PLEGAMIENTO Y AGREGACIÓN ERRÓNEA DE LAS PROTEÍNAS Y SU RELACIÓN CON LAS ENFERMEDADES INTRODUCCIÓN A medida que la cadena polipeptídica va siendo sintetizada se produce el plegamiento de la cadena naciente. Si se calculan la cantidad de formas que podría adquirir una proteína en el espacio, esta estará determinada por la cantidad de aminoácidos que presente. Por ejemplo, una proteína que posean restos, podría plegarse en 8n conformaciones distintas. Este cálculo se hace en base a que, desde el punto de vista estereoquímico, son ocho los ángulos de enlace permitidos en la columna vertebral de la cadena polipeptídica. Sin embargo, cada proteína adopta una conformación única que denominaremos estado nativo, siendo ésta la forma de plegamiento más estable de la molécula. Para evitar un anormal plegamiento, la célula consta de dos procesos fundamentales. Uno de ellos se realiza a nivel molecular, mediante el cual la proteína se pliega a través de una vía que solo favorece unos pocos pasos intermedios. El otro consiste en un sistema celular que detecta e impide esta condición anómala. En este punto podríamos formularse la siguiente pregunta: ¿Dónde radica la información para que la proteína pueda adquirir su forma nativa? La clave para contestarla se encuentra en la secuencia de aminoácidos que componen la cadena polipeptídica. Este descubrimiento fue realizado gracias al estudio del plegamiento y desplegamiento in vitro de las proteínas. Debe resultarle sabido que ciertos factores rompen los enlaces no covalentes que estabilizan la conformación nativa de la proteína. El calor, los extremos de pH y ciertos agentes químicos figuran dentro de estos factores. Al proceso por el cual se altera la conformación compacta y la actividad de la proteína, quedando solo su estructura lineal, se lo denomina desnaturalización proteica. La mayoría de las proteínas desnaturalizadas precipitan cuando se encuentran en solución, debido a que sus grupos hidrófobos interactúan con regiones similares de otras moléculas no plegadas, formando así un agregado insoluble. La desnaturalización no es un proceso irreversible sino que generalmente es posible renaturalizar la proteína mediante la eliminación de los elementos desnaturalizantes. Para este propósito se realiza la diálisis, en donde vuelven a formarse todos los enlaces disulfuro, los puentes de Hidrógeno y todos aquellos enlaces no polares que estabilizan la conformación nativa. Dado que esta restauración no requiere cofactores u otras proteínas, al menos in vitro, el plegamiento funciona como un proceso de autoensamblaje. Siendo la secuencia de los aminoácidos la que determine la información necesaria para la adquisición de la forma nativa. En el camino hacia la adquisición de esta forma, la proteína adquiere configuraciones transitorias. Una de estas formas está representada por el estado de glóbulo fundido. 1. PLEGAMIENTO PROTEICO El principio clásico del plegamiento de una proteína radica en que la información necesaria para que esta adopte el la conformación tridimensional correcta, la proporciona su secuencia de aminoácidos. Este principio fue establecido por los experimentos de Cristian Anfinsen, quien demostró que la enzima ARNasa desnaturalizada puede in vitro volver a plegarse en una conformación activa espontáneamente. ACCION DE LAS CHAPERONAS: En un principio se pensó que el plegamiento de proteínas ocurría por un proceso de auto-ensamblaje que no requería de la presencia de ningún factor celular adicional. Sin embargo, estudios más recientes muestran que esto no es una buena descripción del plegamiento de proteínas ya que se puede afirmar que en el proceso existe la participación de otras proteínas. Las proteínas que facilitan el plegamiento de otras proteínas se llaman chaperonas, que es una proteína necesaria para el ensamblaje de los nucleosomas a partir de ADN y de las histonas. Las chaperonas actúan como catalizadores que facilitan el ensamblaje sin formar parte del complejo ensamblado. En concreto se cree que su función es unirse y estabilizar las cadenas polipeptidicas no plegadas o los intermediarios parcialmente plegados que se forman en la ruta que dirige al estado de plegamiento correcto. En ausencia de las chaperonas, las cadenas polipeptidicas no plegadas o parcialmente plegadas son inestables en la célula y con frecuencia se pliegan de forma incorrecta o se agregan formando complejos insolubles. La unión de las chaperonas estabiliza estas formas no plegadas y por tanto previenen el plegamiento incorrecto o formación de agregados y permite que la cadena polipeptidica adquiera una conformación activa. 1.1. PLEGAMIENTO ERRONEO DE LAS PROTEINAS: Todo tipo de estrés celular causa errores generalizados en el plegamiento, modificación o direccionamiento de las proteínas; cualquiera de estas alteraciones provocan su degradación en manos de la maquinaria del control de calidad. Sin embargo, es de suponer que un exceso de moléculas defectuosas en el interior de la célula anularía el sistema de eliminación de residuos y provocaría la acumulación de proteínas aberrantes en el retículo endoplasmático. Se piensa que la acumulación y agregación de proteínas mal plegadas son las responsables de trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer de aparición temprana, la enfermedad de Parkinson y las patologías priónicas, así como las cataratas de aparición temprana, la deficiencia de α1-antitripsina, la diabetes mellitus de tipo II y la amiloidosis sistémica. En todos estos trastornos, intervienen proteínas o fragmentos proteicos que convierten su conformación soluble normal en fi bras insolubles y pegajosas (amiloides). Como ocurre con el β-amiloide en el caso de la enfermedad de Alzheimer o la α-sinucleína en la enfermedad de Parkinson, estas proteínas se aglutinan para formar agregados fi brilares. Los agregados insolubles se forman en el interior y en el exterior celular. A diferencia de los amiloides que forman agregados, la mayoría de las enfermedades relacionadas con el plegamiento proteico están causadas, simplemente, por la degradación de la proteína mutante o por su ubicación errónea en el interior de la célula. Un gran número de estos trastornos, entre ellos la retinitis pigmentaria, lafibrosis quística, la diabetes insípida y algunas formas de hipercolesterolemia familiar, afectan a proteínas de membrana. En el caso de la hipercolesterolemia familiar, diversas mutaciones del receptor de la lipoproteína de baja densidad engendran un procesamiento defectuoso que atrae la atención del sistema de control de calidad, que luego marca al receptor para su degradación. La fibrosisquística se debe a mutaciones en el gen CFTR, codificador de un canal que transporta iones cloruro a través de la membrana celular externa. La mutación más frecuente es la desaparición del aminoácido en posición 508. Provoca la retención, mediada por chaperonas, en el retículo endoplasmático y la rápida proteólisis de la proteína CFTR incompletamente procesada (aunque operativa). Así, el canal no alcanza la membrana plasmática y, por tanto, la célula no puede regular el flujo de iones cloruro. Mecanismos similares explican casos de diabetes insípida nefrogénica (mutaciones en el gen que codifica el canal de agua acuaporina-2) y de retinitis pigmentaria (mutaciones en el gen de la rodopsina). Ante el número de enfermedades animales y humanas causadas por proteínas mal plegadas, se ha despertado el interés por desarrollar tratamientos correctores de este mecanismo patogénico. Las farmacoperonas, moléculas de tamaño limitado que penetran fácilmente en la célula, se unen a la proteína mutante y promueven su plegamiento correcto, parecen aplicables a todo el espectro de trastornos relacionados con el plegamiento proteico. Además, en nuestra opinión, compartida por otros expertos, presentan notables ventajas sobre vías terapéuticas conocidas. Los ensayos clínicos que utilizan farmacoperonas para el tratamiento del hipogonadismo hipogonadotrópico, la fibrosis quística o la deficiencia de α1-antitripsina empezarán pronto. Y es muy probable que otros compuestos con propiedades similares figuren en el futuro panorama del desarrollo farmacológico. I. PRIONES: Los priones son agregados supramoleculares (glicoproteínas) a celulares patógenas con plegamientos anómalos ricos en laminas beta y transmisibles. Se caracteriza por producir enfermedades que afectan el sistema nervioso central, denominadas encefalopatías espongiformes transmisibles. Los priones no son seres vivos la proteína se expresa en varios tejidos, principalmente en neuronas del SNC y se une a la membrana celular externa mediante la molécula de glicosilfosfatidil inositol (GPI). No se conoce en la actualidad como ocurre este cambio de estructura y como es q este cambio conduce a las encefalopatías espongiformes transmisibles. El prion o proteína priónica es una partícula a celular, patógena y transmisible que además posee la propiedad de desnaturalizar otras proteínas. Teorías más recientes sugieren que los priones son proteínas modificadas bajo circunstancias que favorecen a su caída a un nivel energético muy estable, confiriéndole nuevas propiedades biológicas, tales como ser insolubles, resultar inmunes a las proteasas y cambiar su configuración tridimensional. además cuentan entre sus propiedades las siguientes: No contiene ADN ni ARN Carece de cuerpos de inclusión Periodo de incubación prolongado(meses, años, décadas No ocasiona respuesta inflamatoria No genera respuesta antigénica Curso crónico progresivo Invisible al microscopio electrónico La falta de respuesta inmunitaria a las infecciones por priones no implica que estas proteínas eludan el sistema inmunológico, sino que por el contrario, lo utilizan en las etapas iniciales de acumulación y replicación priónica. Los últimos indicios al respecto apuntan a que los priones se acumulan y se replican, inicialmente en las células dendríticas foliculares (FDC) de los centros germinales y que las células B están implicadas en la neuroinvasion, fundamentalmente, mediante su participación en la maduración de las células dendríticas foliculares. 