad importante en los países de ingresos bajos y medios, y una amenaza de salud pública reemergente en los países de ingresos altos. La eliminación de la sífilis requerirá el desarrollo de una vacuna eficaz que hasta ahora ha sido difícil de alcanzar. Aquí evaluamos el potencial vacunal de Tp0751, una adhesina vascular del agente causante de la sífilis, Treponema pallidum subsp. pallidum. Los animales inmunizados con Tp0751 exhiben una carga de órganos bacterianos significativamente reducida tras la exposición a T. pallidum en comparación con los animales no inmunizados. Introducción de ganglios linfáticos de T. pallidum inmunizado con Tp0751-Animales desafiados a animales ingenuos no inducen infección, lo que confirma la protección estéril. Estos hallazgos proporcionan evidencia de que Tp0751 es un candidato prometedor para la vacuna contra la sífilis. Sífilis, causada por una infección por la espiroqueta Treponema pallidum subsp. pallidum (en lo sucesivo, T. pallidum), sigue siendo una enfermedad prevalente, especialmente en los países de ingresos bajos y medianos, con una carga mundial estimada de 36 millones de casos y 11 millones de casos nuevos por año. Las tasas de sífilis infecciosa entre hombres que tienen sexo con hombres (HSH) están exhibiendo un aumento alarmante, con una tasa de 228,8 casos por 100.000 HSH (0,228%) informada en los Estados Unidos en 2013 en comparación con una tasa de 15,8 por 100.000 HSH. población (0,016%) informada en 2000. Se están observando aumentos similares en China, Inglaterra, Canadá y Australia. La transmisión de la sífilis de madre a hijo también está en aumento, con un estimado de 1,36 millones de mujeres embarazadas infectadas cada año en todo el mundo y más de 500.000 de estos embarazos conducen a resultados adversos que incluyen aborto espontáneo, muerte fetal, parto prematuro, muerte neonatal y manifestaciones de enfermedades congénitas. sífilis. Las infecciones por sífilis sintomáticas aumentan la transmisión y adquisición del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) de dos a cinco veces, y los estudios de modelos predicen que la erradicación de la sífilis tendría un impacto significativo en la prevención del VIH. La creciente prevalencia de sífilis infecciosa y congénita, a pesar de la continua sensibilidad de T. pallidum al tratamiento con penicilina, subraya la necesidad de desarrollar una vacuna contra la sífilis como complemento a los enfoques tradicionales de detección y tratamiento para la eliminación global de la sífilis. Además, aunque T. pallidum aún no ha mostrado resistencia a la penicilina, ha surgido resistencia a la terapia de segunda línea, como los antibióticos a base de macrólidos. Como resultado, y debido a las devastadoras consecuencias de la sífilis congénita, las mujeres embarazadas alérgicas a la penicilina requieren desensibilización y tratamiento con penicilina, lo que enfatiza aún más la necesidad de una medida de control alternativa. El desarrollo eficaz de una vacuna contra la sífilis debe centrarse en la naturaleza altamente invasiva de T. pallidum que se disemina a través del torrente sanguíneo y los vasos linfáticos e invade una amplia variedad de tejidos y órganos. Treponema pallidum subsp. pallidum cruza las barreras endoteliales, placentaria y hematoencefálica en las primeras etapas de la infección, como lo demuestran las manifestaciones clínicas generalizadas asociadas con las infecciones por sífilis, la aparición de sífilis congénita y la invasión del sistema nervioso central observada en aproximadamente el ~40% de los pacientes con sífilis temprana. Sin embargo, existe un conocimiento limitado de los mecanismos responsables de la capacidad de diseminación generalizada de T. pallidum. Una proteína de T. pallidum que se ha implicado en la diseminación treponémica es la adhesina Tp0751. Los ensayos de opsonofagocitosis proporcionan evidencia de la presencia de esta lipoproteína en la superficie de T. pallidum, lo que facilitaría la interacción directa con el entorno del huésped. Se ha demostrado que Tp0751 se une a múltiples componentes de la matriz extracelular, incluyendo laminina, fibronectina y fibrinógeno. Todos estos componentes del hospedador están muy próximos al endotelio vascular y, por lo tanto, se sugiere que la interacción de Tp0751 con estas moléculas posicione idealmente T. pallidum para facilitar la diseminación a través del torrente sanguíneo. Los intentos anteriores de desarrollo