El Radioinmunoanálisis (RIA) y sus aplicaciones clínicas Lic. Olivia Brathwaite, T.M. Centro de Investigación en Reproducción Humana – Laboratorio de Andrología y Hormonas. 1.GENERALIDADES RIA: Descubierto en 1956 por Berson y Yalow. Definición: Inhibición competitiva de S por acción de T para unirse a R, donde: La sustancia a ser medida: S Molécula purificada de la misma especie que S (Trazador): T Molécula receptora o fijadora saturable: Sigue la ley de acción de las masas. R Principios del RIA Paso a paso: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Muestra con concentración desconocida de Hormona(S) Hormona marcada radioactivamente, cantidad conocida(T) Incubación con concentración constante de antisuero(R) Competencia o Saturación Equilibrio Separación de las fracciones libre y unida Lectura de radioactividad vs. Curva estándar SR S Curva patrón T T R R R TR S T T RRR TR SR TR S T T R R SR TR TR S TTT R S S ST TR S S T R + S + 2.DEFINICIONES 1. 2. 3. Becquerel (Bq): Unidad de radioactividad correspondiente a la rata de decaimiento de 1 x seg. (1Bq= 1 seg-1 = 2.7 x 10-9 Ci) Curie (Ci): Unidad de radioactividad , la actividad de decaimiento de una muestra a una rata de 2.7 x 1010 desintegraciones por seg. Vida media (t1/2): Tiempo requerido para que un dado número de radionúclidos en la muestra haya disminuído a la mitad de su valor original. 2.DEFINICIONES (cont) 1. 2. Isótopo: Núclido con el mismo número atómico, pero diferente número de masa atómica. Núclido: Un núcleo con un particular número atómico y número de masa atómica. 3. Problemas para la estandarización del RIA Reacción Cruzada Tipo de antisuero usado Composición del tracer Composición y pureza del estándar Composición de la muestra Condiciones del ensayo. 3a. Reacción cruzada Las moléculas tienen formas parecidas, Ej: LH y la hCG , Testosterona y dihydrotestosterona Las hormonas generalmente no tienen una única estructura química, ejemplo, las hormonas peptídicas (hCG, FSH, LH, TSH) pueden ser separadas en moléculas con estructuras algo diferentes y biológicamente activas. 3b. Tipo de antisuero usado Es un anticuerpo IgG, capaz de reaccionar con gran afinidad y especificidad con el antígeno a ser medido. Especificidad (Unión exclusiva) Afinidad (Fuerza de atracción) Título (Concentración óptima) 3c. Composición del Tracer Glicoproteínas: Gama emisores = 125I o 131I Hormonas esteroidales: Beta emisores = 14C o 3H Se marcan por oxidación Deben conservarse la actividad biológica e inmunológica 3d. Composición del Estándar Debe tener la misma inmunoreactividad que la molécula desconocida. Es aislado y purificado . Se debe tratar exactamente igual que el desconocido. 3e. Composición de la muestra Debe tener antigenicidad Cuando son moléculas pequeñas, actúan como haptenos, unidos a moléculas más grandes 3f. Condiciones del ensayo FUNDAMENTAL: Método capaz de separar rápida, completa y fácilmente el antígeno libre Separación neta Sencillez Reproducibilidad Libre de interferencias Poco tiempo FORMAS DE SEPARACIÓN Por segundo anticuerpo Muestra, Std o T + Primer anticuerpo Fracción Libre Segundo anticuerpo ºC Fracción Unida FORMAS DE SEPARACIÓN INMUNOADSORCIÓN RIA DE FASE SÓLIDA El anticuerpo está pegado al tubo + Muestra, Std o T ºC Decantas Lectura Formas de separación ADSORCIÓN + La fracción libre se adsorbe físicamente, pero no Inmunológicamente a un sólido inerte. Carbón-dextran, talco, sílice, Resinas, etc... Formas de separación Inmunoadsorción y doble anticuerpo MUESTRA, STD o T + Ac. Policlonal Incubación Decantado Lavado Ac Monoclonal pegado al tubo Sandwich EQUIPO NECESARIO 3H Beta = 14C Contador Gamma = 125I 131I Vidrería Puntas Micropipetas y Pipetas Agua Tubos LIBRES DE CONTAMINACIÓN!!!! Contador CONTROL DE CALIDAD EN RIA EXACTITUD PRECISION CV BIAS DRIFT DUPLICADOS CONTROL DE CALIDAD ERRORES Mal INTRA-ENSAYO pipeteo (Calibración, uso adecuado, mantenimiento,casarla con el usuario, usar la misma) Baja separación Error de conteo (Decaimiento del isótopo, NSB) Manejo de la muestra(Dilución, extracción, baja concentración del analito) CONTROL DE CALIDAD RIA ERRORES Mal INTER-ENSAYO estándar Muestras de control inapropiadas Deterioro del Tracer Daño del Sistema de Incubación Daño en el contador Cálculos PRECAUCIONES Conteo bajo Se manejan igual que un ácido cáustico o un carcinógeno Evitar contacto con la piel, ingestión No contaminar el equipo o vidrería GRACIAS