1. LA PROTEÍNA PRP CELULAR La forma PrPc es una proteína proteasa-sensible constituida por una sola cadena peptídica. Los datos espectroscópicos y las simulaciones por ordenador de F.E. Cohen indican que la forma PrPc presenta un empaquetamiento compacto con 4 hélices alfa (H1 a H4) y oligosacáridos complejos unidos a la proteína. PrPc posee una estructura en hélices alfa (42% hélices alfa, 3% láminas beta). PrP consta de 254 aminoácidos en ratones y hamsters y de 253 en el hombre. La proteína PrP está muy conservada en diversas especies, incluyendo humanos, ovejas, ratones, hamsters, Drosophila y bóvidos. Los residuos 113 hasta 128 son los más conservados. En su forma normal no infecciosa, PrP es una glicoproteína hidrofóbica soluble en presencia de cantidades significativas de solutos solubles no polares. PrPc se presenta como una proteína anclada a la superficie de las neuronas por medio de una molécula de GPI, y constituye un producto ampliamente expresado en las células. Los mRNA para PrP se han descubierto en diversos órganos, como bazo, músculo esquelético o pulmones. Pero, generalmente con índices de 10 a 50 veces inferiores que en el cerebro. En el SNC, PrP es esencialmente neuronal, situándose sobretodo en los botones sinápticos. Aún se desconoce la función que desempeña la PrP normal en las neuronas, pero su distribución hace sospechar que podría estar implicada en el proceso sináptico. Fuera del SNC, PrP se encuentra en los epitelios secretores, lo cual podría tener incidencia en la transmisión por vía oral. Según el trabajo de Borchelt et al., publicado en J.Biol.Chem [5] en 1992, PrPc es sintetizada en el RER, modificada en el aparato de Golgi y transportada a la superficie celular. Un péptido señal es escindido del extremo N-terminal durante la biosíntesis de PrP (en el RER) en ratones y hamsters. En hamsters, 23 aminoácidos son cortados del extremo C-terminal para la adicción de la molécula de GPI. Dos oligosacáridos se unen a nivel de residuos Asp situados en un lazo formado por la presencia de un puente disulfuro. En 1993, en un trabajo publicado en J. Biol Chem [41], Shyng et al. desvelan que chPrP, la homóloga en el pollo de la PrPc de los mamíferos, constituye ciclos entre la superficie celular y un compartimento endocítico, con un periodo de transición de aproximadamente 60 minutos. Alrededor del 95% de la proteína endocitada es retornada intacta a la superficie. Un pequeño porcentaje de las moléculas endocitadas sufren una rotura proteolítica tras la cual los fragmentos N y C-terminales son entonces expulsados. 2. LA PROTEÍNA PRP PATOGÉNICA A diferencia de la forma PrPc, la forma PrPsc presenta gran proporción de láminas beta (43% láminas beta, 30% hélices alfa). Propiedades que caracterizan a la forma patogénica de PrP: Resistencia parcial a las proteasas. En ocasiones se degrada y los fragmentos se agregan formando placas amiloides extracelulares. Purificada por centrifugación, al microscopio electrónico, presenta aspecto de fibrillas o bastoncillos. Estas agregaciones se denominan SAF (Scrapie Associated Fibrils or Prion Rods) y corresponden a polímeros de PrPsc. La proteína del prión (PrP) normal, tiene una secuencia de aminoácidos, (estructura primaria) idéntica a la proteína del prión patógena. La diferencia entre las dos recae en las estructuras secundarias y terciarias. Proteína normal del prión Proteína patógena del prión Proteína patógena infectando a una normal La proteína normal es muy rica en hélices alfa, la proteína patógena lo es en láminas beta. Estructura normal de la proteina del prión Forma infecciosa de la proteína del prión (PrP) ( PrPsc) Este cambio de configuración es crucial, ya que las proteínas con láminas beta son muy resistentes a las enzimas proteolíticas, al calor y no se disuelven en agua. Pero sobre todo, la proteína alterada tiene una característica única: interacciona con una molecula de proteína normal, le cambia la conformación y la hace capaz de convertir las estructuras de más proteínas normales. Ahí radica al parecer, el poder infectivo de los priones. 3. CONVERSIÓN DE PRPC EN PRPSC Ambas formas, PrPc y PrPsc, son codificadas por el gen PRP, pero no pueden ser el resultado de un procesamiento alternativo del mRNA, ya que en la mayoría de las especies estudiadas la secuencia codificadora para PrP (ORF) se halla contenida en un único exón. Diversos estudios han puesto de manifiesto que PrPsc es un derivado posttraduccional de PrPc. Esta hipótesis concuerda con el hecho de PrPsc se acumula lentamente en los cerebros de los animales infectados, a pesar de que los niveles de mRNA permanecen invariables durante la evolución de la enfermedad. El origen de la proteína PrPsc aún sigue constituyendo un misterio. Ya que los agentes infecciosos parecen estar compuestos en su totalidad o en gran parte por PrPsc, es importante determinar cómo y dónde tiene lugar la síntesis de PrPsc. O bien, equivalentemente, cómo y dónde adquiere PrPc o el precursor de PrPsc la resistencia a proteasas. Actualmente se investiga la posibilidad de tratar las ESET mediante farmacos que inhiban la conversión de PrPc en PrPsc. Ambas formas de PrP se han detectado en el aparato de Golgi, donde son modificados sus oligosacáridos y se adiciona ácido siálico. PrPc es transportada mediante vesículas secretoras hasta la membrana externa de la célula, donde la proteína queda anclada mediante una molécula de GPI. Para obtener evidencias definitivas acerca de si PrPsc se forma o no a partir de un precursor (similar a PrPc) de la superficie celular, B. Caughey y G.J. Raymond (1991), analizaron el efecto del tratamiento con PIPLC y tripsina. Previamente, en 1990, habían demostrado que PIPLC elimina la mayoría de las moléculas de PrPsen de la superficie celular, mientras que no afecta a PrPres. Luego, si PrPres se forma a partir de un precursor de la superficie celular PIPLC-sensible, como PrPsen, la eliminación de dicho precursor reduciría el número de precursores que llegan a madurar y por lo tanto, los niveles posteriores de PrPres. Los resultados cumplieron las expectativas: La cuantificación de los efectos del tratamiento con PIPLC mostró que el nivel de PrPres posterior es un 97% inferior en las células tratadas frente a las células control, mientras que el nivel total de PrP sólo es reducido en un 6%. Para justificar la conversión de PrPc en PrPsc se han propuesto diversas hipótesis: • Según la teoría pura del prion de Prusiner, habría una interacción directa entre una molécula de PrPc y una de PrPsc [32]. PrPsc induciría la conversión de PrPc en una segunda molécula de PrPsc, copia idéntica de la primera. Los heterodímeros actuarían como intermediarios de replicación en la síntesis de PrPsc. Sin embargo, aún no se han detectado agregados de PrPc-PrPsc. • También se ha propuesto que la modificación estructural podría ser el resultado de un proceso de polimerización en cadena, iniciado por la PrPsc inoculada que actuaría como cristal iniciador. El modelo de semilla o núcleo consta generalmente de 6 unidades de PrP [23]. • Aún se baraja la posibilidad de una modificación química post-traduccional. • También se contempla la posibilidad de la existencia de otros elementos ajenos a la proteína PrP que, en presencia de PrPsc, interferirían con PrPc induciendo su cambio conformacional. • En la teoría del holoprion de Weissmann [49], la conversión de PrPc en la forma patogénica PrPsc puede ser mediada por un holoprion o por la unión de un coprion a PrPc. La modificación implicaría alteraciones químicas o conformacionales. • Otros investigadores apoyan la intervención de chaperonas, las cuales modificarían el plegamiento de PrPc o de su precursor. PrPsc incluso podría ser la chaperona de PrP. 4. CONSECUENCIAS DEL MAL PLEGAMIENTO PROTEICO: Aproximadamente un 30% de las proteínas que se sintetizan en la célula no se pliegan correctamente y son degradadas por los mecanismos de control de calidad de la célula. Bajo condiciones de estrés el porcentaje de proteínas mal plegadas se incrementa Las proteínas incorrectamente plegadas pueden causar grandes daños a la célula al interaccionar con proteínas aún no plegadas o parcialmente plegadas formando agregados. Enfermedades que involucran un plegamiento incorrecto de proteínas son: Alzheimer, Parkinson, encefalopatía bovina espongiforme (BSE) o enfermedad de las vacas locas, diabetes tipo II, fibrosis quística, Huntington, fenilcetonuria, etc. Las proteínas mal plegadas pueden originarse por: Mutaciones o alteraciones en la región codificadora del DNA o RNA, Un error en la incorporación de aminoácidos durante la traducción La síntesis desigual de las subunidades individuales de una proteína oligomérica, A consecuencia del daño causado por pHs, temperaturas, fuerzas iónicas o condiciones redox anormales Mecanismos de defensa celulares frente a proteínas plegadas incorrectamente: – Reparación de proteínas dañadas por modificación covalente (p. ej. oxidación de residuos de cisteína). – Uso de chaperonas que evitan que las proteínas mal plegadas o parcialmente desplegadas formen agregados insolubles. – Marcaje de las proteínas mal plegadas para su degradación en los proteasomas. – Degradación por proteasas en los lisosomas de los agregados que se lleguen a formar. Rosario ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR PRIONES - En animales, las enfermedades más conocidas son: Encefalopatía espongiforme bovina (BSE), ("Vacas locas"). Scrapie (ovejas). Encefalopatía transmisible (visones). Enfermedades crónicas de desgaste (mulas, ciervos, alces). - Los humanos son susceptibles a varias enfermedades vinculadas a priones: Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD). Síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheiner (GSS). Kuru. Insomnio fatal familiar (FFI). Síndrome de Alpers. Anomalía proteica Extravío Trastorno Fibrosis quística Amiloidosis sistémica Diabetes insípida nefrogénica Cáncer Hipogonadismo hipogonadotrópico Retinitis pigmentaria Enfisema Deficiencia hepática de α1-antitripsina Proteína(s) responsable(s) CFTR (canal de iones cloruro) Fibrillas amiloides Acuaporina-2, receptor V-2 Supresor tumoral p53 Receptor de hormona liberadora de gonadotropina Rodopsina, receptores carotenoides α1-antitripsina α1-antitripsina Agregación Enfermedad de Alzheimer Enfermedad de Creutzfeldt-Jacob Encefalopatías espongiformes Anemia falciforme Enfermedad de Parkinson Cataratas Amiloide, proteína tau Amiloide Glicoproteína prion Hemoglobina α-sinucleína, parkina, ubiquitina C, proteínas del cristalino Proteínas del cristalino Negativo dominante Cardiomiopatía hipertrófica Troponina T ENFERMEDADES PRODUCIDAS POR PRIONES - En el ser humano: En el ser humano, las enfermedades por priones o encefalopatías espongiformes transmisibles pueden ser de origen esporádico (se desconoce el motivo por el que el prion adopta la conformación patológica), genético (por la presencia de una mutación en el gen que codifica la proteína priónica) o transmitido. Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ). Es la forma más frecuente; habitualmente se presenta de forma esporádica (un caso por cada millón de habitantes, aproximadamente) a partir de los 50-60 años de edad. También es transmisible debido a las malas prácticas quirúrgicas, por vía serológica y, antiguamente, por el empleo terapéutico de hormonas hipofisarias animales o de cadáveres humanos. Pero únicamente en un 10-15 por ciento de los casos el origen es genético. Insomnio familiar fatal. Trastorno del sueño habitualmente de origen genético, producido por una mutación N178D en la secuencia del PrP. Existen un escaso número de casos sin causa genética. Nueva variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. Transmitida. Se inició en Gran Bretaña en los años 90 (en el 1996 se publicaron los primeros casos) y se ha relacionado con la ingesta de productos procedentes de reses afectadas de la que, por esa razón, se denomina encefalopatía espongiforme bovina. Enfermedad de Gerstmann-Straüssler-Scheinker. De origen genético. Kuru. Transmitida. Restringida a poblaciones de Papúa Nueva Guinea y relacionada con prácticas caníbales. Se considera una enfermedad en extinción. - En especies animales : "Tembladera" o Scrapie (prurito lumbar) en ovejas. Encefalopatía espongiforme bovina (llamada enfermedad de las vacas locas). Otras (enfermedad caquectizante de alces, encefalopatía espongiforme felina, etc.). - En los microorganismos : También hay microorganismos que se ven afectados por priones. Es el caso del fenotipo PSI en la levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae). MODO DE TRANSMISIÓN Algunas enfermedades por priones humanos están vinculadas a factores mendelianos dominantes, debidas a mutaciones en el gen PrP, que se han observado en diferentes familias. Se ha observado transmisión iatrogénica (por medicamentos y tratamientos médicos) de CJD de un paciente a otros a través del uso de electrodos cerebrales, transplantes de córneas, injertos de duramadre o inyecciones de hormona del crecimiento. Hay evidencias de estudios in vivo e in vitro de que las proteínas normales pueden desencadenar cambios en la conformación de las proteínas del huésped, produciendo la enfermedad. En el caso de la enfermedad del Kuru se ha demostrado la transmisión por vía oral, por prácticas de canibalismo en Nueva Guinea. Desde 1950 no se observan nuevos casos al haber sido abolida esta práctica. La mayoría de las evidencias sugieren que no hay transmisión vertical (por herencia) de enfermedades por priones. La transmisión horizontal (por infección), a parte de los mecanismos de inoculación, no suele ocurrir en la inmensa mayoría de los casos. La transmisión por transfusión sanguínea no ha sido demostrada, sin embargo, algunos centros excluyen como donantes de sangre a personas que padecen de CJD. Hay diferencias genéticas entre proteínas/priones de diferentes especies que actúan como barreras para la transmisión. En situaciones experimentales se ha logrado la transmisión cruzada. GSS ha sido transmitida a monos y roedores por inoculación intracerebral. FFI puede ser transmitido a ratones por inoculación. BSE ha sido adquirida en el ganado bovino expuesto a Scrapie en alimentos, y en otros animales por inoculación. La encefalopatía espongiforme felina apareció por primera vez en 1990 y se atribuyó a transmisión oral de BSE a gatos. No se conoce con exactitud cómo la propagación de PrPsc daña las células. En cultivos celulares la conversión ocurre dentro de las neuronas, y la PrPsc se acumula en vesículas intracelulares conocidas como lisosomas. Éstas podrían reventar y dañar las células del cerebro. Lo más revolucionario en la teoría del profesor Prusiner es que los priones responsables de las encefalopatías espongiformes, son proteínas que todos, animales y humanos, afectados o no por la enfermedad transportamos en nuestro organismo. La única diferencia entre los priones sanos y enfermos es que, en estos, su estructura se pliega de forma distinta. Aún no se sabe cómo la proteína enferma contamina a la proteína normal cuando se acerca hasta ella. Se piensa que existen otros cofactores aún no identificados que podrían facilitar esta acción patológica. Incluso podría decirse que los priones enfermos fabrican camas o moldes a la medida de la enfermedad, moldes en los que "caen" los priones naturales para, posteriormente, aparecer con la estructura patológicamente modificada. Después de descubrirse que el Scrapie podría ser el resultado de la modificación del producto de un gen normal, fue posible explicar cómo una enfermedad genética, como la de CJ, podía transmitirse de un individuo a otro. Casi todos los genes presentes en el ser humano también lo están en otros mamíferos y, por lo tanto, hay una versión humana del PrP. Presumiblemente, si este gen humano sufre algún tipo de mutación, produciría una proteína PrPsc análoga a la proteína modificada de la oveja en cuanto a su actividad. La propagación del prión, está adscrita a la conversión de la PrPc a PrPsc bajo la influencia de ésta última. ESTUDIOS RELACIONADOS El análisis del DNA aislado de cierto número de pacientes humanos con CJD, reveló la presencia de mutaciones específicas en el gen que codifica PrP. En los últimos años, el análisis genético de la susceptibilidad a enfermedades causadas por priones depende de ratones sometidos a procesos particulares de ingeniería genética. Se han desarrollado dos tipos de ratones modificados: unos que carecen por completo del gen PrP (a los cuales se les denomina ratones "knock-out" de PrP) y otros que contienen una o más copias de la forma mutada del gen PrP humano (a los que se les da el nombre de ratones transgénicos PrP). Puesto que la proteína PrP se produce normalmente en el cerebro (y otros órganos de los ratones), podría esperarse que la ausencia del gen causara consecuencias terribles en el desarrollo de la conducta de ratones carentes de PrP. Sin embargo, a pesar de esta expectativa, los ratones "knockout" que carecen del gen PrP no muestran los efectos de la enfermedad. Hay varias explicaciones razonables para este resultado, incluyendo la posibilidad de que la función normal de la proteína PrP sea sustituída por otra proteína producida por un gen relacionado; en otras palabras, el ratón tiene un sistema "de respaldo" que puede dispensar a la proteína PrP. De cualquier manera, los ratones que carecen del gen PrP y por lo tanto no pueden sintetizar proteína PrPc, no desarrollan el Scrapie cuando se inyectan en su cerebro priones de ratones con Scrapie. Así pues, para que un ratón sea susceptible a la enfermedad, el animal debe ser capaz de producir la proteína PrP en sus propios genes; no es suficiente que se introduzca en su cuerpo la proteína anormal. Estos datos apoyan la hipótesis de que la proteína PrP es indispensable para la propagación del prión durante la infección. También se han efectuado estudios empleando ratones transgénicos, es decir, ratones sometidos a ingeniería genética para que sean portadores de genes extraños entre sus cromosomas. Cuando se transfiere a los ratones un gen PrP humano mutado, los animales transgénicos desarrollan el mismo tipo de enfermedad cerebral neuropatológica como la observada en el hombre. Este experimento demuestra que la presencia de un solo gen mutado, que codifica una sola proteína anormal, es suficiente para causar todos los síntomas que acompañan a la devastadora enfermedad neurológica. CONCLUSIONES Todas las enfermedades priónica han sido reproducidas en modelos murinos. Hay evidencias científicas e investigaciones múltiples en desarrollo que tratan de determinar si priones de otras proteínas intervienen en procesos neurodegenerativos como las enfermedades de Alzheimer, Parkinson, Huntington, Esclerosis lateral amiotróficas y otras. La proteína priónica normal (PrP) puede tener un lugar muy especial en el manejo de la cadena de eventos. PrPc es crucial para la propagación dentro del SNC, probablemente sea requerida también en sitios específicos del SNC. Si esto se confirma puede surgir una oportunidad para impedir la diseminación de priones y, por lo tanto, para la prevención secundaria de encefalopatías, después de la exposición a priones. Hay avances destacados en estos campos, lo cual hace vislumbrar medidas preventivas en un futuro cercano. El descubrimiento de que ratones carentes del gen funcional PrP no muestran anormalidades hasta una edad aproximada de 7 meses tiene implicaciones importantes. De todos modos, no está claro si la patología del Scrapie es debida a una reducción de la PrPc normal o por la acumulación de PrPsc en neuronas infectadas. El hecho de que los ratones puedan vivir normalmente durante al menos siete meses sin expresar PrPc va en contra de la hipótesis de la reducción de PrP, aunque son necesarias más observaciones para confirmarlo. La posibilidad de criar ratones carentes de PrPc nos permite estudiar la propuesta de que la PrPc es esencial no sólo para patologías asociadas a enfermedades semejantes a Scrapie sino también para la formación del agente infeccioso. Además, la disponibilidad de ratones PrP0/0 nos proporciona un mejor acercamiento al análisis de genes PrP mutados o extraños. La introducción de genes PrP exógenos en ratones PrP0/0 ya sea por apareamiento con ratones transgénicos o por inoculación directa del gen, permitirá estudiar el efecto de diferentes alelos mutantes y normales sin las interferencias de genes endógenos. ¿Deberían ser resistentes, los ratones carentes de PrPc, a la infección por Scrapie?. Si la prescindibilidad de estos genes es un fenómeno general, debería ser factible obtener ganado resistente a la enfermedad, una posibilidad interesante, no sólo para el manejo de animales sino también para productores y consumidores de productos derivados del ganado empleados para la fabricación de muchos productos biofarmacéuticos. Además, si las encefalopatías espongiformes son debidas a la acumulación de PrPsc, la terapia dirigida a la disminución de la síntesis de PrPc, nos proporcionará una mejora para retardar y mitigar la progresión de la enfermedad, especialmente en las formas familiares donde el tratamiento podría instituirse pronto. Aplicaciones clínicas de los priones: Un grupo de investigadores británicos descubrió en pruebas de laboratorio que la beta amiloide, el bloque que sirve como base para la formación de placas en el mal de Alzheimer, no se acumulaba cuando había niveles elevados de priones. En la variante del mal de Creutzfeldt-Jakob, la forma humana del mal de las vacas locas, priones infecciosos corrompen la versión normal de los priones en las células cerebrales y las obligan a cambiar de estructura, causando daños y la muerte. Aun hay pocos datos acerca de la función desempeñada por la PrP normal en las neuronas. Debido a su localización, se sospecha que podría estar implicada en los procesos sinápticos. CURIOSIDADES LOS PRIONES PUEDEN AYUDAR EN LA PERSISTENCIA DE LA MEMORIA Los priones, proteínas más conocidas por el rol “negativo” que desempeñan en la propagación de la enfermedad de las vacas locas, también pueden tener un papel positivo e importante en la persistencia de la memoria. Esta sugerencia tentativa es la conclusión de un estudio publicado el 5 de de febrero en la revista Cell y realizado por el Dr. Kausik Si del Instituto Stowers de Investigación Médica, ciudad de Kansas, Missouri, el premio Nobel Dr. Eric Kandel de la Facultad de Médicos y Cirujanos de la Universidad de Columbia, Nueva York, y colaboradores. Si dijo a la prensa que: “La persistencia de la memoria es un problema fundamental. Las experiencias son temporales; suceden una sola vez, pero de alguna manera deben conducir a cambios [en el cerebro] que son permanentes“. Estos cambios deben producirse a través de moléculas, incluyendo a las proteínas, dijo Si, pero queda una pregunta importante: “¿Cómo se puede mantener un estado estable con moléculas biológicas inestables?” En este último estudio, Si y sus colaboradores creen que pueden haber encontrado la clave en los priones. Los priones pueden adoptar dos estados, uno de los cuales es dominante y con características de autoperpetuación. Esto significa que una vez que una proteína entra en este estado puede transformar a otras proteínas no priónicas a su mismo estado: de ese modo una vez que el estado del prión se activa, se convierte en estable y autorrenovable. Para el estudio, Si y sus colegas se centraron en la babosa marina Aplysia, que los científicos han estado utilizando durante décadas en los experimentos relacionados con la memoria y el aprendizaje. Cuando usted toca las branquias de esta babosa marina, se retiran; y cuando “entrena” a los animales al mismo tiempo que les