de vacunas para la sífilis han logrado diversos grados de éxito. La inmunización de conejos, el modelo animal óptimo que recapitula las múltiples etapas y la cronicidad de la sífilis humana, con una selección de proteínas recombinantes individuales ha provocado en el mejor de los casos una protección parcial. Se han logrado resultados de protección más prometedores utilizando células enteras atenuadas Preparaciones de T. pallidum. Como informó Miller en 1973, la inmunización con T. pallidum irradiado con γ proporcionó una protección completa tras la exposición homóloga en el modelo de conejo, como lo demuestra la ausencia de lesiones primarias en los sitios de exposición y la imposibilidad de inducir la infección tras la transferencia de los ganglios linfáticos de estos conejos a conejos ingenuos. En el Miller 33 estudio, los conejos se les dio 60 inyecciones intravenosas que contienen un total de 3,7 × 109 γ-irradiado T. pallidum durante un período de 37 semanas. Aunque este régimen de inmunización no es práctico para su uso en humanos, este estudio avanzó significativamente en el campo del desarrollo de vacunas contra la sífilis, ya que ilustró que la protección estéril se puede lograr con éxito con la selección de antígenos adecuada y, al mismo tiempo, destacó la importancia de los antígenos de superficie de T. pallidum en conferir protección. Aquí investigamos la capacidad de la inmunización Tp0751 para inhibir la diseminación de T. pallidum a sitios de órganos distantes en conejos. Mostramos que los animales inmunizados con Tp0751 muestran una carga treponémica reducida en múltiples órganos distantes al sitio de exposición en comparación con los animales de control no inmunizados. Además, demostramos que los ganglios linfáticos recuperados de animales inmunizados con Tp0751 no inducen una infección productiva cuando se inyectan en animales receptores sin tratamiento previo, lo que demuestra además que la inmunización con Tp0751 inhibe la diseminación treponémica a sitios de órganos distantes. Nuestros resultados apoyan a Tp0751 como una vacuna candidata prometedora para prevenir la propagación hematógena de T. pallidum dentro del huésped. Resultados La inmunización con Tp0751 atenúa el desarrollo de lesiones. Se sedaron e inmunizaron tres conejos tres veces con Tp0751 emulsionado en adyuvante TiterMax Gold a intervalos de 3 semanas, lo que provocó la inducción de títulos altos de anticuerpos anti-Tp0751 en cada uno de los animales inmunizados (Figura 1 y las figuras complementarias 1 y 2). Las investigaciones de control previas realizadas utilizando un régimen de inmunización solo con adyuvante no mostraron un efecto protector de la inmunización simulada con un adyuvante de conejo en ausencia del antígeno, descartando así la posibilidad de que el adyuvante solo confiera inmunidad protectora. A las 3 semanas siguientes a la inmunización final, los animales inmunizados y los animales de control no inmunizados se sedaron y se desafiaron por vía intradérmica con 1 x 106 T. pallidum subsp. pallidum, cepa Nichols, en cada uno de los 10 sitios en sus espaldas afeitadas (total de 1 × 107 T. pallidum/conejo; Figura 1a). Durante los siguientes 14 días, se controlaron los sitios de exposición para detectar la aparición de lesiones indoloras, o chancros, que surgen en el sitio de inoculación y son exclusivos de la sífilis. El chancro representa el primer signo clínico de infección y, por lo tanto, el seguimiento del desarrollo del chancro proporciona una métrica de la eficacia de la vacuna. Las lesiones se controlaron diariamente para determinar el diámetro, la induración, la ulceración y la presencia de T. pallidum viable. El día 14, las lesiones estaban presentes en todos los animales; sin embargo, los animales inmunizados mostraron un retraso en el desarrollo de la lesión en comparación con los animales de control no inmunizados. Los animales de control presentaron un 100% de induración de la lesión (endurecimiento de la piel debido a la inflamación) el día 4, mientras que los animales inmunizados solo alcanzaron el 67% de la induración observada en los animales de control el día 4 y no coincidieron con el nivel de induración observado en los animales de control hasta el día. 10 (tabla 1). La ulceración indolora en los animales de control fue aparente ya en el día 10 y el 100% de las lesiones estaban ulceradas el día 14. Los animales inmunizados mostraron signos de ulceración indolora el día 10, pero para el día 14 solo el 47% de las lesiones estaban ulceradas (Figura 2a). El diámetro de la lesión observado en los animales de control fue consistentemente un 20% mayor que el de los animales inmunizados durante el período de medición de 14 días (Figura 2b y tabla 1). En el día 10 después de la exposición (PC), cada lesión se evaluó mediante microscopía de campo oscuro para detectar la presencia de T. pallidum viable. El 70% de las lesiones de los animales de control fueron positivas para T. pallidum en comparación con solo el 20% de las lesiones de los animales inmunizados (Figura 2c, P=0,002, prueba t de Student de dos colas). Además, las lesiones positivas en campo oscuro de los controles tenían una densidad significativamente mayor de treponemas y al menos el 50% de estos organismos eran móviles, mientras que las lesiones positivas en campo oscuro de animales inmunizados tenían solo unas pocas treponemas presentes por campo y estos organismos no eran móviles. El análisis de la progresión de la lesión reveló una disminución significativa en la ulceración de la lesión (Figura 2a, P=0,0011) y carga treponémica (Figura 2c, P=0,02), y una tendencia hacia la disminución del diámetro de la lesión (Figura 2b, P=0,11) en animales inmunizados con Tp0751. FIGURA 1: Resumen experimental. (a) Inmunización y desafío. Los conejos recombinantes inmunizados con Tp0751 (N = 3; cada inmunización se administró como cuatro inyecciones subcutáneas (SC) de 0,1 ml en los hombros y dos inyecciones intramusculares (IM) de 0,04 ml en los músculos del cuádricep) y los animales de control (N = 2) se administraron por vía intradérmica desafiado con 1 × 106 T. pallidum subsp. pallidum, cepa Nichols, en cada uno de los 10 sitios. El día 14 después de la exposición (PC), los animales se sacrificaron y los órganos se recolectaron para la evaluación de qPCR de la carga bacteriana; Se extrajeron y procesaron los ganglios linfáticos poplíteos para la transferencia de los ganglios linfáticos. (b) Transferencia de ganglios linfáticos. Los nódulos linfáticos poplíteos se recogieron de animales de control e inmunizados con Tp0751 recombinante y se inyectaron en los testículos de animales sin tratamiento previo. La inmunización con Tp0751 inhibe la diseminación de T. pallidum. Para evaluar si la inmunización con Tp0751 confiere protección contra la diseminación treponémica, los animales de control e inmunizados se sacrificaron durante 14 días PC. A continuación, realizamos PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) para evaluar la carga de T. pallidum en muestras de biopsia de lesiones que surgen en los sitios de desafío y sitios de órganos distantes a la ubicación de desafío. El análisis de la carga treponémica local promedio reveló una ligera tendencia hacia un aumento de las concentraciones de ADN de T. pallidum (copias flaA por μg de ADN del tejido del hospedador) en los sitios de lesión primaria de los tres animales inmunizados en comparación con los dos animales de control no inmunizados (Figura 3a). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la carga promedio más alta resultó de la detección de una carga treponémica más alta en el conejo 1 inmunizado (Im1), mientras que los conejos Im2 e Im3 exhibieron cargas treponémicas más bajas que los animales de control (Figura 3a y tabla 1). Algo contradictorio con esta observación, la evaluación microscópica de las lesiones primarias reveló que todos los animales inmunizados tenían cargas treponémicas más bajas en comparación con el grupo de control (Figura 2c). Mientras que el análisis de campo oscuro de los aspirados de lesiones de animales infectados permite diferenciar entre organismos vivos y muertos en función de la motilidad, la qPCR detecta el ADN de organismos vivos y muertos que, como era de esperar, daría como resultado un valor más alto. Una evaluación detallada de la viabilidad de las treponemas en PC de animales inmunizados con Tp0751, probablemente usando análisis de transcriptasa inversa-qPCR para detectar ARN en organismos viables, debe esperar más estudios. La carga treponémica también se evaluó en los órganos distantes del hueso, el hígado y el bazo para proporcionar una indicación de la capacidad de T. pallidum para diseminarse desde el sitio de la infección inicial. Estos sitios fueron elegidos debido a la propensión de T. pallidum a diseminarse y ser detectado en estos órganos. La carga treponémica en los extractos de