da una descarga, el reflejo de retracción se hace más fuerte hasta durante un mes. Los científicos ya habían descubierto que este comportamiento aprendido se producía a causa de un conjunto específico de neuronas sensoriales y motoras que responden a la serotonina. Pero en este estudio, Si y sus colegas prestaron atención a las proteínas que están alrededor de la sinapsis, en el punto donde se activa la serotonina: una de ellas era una proteína llamada CPEB (proteína de unión al elemento de poliadenilación citoplasmática). Al observar su estructura, la proteína se parecía a los priones que los científicos habían descubierto años atrás en la levadura, y que tenía funciones conocidas. En un estudio anterior, Si había informado que la proteína de la babosa no mostraba propiedades similares a las de un prión cuando estaba en la levadura; pero en este estudio, encontraron que las proteínas cambiaban a su estado de prion y se aglutinaban (comportamiento típico de los priones) en presencia de la serotonina, tal como lo hacían en las neuronas sensoriales de la Aplysia. Para confirmar esta idea, los investigadores utilizaron un anticuerpo para señalar la proteína del prión aglutinado y descubrieron que bloqueaba la persistencia de las conexiones neuronales que constituyen la base celular del aprendizaje y la memoria. Si y sus colegas dijeron que los hallazgos sugieren que la memoria puede depender de un mecanismo bastante único, que incluye la forma del prión de la CPEB. Esto se suma a un creciente grupo de evidencia de que los priones pueden tener un papel más amplio en la biología más que solamente causar enfermedades. El equipo llegó a la conclusión de que: “Estos resultados son consistentes con la idea de que la ApCPEB puede actuar como una proteína autosostenida en el sistema nervioso y por lo tanto podría permitir que el cambio en la eficacia sináptica dependiente de la actividad persista durante largos períodos de tiempo”. Sin embargo, Si advirtió que aún no han demostrado que el bloqueo de la capacidad de autoperpetuación de la CPEB en realidad obstruya la memoria. Para ello, tendrían que demostrar que una babosa con una forma mutante de la proteína aprende y luego olvida rápidamente. Los hallazgos ofrecen “por lo menos una idea” de cómo podría persistir la memoria, dijo Si, quien sospecha que la aparente función de las proteínas en la memoria puede llegar a ser un fenómeno más general. DETECCIÓN DE BIOMOLÉCULAS POR TÉCNICA DE ELECTROFORESIS INTRODUCCIÓN La electroforesis fue empleado por primera vez por en el año 1937, pero su importancia vino a incrementarse cuando en los años cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asigno a la separación de materiales en un campo eléctrico en presencia de algún tipo de soporte; aunque este término se limito originalmente al análisis de coloides y partículas submicroscópicas , se ha convertido en estos últimos años en una metodología aplicada a sustancias de bajo peso molecular. DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA: La técnica de electroforesis se basa en en el principio de la migración de los iones cuando se somete a un campo eléctrico: los iones positivos tiendes a migrar al cátodo y los negativos al ánodo .Se puede realizar sobre diversos soportes, pero cuando se utiliza como técnica de separación y análisis de fragmento de biomoleculas (ADN y también de proteínas),uno de los soportes que ofrece mejor resultados por su resolución es el gel de agarosa(un heteropolisacarido extraído de las algas rojas).El protocolo experimental es el siguiente: 1.Se polimeriza el gel de agarosa en un molde que permite la formación de una especie de muescas o pocillos en su parte superior y a continuación se coloca a modo de lamina entre dos placas de vidrio, con las muescas hacia arriba, que se sitúan a su vez, entre la cubeta superior e inferior . 2. En cada muesca de la parte superior del gel se aplica con una micro pipeta una muestra diferente, que contiene los fragmentos de ADN (o proteína) que se desea separar, disuelta en una solución tampón. 3. A continuación se añade a cada muestra una pequeña cantidad de glicerol para que adquiera mayor densidad y no se mezcle con la solución tampón de la cubeta superior. También se le añade un colorante de localización, como el azul de bromo etanol, que se desplaza más rápidamente que el fragmento de ADN más veloz .Cuando este colorante se aproxima al extremo inferior del gel es la señal para detener la electroforesis 4. Las cubetas superior e inferior contienen una solución de electrolitos tamponada en las que se colocan los electrodos: en la cubeta superior, el cátodo y en la inferior, el ánodo. *Cubetas: La cubeta consiste en una cámara que contiene los electrodos de carga opuesta, situados en dos receptáculos que se conectan por un puente salino cuya función es permitir el paso de la corriente. Éste puente es el mismo medio de soporte,impreganado de tampón y en contacto con los receptáculos, a través de la cual pasara la corriente provocando la migración de las partículas en función de la carga eléctrica que posean. La cubeta se encuentra tapada, para minimizar la evaporación del tampón y en ocasiones refrigerado, para evitar el calentamiento producido en el proceso. 5.Entre ellas se hace pasar una corriente continua de unos 100V durante un tiempo suficiente para que se produzca la separación de las diferentes fracciones de ADN de cada muestra, que lo harán en función de su carga neta, y de su tamaño: en conjunto definen un parámetro que es característico de cada fragmento ,denominado movilidad electroforética (u).Los grupos fosfato de ADN suelen estar desprotonados ,por lo que adquiere carga neta negativa y migraran hacia el ánodo .Evidentemente, los fragmentos con mas carga neta negativa se moverán más de prisa hacia el ánodo ,pero si son voluminosos verán frenado su movimiento por el retículo formado por el gel, que se comporta como una criba molecular 6. Al cabo de un tiempo, la mezcla de fragmentos del ADN se ha separado en bandas que se pueden identificar y poner de manifiesto si tenemos la lamina de agarosa con colorantes fluorescentes, como el bromuro de etidio, que hace visible las bandas bajo la luz ultravioleta 7. La movilidad electroforética de los distintos fragmentos de ADN, medida en milímetros recorridos por cada fragmento de ADN en gel, es proporcional a su tamaño, medido en pares de bases. FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL DESARROLLO ELECTROFORETICO: Los principales parámetros que afectan en el desarrollo de la electroforesis y que condiciona su utilidad en el laboratorio, son básicamente: La carga neta de la sustancia en migración La fuerza iónica del medio La estructura y el tamaño de la sustancia El potencial del campo eléctrico utilizado durante el proceso El soporte utilizado La intensidad y características generales de la corriente eléctrica aplicada El revelado CARGA NETA DE LA SUSTANCIA EN MIGRACION El grado de ionización y, por lo tanto, la carga neta de las distintas sustancias de la muestra sometida a electroforesis, depende del PH del medio en el que se lleva a cabo todo el proceso. A su vez, este parámetro queda determinado por el tampón elegido, que permite fijar el PH más adecuado en cada caso La influencia del PH sobre la carga neta es especialmente importante ya que hay sustancias que, dado su carácter anfótero(es el caso de las proteínas), pueden encontrarse cargadas positiva o negativamente. Se define punto isoeléctrico como, aquel valor de PH al cual el balance de cargas positivas y negativas superficiales de una sustancia es cero (carga neta nula).Al PH de su punto isoeléctrico, una sustancia no presenta carga neta alguna y, por tanto, al ser sometida a un proceso electroforético no migra (permanece inmóvil en el punto de aplicación) Cuando el PH es superior al pi, la sustancia se encuentra cargada negativamente (el numero de cargas negativas supera al de positivas) y, sometida a una electroforesis migrara hacia el polo positivo –ánodo-. Cuando el PH del medio es inferior al de su punto isoeléctrico, la sustancia –cargada positivamente-se dirigirá hacia el cátodo –polo negativo-. FUERZA IONICA DEL MEDIO Al igual que el PH final, la fuerza iónica depende del tampón elegido para la electroforesis. En un proceso electroforético, la corriente eléctrica es transportada por todos los iones presentes, tanto los debidos a la muestra en solución, como los del tampón utilizado. Cuanto más concentrado se encuentra el tampón, mayor es la proporción de corriente transportada por los iones del tampón y menor la transportada por la muestra que se desea separar, de manera que esta ultima migrara más despacio. ESTRUCTURA Y TAMAÑO DE LA SUSTANCIA Aunque estos factores no influyen por igual en todos los procesos electroforéticos, en ocasiones son de gran importancia .Tal es el caso de aquellas electroforesis en las que el soporte elegido permite el paso selectivo de las moléculas en función de su tamaño (retiene las partículas más grandes y deja pasar las de menor tamaño) POTENCIAL DEL CAMPO ELECTRICO APLICADO Como hemos visto anteriormente, la movilidad electroforética de una sustancia es mayor cuanto mayor es el potencial eléctrico aplicado. No obstante, recurrir a un gran aumento de voltaje para acelerar el proceso electroforético presenta el inconveniente de que se presenta un aumento de temperatura, que, a su vez, es el responsable de: -Alteraciones debidas al calor, de la muestra sometida a electroforesis (ej.: cuando se trata de proteínas plasmáticas se produce desnaturalización por el calor) -Evaporación del tampón utilizado Como consecuencia de la evaporación, el tampón queda más concentrado, aumenta su fuerza iónica y se dificulta el desarrollo electroforético. SOPORTE En general, una electroforesis puede realizarse directamente en una solución tamponada de la sustancia que se desea separar (electroforesis libre) ,o puede hacerse sobre un soporte de manera que una vez terminado el proceso, las fracciones quedan permanentemente separadas y sea fácil proceder su cuantificación (electroforesis zonal) La electroforesis zonal se usa ampliamente en el laboratio clínico. Los soportes más comúnmente utilizados son: Acetato de celulosa Gel de agarosa Gel de almidón Gel de acrilamida CARACTERISTICAS GENERALES DE LA CORRIENTE APLICADA El voltaje aplicado durante la electroforesis influye de forma decisiva en el resultado obtenido. En general, cuanto mayor sea el voltaje aplicado, mejor es la resolución obtenida. No obstante, el calor generado durante el desarrollo electroforético, provoca la evaporación de parte del agua contenida en e l soporte y puede deteriorar la muestra. Los voltajes a los que habrá que trabajar en una electroforesis estarán limitados por el exceso de calentamiento que puede tener lugar. En el caso de una electroforesis convencional sobre gel de agarosa, esto no representa REVELADO El revelado tiene por objeto la localización, para su posterior evaluación, de las distintas fracciones en que ha sido separada la muestra. Esto normalmente se consigue mediante la tinción de los componentes que se deseen visualizar. Previamente a este paso, es importante para el proceso de difusión que se produce en el soporte, lo cual se consigue con distintos