hueso, hígado y bazo reveló una tendencia generalizada hacia concentraciones más bajas de ADN en todos los animales inmunizados (Fig. 3b–d). La disminución más destacada se observó para las concentraciones de ADN de T. pallidum en el bazo de los animales inmunizados en comparación con los controles no inmunizados (Figura 3d). Es importante destacar que el análisis de la carga treponémica total en todos los sitios de infección distantes reveló una disminución significativa en la carga dentro de los animales inmunizados en relación con los controles no inmunizados (Figura 3e, P<0,005, prueba de Mann-Whitney), lo que indica que la inmunización con Tp0751 inhibe la diseminación de T. pallidum a estos órganos distantes. Para determinar más a fondo si la inmunización con Tp0751 protege contra la diseminación de T. pallidum, se transfirieron los ganglios linfáticos poplíteos de dos animales control y tres inmunizados a cinco animales receptores no expuestos y sin experiencia (Figura 1b). El estado de infección de los animales receptores se evaluó mediante serología (a través del laboratorio de investigación de enfermedades venéreas (VDRL) y pruebas de absorción de anticuerpos treponémicos fluorescentes (FTA-ABS)), análisis microscópico de campo oscuro de aspirados testiculares y desarrollo de orquitis testicular (Figura 1 by Cuadro complementario 2). De acuerdo con la tendencia observada en los resultados de qPCR, la transferencia de los ganglios linfáticos poplíteos de los animales de control no inmunizados a los animales receptores sin tratamiento previo dio como resultado evidencia de seroconversión el día 17 posterior a la transferencia, fuerte seroconversión el día 31 posterior a la transferencia y desarrollo de orquitis asintomática durante el día 42 después de la transferencia (Tabla 2 y Cuadro complementario 2). El análisis de campo oscuro de los testículos de los animales receptores de control en el momento de la eutanasia confirmó la presencia de T. pallidum móvil. Por el contrario, ninguno de los tres animales sin tratamiento previo que recibieron ganglios linfáticos de los animales inmunizados con Tp0751 desarrolló orquitis; dos de los animales que recibieron ganglios linfáticos de animales inmunizados (designados R-Im1 y R-Im2) no se seroconvirtieron durante la duración del experimento, y al menos dos de los animales receptores (R-Im1 y R-Im2) no tenían treponemas presentes a través del análisis de campo oscuro (Tabla 2; análisis de campo oscuro no realizado para R-Im3). Curiosamente, el Im3 de conejo tuvo la carga trepomemal más baja detectada en las biopsias de la lesión, con un promedio de 1,66 × 106 copias flaA por μg de ADN de conejo detectado en comparación con 2,04 × 107 y 3,15 × 106 copias flaA por μg de ADN de conejo para conejos Im1 e Im2, respectivamente (Figura 3a y tabla 1). Esto puede sugerir una disminución de la proliferación de T. pallidum en los sitios de lesión o puede indicar un mayor número de T. pallidum diseminado desde el sitio de exposición en este conejo. De acuerdo con esta observación, la transferencia de ganglios linfáticos de Im3 de conejo a R-Im3 de conejo sin tratamiento previo llevó a la seroconversión en este animal en el día 73, lo que sugiere que algunas treponemas pueden haber estado presentes en los ganglios linfáticos transferidos, lo que da como resultado una infección de bajo nivel que condujo a una seroconversión tardía tabla 1y Cuadro complementario 2). Sin embargo, las cargas treponémicas detectadas en el bazo y el hígado de conejo Im3 fueron las más bajas de los tres animales inmunizados (Figura 3c, d, tabla 1), lo que sugiere que la seroconversión observada en el R-Im3 de conejo no se produjo como resultado de una mayor diseminación treponémica a sitios de órganos distantes en Im3 de conejo. La evidencia que respalda esto proviene de la débil reactividad del VDRL que no aumentó significativamente con el tiempo, y el aumento lento y mínimo del FTA-ABS observado para el conejo R-Im3 (tabla 1 y Cuadro complementario 2). en el sitio de la lesión local, así como en los sitios de infección diseminada. Estos incluyeron el hígado y los huesos, donde no se detectó ADN treponémico mediante el análisis de qPCR (Figura 3b, c y tabla 1), así como el bazo, donde se detectó un nivel bajo de ADN treponémico (Figura 3d y tabla 1). Discusión FIGURA 2: La inmunización con Tp0751 disminuye la gravedad y la carga bacteriana en las lesiones primarias. (a) La