métodos nada más concluir el proceso electroforético y retirar el soporte de la cámara (ejemplo: desnaturalización en el caso de proteínas) El colorante empleado dependerá del compuesto que tratemos de localizar .Se pretende que las distintas fracciones fijen el colorante, quedando así teñidas y listas para la evaluación, cualitativa o cuantitativa. Se emplean colorantes que tiñen cualquier compuesto, o colorantes más específicos, basados en la presencia de determinados grupos químicos sobre las moléculas (ninhidrina para grupos amino);o basado en reacciones enzimáticas (NADH para deshidrogenasas)o bien en componentes de la molécula(negro SUSTANCIA Proteínas sudan B para lipoproteínas) COLORANTE Ponceau S,Negro amido,Azul brillante de Coomasie Lipoproteínas Negro Sudan B Glicoproteínas PAS(Acido peryodico-Schiff) Enzimas Deshidrogenasas NADH(fluorescencia) Esterasas Esteres de b-Naftol Fosfatasas a-Naftilfosfato FUNDAMENTOS DE LA ELECTROFORESIS La electroforesis es un método de separación de especies distintas basado en el diferente comportamiento de estas especies bajo la influencia de un campo eléctrico aplicado. Se dan bajo ciertas circunstancias que fundamentan su acción como por ejemplo: La carga neta de una mezcla de moléculas ionizadas en un campo eléctrico experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo, las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el catado (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo) Las separaciones entre moléculas se basan en las diferencias en la relación cargatamaño entre los diferentes analíticos presentes en la muestra; cuanto mayor sea la relación más rápido migrara el ion en el seno del campo eléctrico. Para iones del mismo tamaño, el de mayor carga eléctrica migrara más rápidamente. Para iones con la misma carga migrara mas aquel de menor tamaño, ya que tendrá una fuerza de retardo por rozamiento de menor valor .La resistencia del medio al paso del ion también influirá en su movilidad electroforética, siendo esta menor cuanto mayor sea la viscosidad del medio. En este movimiento de moléculas se presentan fuerzas adicionales como la fricción existente entre el soluto con las moléculas del solvente creando una fuerza que se opone a la dirección del movimiento de la molécula originado por el campo eléctrico y como el movimiento browniano (en forma aleatoria) también llamado de difusión que sigue La ley de Fick siendo dependiente de la energía cinética de cada molécula que como se sabe dicha energía se relaciona directamente con la temperatura. El voltaje no se hace ajeno a esto, pues al incrementarlo indiscriminadamente generara un excesivo calor .En cambio, al aplicar bajo voltaje puede ocurrir una pobre separación, por causa de la difusión por tiempo muy prolongado de la corrida electroforética. TIPOS: ELECTROFORESIS CONVENCIONAL: La electroforesis ha sido utilizada durante muchos años para separar especies complejas de elevado peso molecular de interés químico y biológico. Las separaciones se llevan a cabo sobre una capa delgada y plana, una placa de un gel semisólido y poroso que contiene un tampón acuoso en el interior de sus poros. Esta sustancia será la encargada de ofrecer resistencia al movimiento de moléculas y controlando así su migración uniforme. Mediante esta técnica se pueden separar varias muestras simultáneamente. Dichas muestras se depositan sobre el gel, se aplica un potencial de corriente continua a través del mismo durante un tiempo fijo. Cuando las separaciones se han completado se interrumpe el paso de corriente y las especies separadas se tiñen para visualizarse. La electroforesis en gel es muy utilizada en la detección, control de pureza, caracterización, cuantificación (por comparación con controles) así como preparación y purificación (por extracción de bandas desde el gel) de moléculas y fragmentos de DNA y RNA. Para realizar la electroforesis se utiliza un medio de migración adecuado, de modo que la separación sea eficiente, ya que se necesita que exista una suficiente fuerza de rozamiento para que las moléculas de distinto tamaño se separen. Para ello se utiliza un gel que consiste en una red compuesta por un polímero orgánico (en este caso usamos agarosa, derivado de un polisacárido de un alga) y que aumenta considerablemente la fricción, impidiendo a la vez la difusión de las moléculas a través del medio acuoso en todas las direcciones. Al colocar las muestras de DNA a través de este gel y someterlo a un campo eléctrico durante cierto tiempo, podemos verlas separadas según su tamaño. La rapidez con que migren las moléculas puede ser regulada por la concentración de agarosa disuelta en buffer que usemos: a mayor concentración, mayor compactación de la red y por tanto menor velocidad de migración. La concentración que elijamos dependerá de lo que se quiera separar en cada corrida. Para la corrida de proteínas, el proceso es diferente. Se suele utilizar una solución de poliacrilamida como gel y además las proteínas deben ser tratadas con SDS (detergente), que permite mantener constante el cociente carga/masa ya que las cargas netas de las proteínas nativas sí dependen de su secuencia. El SDS desnaturaliza y recubre los polipéptidos, aportando carga negativa de forma proporcional al tamaño de éstos. De esta manera, las proteínas tratadas con SDS migran hacia el ánodo, al igual que los ácidos nucleicos. Los geles que se emplean son geles tridimensionales de polímeros ramificados que tienen los espacios entre ramificación rellenos de líquido. Las redes de polímeros no solo reprimen la convección sino que también actúan como cribas que pueden retardar y hasta bloquear la migración de los analitos poliméricos más grandes. En cambio los iones pequeños pueden moverse libremente a través de la estructura porosa del gel. De este modo la electroforesis en gel tiene dos mecanismos de separación: electroforesis, que separa por la relación carga/tamaño y tamizado, que separa mayormente por tamaño. Los geles más comunes son agarosa y poliacrilamida. Primeramente se necesita el gel (los más usados son agarosa y gel de poliacrilamida) quien es el filtro que se encarga de separar, tiene una estructura prosa con muchos agujeros. Es químicamente inerte y de propiedades uniformes. Gel de poliacrilamida. Permite la separación con arreglo a la carga neta de la partícula y al tamaño de esta. Cuando transcurre el proceso electroforético, las partículas comienzan a migrar en función de su carga eléctrica, pero son frenadas en su migración según su tamaño si éste es mayor que el tamaño del poro del gel en el que se realiza el proceso. Como resultado de estos fenómenos, se consiguen separaciones más completas, y mayor cantidad de bandas en el espectro electroforético. Los geles se pueden emplear en tubo o en placas, y en su fabricación puede prepararse como una composición homogénea( el mismo tamaño del poro) a lo largo de todo el gel, o bien en lo que se llama gradientes, se consiguen distintos tamaños de poro a lo largo de este, bien continuos( el tamaño varia de una forma gradual) o discontinuos( el tamaño del poro varia en distintas zonas bien diferenciadas, se suelen emplear para introducir fases en el proceso, como por ejemplo, una primera fase de concentración. Gel de agarosa. La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas, como el agaragar, pero de composición homogénea), que gracias a su poder de gelificación y propiedades físico-químicas, lo han convertido en el soporte más común para electroforesis en el área de Biología Molecular. La poliacrilamida es un polímero formado a partir de acrilamida y N,N´ metilenbisacrilamida. La concentración de ambos reactivos define el grado de reticulación del gel. Este gel está constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas, se usa usualmente para separar moléculas grandes de alrededor 20.000 nucleótidos. Al tener baja temperatura de fusión, permite la incorporación de soluciones proteicas (anticuerpos, por ejemplo) en el proceso de preparación, empleándose como medio de soporte en gran cantidad de técnicas inmunoquimicas. La aplicación de la muestra se puede hacer poniendo el suero en pocillos excavados en gel, o bien diluyendo el suero en gel y aplicándolo en esta forma. Se necesita una cantidad de suero muy pequeña y el tiempo de electroforesis es corto. *Ventajas: - Mayor resolución - Ausencia de efectos cromatográficos (como puede ser la absorción y el intercambio Iónico - No reacciona químicamente con la muestra analizada. - Transparencia completa ELECTROFORESIS CAPILAR: Esta técnica alternativa de la electroforesis convencional y surge debido a que la velocidad de separación y resolución de los compuestos mejora a medida que aumenta el campo eléctrico aplicado, lo cual, no permite aumentar el potencial. , esto se debe a que el calentamiento de joule aumenta hasta afectar la calidad de separación. Por lo tanto ésta se realiza en un tubo capilar de sílice con un diámetro inferior a 0.1mm y una longitud de 50cm a 1m, relleno de un tampón, que también contiene los electrodos de platino. La introducción se lleva a cabo por uno de los extremos y la detección en el otro.. El mecanismo de separación está basado en las relaciones carga/masa de los analitos. Su utilidad está en la separación de proteínas y péptidos entre otras sustancias. Una de las ventajas de la electroforesis capilar es su capacidad de separar macromoléculas de interés en la industria biotecnológica y en la investigación biológica y bioquímica, y además en esta técnica se le puede aplicar altos voltajes reduciendo el tiempo de análisis y altas eficiencias. INSTRUMENTACION • Equipo: automatización • Condiciones eléctricas: V; 10-30 kV, E: 100-1000 V/cm, I: 100-200 Μa • Capilar (sílice fundida): d.i. 25-100 μm, largo: 30-100 cm d.i. 50-200 μm, largo 10-25 cm • Muestra: 1- 50 nL (pmoles de muestra) • Buffer: microlitros • Detección: UV-Vis, MS, Fluorescencia, Refractometría, Conductimetría Como se muestra en la Figura, la instrumentación para la electroforesis capilar es sencilla. Un capilar de sílice fundida que este relleno de un tampón, conecta entre sí dos recipientes que contienen el mismo tampón, que también contienen los electrodos de platino. La introducción de la muestra se lleva a cabo por uno de los extremos, y la detección en el otro extremo. El sentido de la polaridad de la fuente de alimentación de alto voltaje puede ser el indicado, o bien el contrario para lograr una rápida separación de los aniones. Aunque la instrumentación es conceptualmente sencilla, hay dificultades experimentales significativas en la introducción de la muestra y en la detección, debido a que los volúmenes implicados son muy pequeños. Puesto que el volumen de un capilar normal es de 4 a 5 -L, los volúmenes de inyección y detección deben ser del orden de unos pocos nanolitros, o menores. Características de EC *RAPIDEZ *ALTAS EFICACIAS *PEQUEÑOS VOLÚMENES DE MUESTRA (nanolitros) *AMPLIO RANGO DE APLICACIONES (Modos de EC) *AUTOMATIZACIÓN *DETECCIÓN EN LÍNEA (“on column”= en el propio capilar). MÉTODOS DE LA SEPARACIÓN DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR: Electroforesis capilar en zona o en disolución libre (CZE) Es el procedimiento de electroforesis más habitual, en el cual el capilar es recorrido por el electrolito a través de un medio buffer que puede ser ácido (fosfato o citrato), básico (borato), o anfótero (carácter ácido y básico). El flujo electro osmótico crece con el pH del medio electroforético. Electroforesis capilar electrocinética micelar (MEKC) En esta variante del procedimiento anterior se añade a la fase móvil un compuesto catiónico o aniónico para formar micelas cargadas. Estas pequeñísimas gotitas inmiscibles con la disolución retienen a los compuestos neutros de un modo más o menos eficaz, por afinidad hidrófila-hidrófoba. Se puede utilizar este tipo de electroforesis para moléculas que tienen tendencia a migrar sin separación, como es el caso de algunos enantiomeros. Electroforesis capilar en gel (CGE) Esta es la transposición de la electroforesis en gel de poliacrilamida o de agarosa. El capilar está relleno con un electrolito que contiene al gel. Se produce un efecto de filtración que ralentiza a las grandes moléculas y que minimiza los fenómenos de convección o de difusión. Los oligonucleótidos, poco frágiles, se pueden separar de este modo. Isoelectroenfoque capilar (CIEF) Esta técnica, también conocida como electroforesis en soporte, consiste en crear un gradiente de pH lineal en un capilar con pared tratada que contiene un anfótero. Cada compuesto migra y se enfoca al pH que tenga igual valor que su punto isoeléctrico (al pI su carga neta es nula). Seguidamente, bajo el efecto de una presión hidrostática y manteniendo el campo eléctrico, se desplazan las especies separadas hacia el detector. Las altas eficiencias obtenidas con este procedimiento permiten separar péptidos con que apenas difieren entre sí 0.02 unidades de pH. Isotacoforesis capilar En la isotacoforesis capilar (CITP) las bandas de todos los analitos migran, finalmente, a la misma velocidad; por eso recibe este nombre de iso, igual, y taco, velocidad. En cualquier aplicación concreta, bien los cationes o bien los aniones pueden ser separados, pero no ambos al mismo tiempo. En una separación, la muestra se inyecta entre dos tampones; el frontal, que contiene los iones de mayor movilidad y el terminal en el que van los iones de menor movilidad que los iones de la muestra. APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS: En Proteína Debido a que las proteínas no tienen una estructura predecible como los ácidos nucleicos, sus velocidades de migración no son similares entre ellas, es mas, es muy posible que al aplicar una fuerza electromotriz dichas proteínas no migren (al encontrarse en su punto isoeléctrico), para poder realizar la migración es necesario que las proteínas se desnaturalicen, ello se logra aplicando un detergente como el dodecilsulfato sódico / dodecilfosfato sódico (SDS/SDP). Estas sustancias son agentes reductores que actúan rompiendo los enlaces disulfuro, separando de esta manera a las proteínas en sus subunidades y además les otorgan una carga negativa que les permite migrar a través del gel en dirección directa a su tamaño, ya que la cantidad de cargas que se unen a las proteínas dependen del tamaño de estas, existiendo una relación carga/masa similar. Además la desnaturalización hace que pierdan su estructura terciaria dando como resultado una mayor velocidad de migración debido a que ahora dicha velocidad depende netamente de su tamaño y no de su estructura. Estos procedimientos son útiles para poder realizar exámenes a proteínas relacionadas con el diagnóstico de algunas enfermedades como es por ejemplo la neurocisticercosis. ADEMÁS LA ELECTROFORESISEN PROTEINAS NOS PERMITIRAN: Análisis del grado de pureza de una proteína Identificación de proteínas inmunoprecipitadas Determinación de su peso molecular. Verificación de la concentración de proteínas. Detección de proteólisis En ADN La técnica de separación de moléculas de ADN, se da gracias a que estas moléculas presentan cargas eléctricas que varían y puede deberse a que las moléculas de ADN normalmente presentan plegamientos por fuerzas no covalentes. En el proceso de electroforesis de ácidos nucleicos la dirección de migración se da del ánodo al cátodo, el motivo de esta dirección de migración se da debido a la carga negativa que presenta el esqueleto AZÚCAR-FOSFATO. En los fragmentos de ADN dobles ( moléculas con estructura de cadena de doble hélice ) la velocidad de migración se da de manera proporcional a su tamaño, ahora en fragmentos simples de ADN (esto es fragmentos con una sola cadena de ADN ) y ARN, la velocidad de migración es menor debido a que estas moléculas tienden a realizar plegamientos de formas complejas razón por la cual la migración de estas moléculas se hace más complicada y a una velocidad de migración menor, esto según la forma de estructura terciaria que dichas moléculas pueden adoptar tras el plegamiento, sin embargo, hay compuestos que tienen la propiedad de desplegar las moléculas antes mencionadas debido a la ruptura de enlaces no covalentes como son los puentes de hidrogeno o las fuerzas de Van Der Waalls, etc. Tenemos por ejemplo el hidróxido de sodio o la formamida, estos compuestos al permitir el despliegue de moléculas grandes, permiten que la velocidad de migración se de únicamente por el tamaño de la molécula y no por la estructura formada tras el plegamiento, este tipo de separación permite notar semejanzas entre cadenas de ADN de dos individuos diferentes y se usa con fines legales en la determinación de parentescos entre dos individuos, incluso esta técnica que emplea ADN tiene aplicaciones criminalísticas en medicina forense, por ejemplo: En una escena de asesinato, en donde hay muestras de forcejeo, los forenses tienen esta herramienta para excluir sospechosos en base a muestras de ADN tomadas de la escena del crimen, que pueden ser obtenidas de manchas de sangre, cabellos, hasta fragmentos de prendas de vestir rotas durante el contacto físico en el momento que se da el crimen; Además de este uso de electroforesis del ADN tiene grandes aplicaciones en la medicina tradicional, gracias a esta técnica se puede saber acerca de aberraciones en algunos genes que pueden dar como resultado anemias, hemoglobinopatías, talasemias, etc. Permite notar semejanzas entre cadenas de ADN de dos individuos diferentes. Aplicaciones Clínicas Detección de ciertos antígenos relacionados con el diagnostico de ciertas enfermedades Se usa en exámenes como ELISA. Es aplicado en la prueba de inmunoelectrotransferencia., mejor conocido como “WESTERN BLOT” SONDAS DE PROTEÍNAS ANTICUERPOS PARA INTRODUCCIÓN: Los estudios acerca de la expresión y función génica requieren no solo de detección de ADN y ARN, sino también de proteínas específicas. En dichos estudios los anticuerpos ocupan el lugar de las sondas de ácidos nucleicos como reactantes que interaccionan de modo selectivo con moléculas proteínicas. Ahora pasaremos a explicar dos de las técnicas más importantes sobre este tema. INMUNOTRANSFERENCIA: WESTERN BLOTTING A. DEFINICIÓN: El western blotting es una técnica que se utiliza para identificar y localizar proteínas con base en su capacidad para unirse a anticuerpos específicos. El término “blotting” hace referencia a la transferencia de macromoléculas biológicas desde un gel hasta una membrana y su posterior detección en la superficie de la misma. Este proceso es necesario ya que todas estas macromoléculas están embebidas dentro de la matriz que forma el gel, lo que imposibilita realizar su detección, mientras que en la membrana, se encuentran accesibles al estar adheridas sobre la superficie de la misma. Descripción de la técnica A) Separar las proteínas: Las proteínas se someten a desnaturalización a través de su incubación con un detergente iónico (sulfato de dodecilo sódico o SDS) a 100°C, seguida por electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE). Debido a que el detergente cubre de manera uniforme a todas las proteínas, negativizando la carga de la superficie de la proteína, las proteínas migran dentro del campo eléctrico con base en la Transferencia de membrana cantidad de moléculas de SDS unidas a ellas, cantidad que depende a su vez del tamaño de la proteína. Al cabo de la corrida obtendremos un patrón de bandas que dependerá del número de proteínas presentes en la muestra y de su tamaño. Por lo tanto este método separa proteínas conforme a su peso molecular. B) Colocar una membrana de nitrocelulosa en el gel: Posteriormente las proteínas se transfieren de modo Dirección del Blotting electroforético a una pieza de papel filtro (nylon o nitrocelulosa) al cual se adherirán a través de interacciones no polares. Luego de poner en íntimo contacto el gel con una membrana de nitrocelulosa o PVC, los colocaremos en un aparato para que se produzca una electrotransferencia de las bandas de proteína del gel a la membrana. En ese proceso se logra una transferencia cuantitativa, manteniendo además el mismo patrón del gel. C) Diferenciación de proteínas: Se revelan por el agregado de un anticuerpo específico. De esta forma se visualizarán las bandas de proteínas y se podrá calcular la concentración de cada una en la muestra original. Recuerden que el uso de anticuerpos le otorga a la reacción una especificidad que de otro modo no tiene. Por otra parte, los anticuerpos pueden usarse para revelar antígenos presentes directamente en muestras de células o tejidos mediante las técnicas conocidas como inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa. -Incubar la membrana de la nitrocelulosa con un anticuerpo primario. -Incubar la membrana de la nitrocelulosa con un anticuerpo secundario. D) Para ver realmente la enzima en acción, se necesitara incubarla en una mezcla de la reacción que sea específica para tu enzima. E) Poner la película de radiografía en gel, para detectar un flash de la luz, que es emitida por la enzima Como muchas proteínas funcionales están compuestas de dos o más subunidades, los polipéptidos individuales se separan por electroforesis en presencia del detergente dodecilsulfato de sodio, que desnaturaliza las proteínas. Después de la electroforesis, las proteínas se detectan comúnmente por tratamiento con azul de coomasie o solución de colorante de plata. Sin embargo, los polipéptidos separados en el gel son transferidos a una membrana de nitrocelulosa, y las proteínas individuales pueden ser detectadas usando anticuerpos específicos. Esta transferencia de proteínas de geles de poliacrilamidas a membranas de nitrocelulosa y se realiza usando una corriente eléctrica. Después de la transferencia, la proteína de interés específica se identifica colocando la membrana con las proteínas inmovilizadas en una solución que contiene un anticuerpo para la proteína. Los anticuerpos no unidos se eliminan luego de la membrana por lavado, y la presencia del anticuerpo primario se detecta colocando la membrana en una solución que contiene un anticuerpo secundario. Este anticuerpo secundario reacciona con las inmunoglobulinas (el grupo de proteínas que contienen todos los anticuerpos) en general. El anticuerpo secundario se conjuga ya sea con un isótopo radiactivo o una enzima que produce un producto visible cuando se agrega el sustrato adecuado. Fundamento La técnica del Western Blot (también llamado “inmunoblotting” debido a que se utilizan anticuerpos para detectar el antígeno o los antígenos