ulceración de la lesión y (b) el diámetro de la lesión se controló durante 14 días en animales de control (N = 2) e inmunizados (N = 3) después de la exposición a T. pallidum. (c) La carga bacteriana en las lesiones se evaluó el día 10 PC examinando la presencia de T. pallidum utilizando microscopía de campo oscuro. Los resultados se presentan como mediana intervalo de confianza del ±95% entre animales inmunizados individuales (N = 3) o control (N = 2). La significancia se evaluó mediante regresión no lineal y suma adicional de cuadrados F-test (**P<0,005 (a,b)) o una prueba t de dos colas (*P<0.05 (c)). La inmunización con Tp0751 promueve la infiltración celular. Las muestras de biopsia obtenidas de los sitios de lesiones primarias de los animales inmunizados y de control se analizaron para detectar la presencia de cuatro subconjuntos de células inmunes. Los animales inmunizados tenían niveles más altos de infiltrados celulares en todos los tipos de células analizados, incluidos neutrófilos, células dendríticas, linfocitos y células B diferenciadas (Figura 4). El análisis de la composición del infiltrado celular total en los sitios de lesiones primarias reveló un aumento significativo en la cantidad de infiltración celular en las lesiones de animales inmunizados con Tp0751 frente a controles no inmunizados (Figura 4e, P=0,045, prueba de Mann-Whitney). En particular, el conejo inmunizado Im3 tuvo los recuentos de células más altos para cada tipo de célula inmunitaria analizada, lo que sugiere que este animal tenía la infiltración de células inmunitarias más pronunciada en el día 14 PC (Figura 4, tabla 1). De acuerdo con esta observación, el Im3 de conejo también tenía la carga treponémica más baja de todos los animales Los resultados presentados en este estudio demuestran que los animales inmunizados con Tp0751 presentan un desarrollo de lesiones atenuado, inhibición de la diseminación de T. pallidum y aumento de la infiltración celular en los sitios de la lesión (Figura 5a). La carga treponémica en los sitios de lesiones primarias se analizó tanto visualmente mediante microscopía de campo oscuro como cuantitativamente mediante qPCR. En comparación con los dos controles no inmunizados, los tres animales inmunizados mostraron un desarrollo de lesiones atenuado y, por análisis de campo oscuro, cargas significativamente menores de T. pallidum en los sitios de lesiones primarias. Sin embargo, los resultados de qPCR demostraron que Im1 de conejo inmunizado tenía la carga treponémica más alta en los sitios de lesión entre todos los animales inmunizados y de control, mientras que solo el 20% de las lesiones de Im1 de conejo analizadas por microscopía de campo oscuro fueron positivas para treponemas móviles en comparación con 77,8% y 60% para los conejos de control Ct1 y Ct2, respectivamente. Esta observación de una mayor carga treponémica en Im1 podría sugerir que este animal experimentó un aumento de T. pallidum retención en el sitio de exposición y, por extensión, redujo la diseminación de T. pallidum desde el sitio de la lesión primaria. Sin embargo, estos resultados deben interpretarse con cautela ya que es difícil llegar a una conclusión definitiva sobre la verdadera carga de lesiones en Im1 debido a la variabilidad entre conejos observada que se ve aún más confusa por el hecho de que qPCR es capaz de detectar ADN de ambos animales vivos. y organismos muertos. FIGURA 3: La inmunización con Tp0751 inhibe la diseminación de T. pallidum. La carga de T. pallidum se evaluó en animales control (Ct, N = 2) e inmunizados (Im, N = 3) mediante PCR cuantitativa en tiempo real para medir las concentraciones de ADN flaA en biopsias de lesiones ((a); sitio de infección local) y en sitios de infección diseminada, (b) hueso, (c) hígado y (d) bazo. Los resultados se normalizaron a la concentración de ADNg de conejo y se presentaron como mediana ± rango intercuartílico (IQR); los puntos corresponden a muestras extraídas por separado de cada animal. (e) Se evaluó la carga diseminada total entre los animales de control (n = 6 muestras, 3 muestras por animal) y los animales inmunizados (n= 9 muestras) en todos los sitios diseminados (hueso, azul; hígado, naranja; bazo, morado) usando la prueba de Mann-Whitney (**P<0,005). Para confirmar que se ha logrado la inmunidad esterilizante, los animales que reciben ganglios linfáticos de animales inmunizados expuestos no deben mostrar ningún signo físico o serológico de infección. Los animales receptores de los ganglios linfáticos de Im1 e Im2 (R-Im1 y R-Im2) no se seroconvirtieron ni desarrollaron orquitis asintomática después de la transferencia durante un período de observación de 185 días, y el análisis de campo oscuro de los extractos de testículos no detectó ninguna presencia de T. pallidum (Figura 5b). El Im3 de conejo inmunizado albergaba la carga treponémica más baja tanto en los sitios de desafío como en los sitios distales de los órganos y mostraba los niveles más altos de infiltración de células inmunitarias en el día 14 PC. Este alto grado de aclaramiento está en desacuerdo con la observación de que el R-Im3 de conejo, que recibió ganglios linfáticos poplíteos de Im3 de conejo, se seroconvirtió durante el transcurso del experimento, aunque en un momento tardío. Esta seroconversión, que mostró una reactividad VDRL débil y no aumentó sustancial o rápidamente para el ensayo FTAABS, puede indicar la transferencia de treponemas muertos residuales que drenan a los ganglios linfáticos poplíteos en Im3 de conejo y, por lo tanto, puede no ser indicativo de un activo infección en este animal receptor. Además, los altos niveles de infiltrado celular observados en Im3 de conejo en el día 14 PC podrían sugerir que este punto de tiempo representa la respuesta inmune máxima dentro de las lesiones de este animal en particular. Durante la progresión natural de una lesión primaria de conejo, el aclaramiento treponémico máximo coincide con el aumento de la prevalencia de macrófagos seguido de la detección de organismos dentro de estas células inmunes.35 . Esto podría respaldar aún más la idea de que los treponemas se estaban eliminando y drenando hacia los ganglios linfáticos poplíteos en este momento. Sin embargo, en ausencia de un curso temporal de infiltración celular más completo, actualmente es imposible determinar si este es el caso. El aclaramiento eficaz de T. pallidum de los sitios de lesiones primarias depende del desarrollo de una respuesta de citocina Thelper tipo 1 (Th1) producida predominantemente por células T CD4+, la activación posterior de macrófagos residentes y la presencia de suero específico contra T. pallidum para promover la opsonofagocitosis de treponemas por los macrófagos. El análisis histológico de los sitios de lesión primaria en los animales de control e inmunizados reveló un aumento significativo en la infiltración celular en los animales inmunizados con Tp0751 en el día 14 PC. El aumento de la infiltración de células B diferenciadas en lesiones primarias de animales inmunizados sugiere la producción local de anticuerpos específicos de Tp0751 secretados por estas células inmunes. Estos anticuerpos podrían ser inhibidores u opsónicos, facilitando así (1) la retención de T. pallidum en los sitios de la lesión primaria al inhibir la diseminación treponémica mediante el bloqueo de las interacciones patógenas mediadas por Tp0751 con la matriz extracelular y el endotelio o (2) la eliminación treponémica a través de la opsonofagocitosis, respectivamente. Es probable que estos dos mecanismos propuestos contribuyan a la protección observada contra T. pallidum difusión (Figura 5b), ya que se ha demostrado previamente que el suero específico de Tp0751 promueve la captación de T. pallidum por los macrófagos peritoneales de conejo e inhibe la adhesión de T. pallidum a la laminina. Las lesiones primarias de animales inmunizados también contenían niveles más altos de células dendríticas y linfocitos. Nuestros análisis no evaluaron la secreción de citocinas ni evaluaron el estado de activación o la actividad fagocítica de las células. Sin embargo, la abundancia relativa de estos tipos de células, junto con la protección parcial contra la diseminación observada en el estudio, sugiere que se montó una reacción inmune eficiente contra T. pallidum en el sitio de infección local. Tal reacción inmune requeriría la participación de los linfocitos para la producción de citocinas Th1 y la actividad fagocítica de los macrófagos residentes. También se observó un mayor número de neutrófilos en las lesiones primarias de los animales inmunizados con Tp0751. Curiosamente, los neutrófilos se asocian típicamente con un aumento de la ulceración de las lesiones primarias, pero todos los animales inmunizados mostraron niveles consistentemente más bajos de ulceración durante todo el experimento en comparación con los controles no inmunizados. Los neutrófilos son respondedores tempranos prominentes durante las infecciones bacterianas, pero no se sabe que medien la eliminación eficaz de T. pallidum. Por tanto, el aumento de la prevalencia de neutrófilos en las lesiones de animales inmunizados podría significar una localización eficaz de las células inmunitarias en el sitio de la infección que también contribuiría a la eliminación bacteriana. Además, las diferencias en la infiltración celular entre los animales inmunizados individuales pueden atribuirse parcialmente a la naturaleza exógena de este modelo animal. También es importante considerar que los análisis histológicos en este estudio se realizaron en un solo punto de tiempo y por lo tanto no representan necesariamente la naturaleza dinámica de la infiltración celular que ocurre en una lesión primaria. Este estudio muestra hallazgos prometedores con respecto a la efectividad de Tp0751 como candidata a vacuna contra la sífilis. Cabe señalar que en este estudio el poder estadístico es limitado debido al pequeño tamaño de la muestra (N = 2, control; N = 3, inmunizado), así como la naturaleza exógena del modelo animal de conejo. Sin embargo, los hallazgos de este estudio se pueden utilizar para informar los parámetros de investigaciones futuras que incluirán análisis de poder para determinar el tamaño de muestra adecuado. Aunque la inmunización con Tp0751 no dio como resultado una protección estéril dentro de los sitios de infección diseminada de los animales inmunizados, la protección estéril lograda en animales que recibieron ganglios linfáticos de animales inmunizados con Tp0751 es una indicación positiva de que optimizar la administración de la vacuna para lograr las dosis adecuadas de antígeno y adyuvante , podría resultar en inmunidad estéril en animales inmunizados. Además, en estos estudios futuros abordaremos si la vacunación con Tp0751 da como resultado una protección cruzada contra T. pallidum heterólogo .son. En particular, las secuencias de aminoácidos de Tp0751 son idénticas en todas las cepas de T. pallidum secuenciadas , lo que sugiere que esta proteína provocará una amplia capacidad protectora. FIGURA 4: Los animales inmunizados con Tp0751 tienen una mayor infiltración celular en las lesiones. Se evaluaron microscópicamente biopsias de lesiones de animales control (Ct, N = 2) e inmunizados (Im, N = 3) el día 14 PC para cuantificar (a) neutrófilos, (b) células dendríticas, (c) linfocitos y (d) diferenciados Células B de cinco campos de visión (FOV, × 400) utilizando dos secciones verticales por biopsia. Se muestra la mediana ± rango intercuartílico (IQR); los puntos individuales representan un campo de visión. (e) Se evaluó la composición del infiltrado celular total en las lesiones (media ± se) entre los animales de control (n = 6 muestras, 3 muestras por animal) y los animales inmunizados (n= 9 muestras) en todos los tipos de células (verde, linfocitos; púrpura, neutrófilos; rojo, células B diferenciadas; azul, células dendríticas) utilizando una prueba t de dos colas (*P<0,05). Los estudios futuros también incluirán probar la eficacia de una vacuna multicomponente que consiste en Tp0751 y TprK, otro candidato de vacuna contra la sífilis prometedor que juega un papel central en facilitar la evasión inmune de T. pallidum a través de la variación antigénica. Estudios previos han demostrado que los animales inmunizados con la porción N-terminal de TprK presentan un desarrollo de lesiones atenuado y cargas treponémicas más pequeñas en las lesiones primarias en comparación con los controles no inmunizados. Además, las células T exhiben reactividad a los epítopos que se encuentran en las regiones conservadas de TprK que pueden promover la secreción de citocinas Th1 por las células T para activar los macrófagos y facilitar el aclaramiento treponémico. La formulación de un cóctel de vacunas multicomponente utilizando estos dos antígenos protectores puede permitir una respuesta protectora de dos frentes contra el desarrollo de lesiones y la diseminación treponémica desde el sitio primario de infección. FIGURA 5: Resumen de hallazgos clave y mecanismos propuestos. (a) Resumen de hallazgos clave. La inmunización con Tp0751 promueve la infiltración celular en las lesiones primarias e inhibe la diseminación de T. pallidum a sitios de órganos distantes. La transferencia de ganglios linfáticos de animales inmunizados con Tp0751 a animales sin tratamiento previo no causa infección por T. pallidum, lo que confirma la inmunidad estéril. (b) mecanismo propuesto para la protección contra T. pallidum difusión conferidos por Tp0751 inmunización. Proponemos que la inmunización con Tp0751 induce la producción de anticuerpos específicos en las lesiones primarias, lo que facilita la eliminación de T. pallidum a través de la opsonofagocitosis de macrófagos. Los anticuerpos locales específicos de Tp0751 también inhibirían T. pallidum entrada del torrente sanguíneo al evitar la adhesión mediada por Tp0751 a los componentes de los vasos sanguíneos. En conjunto, estas reacciones evitarían que T. pallidum acceda al torrente sanguíneo y a los sitios de infección secundaria. La diseminación vascular es un componente clave de la patogénesis de T. pallidum y, por lo tanto, la identificación de los candidatos a vacunas involucrados en este proceso es fundamental para lograr una protección exitosa. La evaluación de la carga treponémica en el hígado, el hueso y el bazo usando qPCR reveló que la inmunización con Tp0751 inhibe la invasión de T. pallidum en sitios de tejidos distantes. Es importante destacar que la disminución más sustancial en la concentración de ADN de T. pallidum entre los animales inmunizados y los de control se observó en el bazo, un sitio altamente vascularizado que anteriormente se había demostrado que albergaba la mayor carga de T. pallidum durante la infección temprana. Investigaciones anteriores han implicado a Tp0751 en T. pallidum diseminación basada en interacciones con los componentes del huésped de la vasculatura, incluida la fibronectina, que se encuentra en la cara luminal del endotelio vascular, así como laminina y colágeno, ubicados en la porción subendotelial de la vasculatura. Además, Tp0751 es capaz de mediar la unión de las espiroquetas a las células endoteliales cuando se expresa heterólogamente por una cepa de Borrelia burgdorferi no infecciosa. Un análisis estructural reciente de Tp0751 ha revelado que el extremo C adopta un pliegue de lipocalina de barril β antiparalelo de ocho hebras y que las regiones proteicas localizadas en este pliegue son responsables de la interacción con los componentes de la matriz extracelular, mientras que una región más discreta del pliegue de lipocalina media la adhesión. a las células endoteliales. El pliegue de lipocalina Tp0751 es divergente entre esta familia de proteínas, pero comparte importantes similitudes estructurales con la proteína de evasión del complemento de Neisseria meningitidis, fHbp. Tp0751 y fHbp son lipocalinas lipidadas expuestas a la superficie que están implicadas en la patogénesis bacteriana y carecen de la bolsa de unión hidrófoba característica que se encuentra en la mayoría de las lipocalinas. Además, las regiones de unión al huésped ubicadas dentro de estas proteínas se mapean a lo largo de una sola cara del pliegue de la lipocalina. De particular relevancia para el estudio actual es el hecho de que la fHbp se identificó como una vacuna candidata prometedora para el serogrupo B meningocócico y actualmente forma parte de las vacunas contra la meningitis multicomponente 4CMenB (Bexsero) y rLP2086 (Trumenba). El rLP2086 se ha probado con éxito en siete estudios clínicos con más de 4000 sujetos humanos. Bexsero fue aprobado en 2013 por la Agencia Europea de Medicamentos para su uso en todos los grupos de edad, y Bexsero y Trumenba fueron aprobados en 2015 y 2014, respectivamente, por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos para su uso en personas de 10 a 25 años de edad. Los resultados presentados en nuestro estudio indican que el Tp0751 que contiene el dominio de lipocalina de T. pallidum es un candidato de vacuna prometedor, ya que la inmunización con esta proteína reduce significativamente la diseminación treponémica dentro del huésped (Figura 5a). La eliminación de la diseminación es un requisito fundamental para una vacuna contra la sífilis; Esto simultáneamente (1) reducirá la incidencia de la sífilis al prevenir la formación de las lesiones secundarias altamente infecciosas características de la sífilis, (2) eliminará las devastadoras consecuencias de las infecciones congénitas y (3) evitará la multitud de secuelas graves asociadas con la sífilis. incluyendo neurosífilis y sífilis ocular. Esta subunidad candidata a vacuna, que induce una protección estéril contra la infección por T. pallidum, puede ofrecer una solución oportuna a la creciente amenaza de sífilis que se observa en todo el mundo.