específicos de interés) es una técnica que nos permite detectar la presencia de una proteína en un homogeneizado o extracto de tejido. El verbo blot en inglés significa manchar con tinta y el nombre Western (oeste, occidental) le fue dado por el investigador W. Neal Burnette (Analytical Biochemistry, 112:195-203, 1981) como un juego de palabras por los nombres Southern y Northern de las técnicas que se usan con el mismo fin pero se aplican a los ácidos nucleicos. Todo empezó cuando Edwin Southern diseñó la técnica, que lleva su nombre, para detectar ADN, luego por oposición al punto cardinal Sur, se llamó Northen aplicada al ARN. Finalmente como una especie de broma la técnica de inmunoblotting (inmunotransferencia) para proteínas terminó siendo denominada Western. Actualmente es una técnica de rutina en todos los laboratorios que realizan análisis de proteínas. La transferencia Western, denominada así por su semejanza superficial con la técnica analítica para ácidos nucleicos a la que se llama Southern. Puede utilizarse, por ejemplo, para estudio de la fragmentación posterior a la traducción de las proteínas que, a menudo, se produce como parte del proceso de maduración proteica. En esta técnica, se analizan las proteínas que reaccionan con anticuerpo en la mezcla separando primero las proteínas de dicha mezcla mediante una electroforesis en gel desnaturalizante. La especificidad de la unión antígeno – anticuerpo permite la detección de una única proteína dentro de una mezcla compleja de otras proteínas. Aplicaciones En la medicina diagnóstica de las enfermedades virales (SIDA) El Western Blot es una de las técnicas de mayor uso en el diagnóstico de infección por el virus HIV aunque no se trata de una aplicación única, se la usa en diagnóstico clínico y en investigación. Este ensayo también permite determinar el peso molecular de una proteína y medir la concentración relativa de una proteína en una muestra. Por ejemplo para el caso de las infecciones con el virus HIV es una de las técnicas usuales para detectar la presencia de anticuerpos circulantes contra las proteínas del virus que es una indicación muy fuerte de que la persona se encuentra infectada por este virus. Debido a lo complejo que es este virus desde el punto de vista de su composición proteica es de esperar que una persona infectada tenga circulando en su sangre anticuerpos contra las proteínas glicosiladas o no señaladas en la partícula viral o virión. El test del Western blot para el virus HIV se basa en la presencia de anticuerpos contra las proteínas virales mencionadas. Para ello: Primero: a partir del virus purificado y tratado adecuadamente se puede correr un gel de proteínas (PAGE) en el que aparecerán las bandas correspondientes a las proteínas del virus como se ve en el control positivo. Western blot de varios sueros de pacientes. La primera tira muestra un control positivo, se observa además de las proteínas del virus una gp 160 que no forma parte del virus pero sí de las proteínas que aparecen durante el ciclo infectivo. La tira con el número 27 es un control negativo. El resto de las muestras tienen bandas virales. Segundo: la membrana se incuba (se pone en contacto), por ejemplo sumergiéndola, con una solución diluida del suero de una persona que se sospecha que pueda estar infectada. Luego de un tiempo, los anticuerpos contra las proteínas del virus van a reaccionar produciéndose la unión antígeno-anticuerpo, para verlos se hace luego un lavado de la tira, si los anticuerpos no están pegados se van con el lavado, los pegados quedan. Por último para revelar la presencia de la unión específica antígeno-anticuerpo un método eficaz es el método indirecto del esquema de revelado de las proteínas en un Western Blot. Supongamos que P1, P2 y P3 son proteínas del virus HIV a las que se les pegó el anticuerpo respectivo presente en el suero del paciente. Para revelar la presencia de ese complejo lo que se hace es incubar con un segundo anticuerpo que está dirigido contra la IgG humana. Ya que si inoculamos inmunoglobulina humana (IgG) en un conejo, el animal va a fabricar anticuerpos contra ella, a la que se va a unir si se los incuba juntos. Pero estos anticuerpos fabricados en el conejo se pueden marcar o con un colorante o con un fluorocromo de modo que expuestos a la luz permitirá visualizar la presencia original de la proteína del virus presente en el suero. IgG antihumano P1 P2 Suero paciente P3 Esquema de revelado de las proteínas en un Western blot. En el diagnóstico serológico de la infección por Tripanosoma cruzi La Enfermedad de Chagas es una infección causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi. En el hombre esta infección puede ser congénita o adquirida y afecta principalmente el corazón y tubo digestivo. El Western blot es una técnica que se utiliza para la detección de anticuerpos contra antígenos de T. cruzi. Para ello se hizo un estudio en el cual se utilizó un extracto soluble de antígeno a partir de epimastigotes de T. cruzi cepa Tulahuén. Se estudiaron 269 muestras, de las cuales 110 pertenecieron a pacientes con la infección confirmada serológicamente, 100 muestras de donantes de sangre seronegativos, 37 muestras de pacientes con otras parasitosis y 22 muestras de pacientes con patologías no parasitarias. El WB tuvo una sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y negativo, y concordancia del 100%. De acuerdo a estos resultados se pudo concluir que el uso de esta, mejorará el diagnóstico de laboratorio serológico de la infección por T.Cruzi. Especifica los anticuerpos relacionados con la enfermedad de Lyme Western blot especifica los anticuerpos relacionados con la enfermedad de Lyme que están presentes en el sistema sanguíneo y es usado rutinariamente para confirmar, o en algunos casos para contradecir los resultados positivos de Elisa. Un examen positivo de Elisa seguido por uno negativo de Western blot usualmente indica que la enfermedad de Lyme no existe. De todas maneras, el Lyme sin ser acompañado por la evidencia de los síntomas. La practica de los exámenes Elisa y Western blot es considerada una de las combinaciones mas confiables actualmente disponibles En el diagnostico de la cisticercosis Recientes avances en la purificación de antígenos han permitido mejorar la eficiencia de las técnicas inmunológicas o adaptar otras como la inmunotransferencia (EITB o Western blot) para el diagnostico de la cisticercosis. Considerando las limitaciones tecnológicas, la carencia de una técnica serológica sensitiva y especifica y el elevado costo de los exámenes radiológicos en nuestro medio, se estandarizo la técnica del Wester blot para el diagnostico de neurocisticercosis, utilizando como fuente de antígenos el fluido vesicular de la larva de taenia solium. Los cisticercos fueron obtenidos de cerdos naturalmente infectados; la preparación de antígenos, la electroforesis, la transferencia y el revelado enzimático se realizaron de acuerdo a la descripción original de la técnica. Se encontraron nueve bandas que corresponden a componentes antigénicos del fluido vesicular de la larva de T.solium. Con pesos moleculares de 42, 35, 31, 24, 23, 18, 17, 14 y 13 kDa. Dos sueros de pacientes con hidatidosis y el suero de un paciente con fascioliasis reaccionaron con la banda de 42 kDa; ninguno de los sueros de pacientes con himenolepiasis o de individuos sanos reacciono con los antígenos de fluido vesicular. La sensibilidad de la técnica de Wester Blot con antígenos de fluido vesicular de T.solium fue de 91%; y la especificidad mediada como respuesta negativa en ocho bandad especificas, de 100%.La prueba de Wester blot con antígenos de fluido vesicular puede constituir una buena alternativa para el diagnostico de la neurocisticercosis en zonas endémicas y de ser utilidad en estudios epidemiológicos, debido a su eficacia, fácil implementación y bajo costo. Para el diagnóstico de brucelosis humana; la técnica de Western Blot utilizando proteínas totales de Brucella melitensis como antígeno, ofrece un test alternativo para el diagnóstico de brucelosis humana, logrando una sensibilidad del 90%. En la identificación de inmunógenos de Fasciola hepatica; el análisis de Western Blot se emplea en la identificación de inmunógenos de Fasciola hepatica, reconocidos por los sueros de ratas infectadas experimentalmente. Por lo tanto, este método nos permite encontrar en una mezcla compleja, esta técnica es muy utilizada para detectar la presencia de anticuerpos en pacientes cuando hay indicios de una infección viral, en estos casos el antígeno es conocido y se analiza si el paciente tiene anticuerpos contra ese antígeno, como desventajas de este método se podrían señalar su complejidad y costo. INMUNOPRECIPITACIÓN: ELISA DEFINICIÓN: Es una técnica de inmunoprecipitación se da cuando la reacción Antígeno - Anticuerpo a determinadas condiciones, el complejo formado se inestabiliza y precipita, de tal forma que el precipitado formado es fácilmente detectable y cuantificable. La técnica de Elisa es una técnica de inmunoprecipitación pero a la vez es una técnica inmunoenzimática ya que se basa en el uso de antígenos y anticuerpos marcados con una enzima que al añadírsele un sustrato se observará un color fácilmente detectable y cuantificable. La técnica ELISA (“Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay” Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) consiste en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido espectofotométricamente. El procedimiento más común se realiza en una placa de 96 pocillos sobre la que se fijan los anticuerpos de interés. Al añadir la muestra que contiene el antígeno complementario se produce una unión que se puede detectar mediante la adición de un segundo anticuerpo contra el mismo antígeno, éste marcado con una enzima que al añadirle un sustrato se hidroliza dando una reacción de color. La intensidad del color es directamente proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra analizada. Descripción de la técnica Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes: 1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno. 2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas. 3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno. 4. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todas las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría. FUNDAMENTO El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoabsorbente) la reacción antígenoanticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro. Tipos de ensayos ELISA Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificación de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución (por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales) o la determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuación se describen los más comunes. a) ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado). b) ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de antígenos. c) ELISA sándwich (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo. Aplicaciones Tiene gran versatilidad en campos como la Parasitología, Bacteriología, Micología, Virología, Toxicología, etc., es fácil deducir la gran importancia de estas técnicas y sus enormes posibilidades de aplicación sobre todo en Patología Animal y Vegetal en los que gracias a estas técnicas se pueden estudiar grandes poblaciones en un corto plazo y de manera sencilla, rutinaria y sin instalaciones costosas. Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isótopos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc. Ahora veamos detenidamente algunas enfermedades detectadas por esta técnica: A.- Identificación (Screening) de enfermedades infecciosas - Hepatitis C: Prevalencia de anticuerpos VHC - Vibro cholerae: Prevalencia del antígeno Iga Anti-Lipopolisacárido - VIH: Prevalencia del antígeno p24 del VIH-1 - Herpes: Presencia del anticuerpo anti IgG - Mycobacterium tuberculosis: Presencia del anticuerpo anti IgG - Sífilis: Presencia del anticuerpo anti IgG - Papilloma Virus: Presencia de anticuerpos anti-VPH - Toxoplasmosis: Presencia del anticuerpo anti IgG y anti IgM - Salmonella: Presencia de antígenos O y los antígenos H - Shigella: Presencia del anticuerpo anti IgG - Malaria: Presencia del anticuerpo anti IgG - Peste porcina clásica: Presencia del anticuerpo anti IgG B.- Otras aplicaciones - Cuantificación de hormonas: gonadotropina, progesterona, testosterona, Hormonas tiroideas, etc. - Cuantificación de inmunoglobulinas: IgG, IgE, IgA HIBRIDACIÓN IN SITU CON FLUORESCENCIA O FISH CONVENCIONAL INTRODUCCIÓN LAS TÉCNICAS PARA MANIPULAR EL DNA LA HIBRIDACIÓN: Localización de segmentos específicos de DNA Antes de que un fragmento determinado de DNA o de mRNA se pueda escindir, secuenciar o manipular de cualquier otro modo previamente debe localizarse. Los cromosomas incluso los de las células eucariontes más simples, contienen una cantidad enorme de DNA, por lo que localizar un fragmento específico es como tratar de encontrar la proverbial aguja en un pajar. Sin embargo, hay una técnica por la que se pueden localizar fragmentos con relativa facilidad: La HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS. Esta técnica aprovecha las propiedades de apareamiento de las bases de DNA y del RNA. Si el DNA se somete a una temperatura alta (90 a 100 °C) ó a un pH muy alto, los Puentes de Hidrógeno que mantienen unidas a las dos cadenas se rompen, las cadenas se separan y se pierde la estructura tridimensional característica de la molécula; por eso se dice que se ha DESNATURALIZADO. Cuando se mezclan (Incuban en condiciones adecuadas: 65°C) DNA desnaturalizados de dos muestras diferentes, cualesquiera dos cadenas que posean secuencias total o parcialmente complementarias que se encuentren por azar formaran una doble hélice híbrida. El grado y la velocidad con que se reasocian los fragmentos de las dos muestras indica la similitud entre sus secuencias de nucleótidos. Mediante el uso de esta propiedad se pueden localizar secuencias de DNA con sondas moleculares. Estas sondas son fragmentos cortos de DNA o de RNA de cadena simple, por lo general marcados radiactivamente. Puede tratarse de mRNA, oligonucleótidos sintéticos o cDNA (DNA complementario). Veáse: CAMPBELL.REECE. Biología.7ma Edic. Pág 399 Veáse: COOPER. La Célula.3ra Edic. Pág 117 Para localizar y aislar entre varias colonias de bacterias a la portadora de DNA que contenga el gen de interés, se puede realizar un procedimiento. Primero se realiza una réplica de las colonias previamente transformadas mediante contacto con un filtro de nitrocelulosa o nailon. Luego se tratan las bacterias para que las células liberen su DNA. Las bacterias mueren, el DNA se desnaturaliza y se fija el filtro, el cual se expone a una sonda radiactiva de secuencia complementaria aparte o a todo el fragmento de interés. Se permite que la sonda hibride con cualquier DNA complementario y se elimina todo el ácido nucleico que no haya hibridado. La localización de las moléculas de cadena doble que se hayan formado se detecta por la técnica de autorradiografía. Las réplicas de colonias que estén marcadas con la sonda radiactiva después de este tratamiento identifican a las colonias originales que contenían vectores con el fragmento de DNA que se desea estudiar. Esta técnica se denomina: HIBRIDACIÓN DE COLONIAS. Veáse: CURTIS.BARNES.SCHNECK Biología.7ma Edic. Pág 274 Otra técnica que utiliza la hibridación, para identificar fragmentos específicos de DNA – por ejemplo, fragmentos de DNA cromosómico – es la TRANSFERENCIA DE SOUTHERN (Southern blotting). Fue la primera técnica que se diseñó, conocida también con el nombre de: Southern Blot o Inmunotransferencia de southern, en honor a su creador el biólogo molecular EDWIN M. SOUTHERN, quien la ideó, y no del significado de esta palabra en ingles:”del sur”. El DNA se corta primero con una o más enzimas de restricción y los fragmentos resultantes se separan por tamaño en un gel por acción del campo eléctrico (electroforesis). Veáse: CURTIS.BARNES.SCHNECK Biología.7ma Edic. Pág 275 Una vez separados los fragmentos se localizan aquellos que contienen una secuencia complementaria a una sonda radiactiva y se purifican para ser estudiados o manipulados. Permite detectar la presencia de un alelo determinado en el genoma de un individuo, lo cual puede aplicarse también al diagnóstico prenatal de enfermedades genéticas. Veáse: CURTIS.BARNES.SCHNECK Biología.7ma Edic. Pág 275 Veáse: LODISH.BERK.DARNELL. Biología Celular y Molecular.5ta Edic. Pág 376 Veáse: COOPER. La Célula.3ra Edic. Pág 118 Veáse: CAMPBELL.REECE. Biología.7ma Edic. Pág 399 Un método de identificación análogo recibió el nombre de TRANSFERENCIA DE NORTHERN o NORTHERN BLOT o INMUNOTRANSFERENCIA NORTHERN (en este caso no se trata de ningún investigador, sino que hace referencia a su significado en inglés: “del norte”). Se utiliza para identificar moléculas de RNA separadas por Electroforesis En Gel, transferidas a un filtro e hibridadas con la sonda correspondiente. También se utiliza para evaluar la expresión de un gen determinado en distintos tipos celulares o en diferentes momentos del desarrollo. Veáse: LODISH.BERK.DARNELL. Biología Celular y Molecular.5ta Edic. Pág 377 También hay una técnica que permite localizar las secuencias específicas de DNA o RNA en células y tejidos mediante el uso de sondas de ácidos nucleicos. Se trata de la HIBRIDACIÓN IN SITU. Las sondas, que pueden estar marcadas con un colorante fluorescente, se usan, por ejemplo para localizar una secuencia determinada en un cromosoma. Esta técnica recibe el nombre de FISH (Fluorescence In Situ Hybridization). El método de HIBRIDACIÓN IN SITU también sirve para detectar moléculas de RNA específicas en células de distintos tejidos y conocer, de esta manera, qué genes se expresan en esos tejidos y no en otros. Veáse: COOPER. La Célula.3ra Edic. Pág 119 Veáse: CURTIS.BARNES.SCHNECK Biología.7ma Edic. Pág 275 Descripción de la técnica El primer paso de la técnica consiste en la desnaturalización del DNA para separar la doble hélice. A la muestra desnaturalizada se le añade entonces la sonda de interés (fragmento de ADN marcado fluorescentemente). Primero, las sondas hibridan a regiones específicas. Después, se tiñen los núcleos con un color de contraste inespecífico (generalmente DAPI). Las sondas de DNA pueden marcarse con moléculas fluorescentes (método directo) o no fluorescentes que se detectan con anticuerpos fluorescentes (método indirecto). La técnica FISH puede realizarse a los cromosomas en metafase o en interfase. En metafase se utiliza para detectar microdeleciones específicas, translocaciones o para identificar material extra de origen desconocido. Los tipos de sondas usadas son cósmidos,satélites alfas y sondas completas (painting probes). Los cósmidos son secuencias únicas que hibridan con fragmentos pequeños. Se emplean en estudios de microdeleciones. Las sondas satélites están formadas por secuencias altamente repetidas que se encuentran cerca de lo centrómeros. En la mayoría de los casos son específicas de cada cromosoma. Se usan para determinar aneuploidias o para identificar el origen de cromosomas marcadores. No siempre es posible tener núcleos fijados en metafase para realizar el FISH. Normalmente, cuando se fija una célula sin tratar el núcleo se encuentra en interfase, con los cromosomas descondensados. A pesar de ello, es posible relizar el FISH aunque los resultados obtenidos no sean tan específicos. Se emplea sobre todo para la detección de aneuploidias o grandes deleciones, duplicaciones o translocaciones en células fetales o tumorales. Además del FISH múltiple, está el FISH en hebra y el FISH inverso. Fundamento FISH o Hibridación Fluorescente In Situ, es una técnica de marcado de cromosomas en la que se provoca que los cromosomas específicos brillen bajo el microscopio. Esta técnica permite la rápida determinación de aneuploidía, la ausencia del cromosoma completo o la presencia de un cromosoma adicional, así como la adjudicación de un marcador genético a un cromosoma (cartografía genética). Los cromosomas que son usualmente utilizados con FISH son los 13, 18, 21, X e Y; sin embargo, como son posibles marcados adicionales del cromosoma, otros cromosomas pueden ser visualizados con esta técnica. FISH usa segmentos de una única hebra de ADN que son tintados, o etiquetados, con una sustancia fluorescente que puede ligarse a un cromosoma específico; estos segmentos de ADN son llamados sondas. La técnica de múltiple FISH (M-FISH) o Hibridación In Situ Con Fluorescencia de todos los cromosomas se utiliza en el mundo desde hace 5 años y ha causado revuelo por la introducción de colores en la citogenética tradicionalmente gris. La visión de los cromosomas al microscopio es un logro mayor del año 1956, cuando por primera vez: Tjio y Levan obtuvieron una preparación metafásica de cromosomas humanos a partir del cultivo de fibroblastos de pulmón de un mortinato. En los años siguientes se perfeccionaron las técnicas para obtener cromosomas en diversas muestras, tales como sangre, médula ósea, trofoblasto, líquido amniótico y distintos tumores sólidos, así como también las técnicas que tiñen ciertos componentes de los cromosomas, dando patrones de bandas diferenciales que permiten no sólo la identificación individual de cada cromosoma, sino también evaluar la integridad microscópica de su estructura. Los bandeos más comúnmente utilizados son el bandeo Q con quinacrina, el bandeo G con tripsina y Giemsa y el bandeo R de reverso (del G) y bandeo C de la heterocromatina constitutiva. En la década 1980-90 se desarrolló la citogenética molecular que se considera una revolución al descubrir alteraciones submicroscópicas con sondas específicas de segmentos cromosómicos, de centrómeros o telómeros, también detectan fusiones específicas de regiones cromosómicas comprometidas en translocaciones conocidas, que permiten resolver preguntas, incluso a veces en ausencia de metafases, observando las señales en núcleos interfásicos. Desde 1996, el cariotipo multicolor y la diferenciación simultánea por colores de todos los cromosomas humanos definido por dos técnicas principales, SKY y M-FISH, que se diferencian en el análisis que utilizan para las marcaciones combinatoriales y la exposición secuencial a través de filtros específicos para los diversos fluorocromos (tinciones fluorescentes), se revela como una estrategia complementaria, útil y bonita (científica y literalmente), coadyuvante al diagnóstico citogenético de anomalías complejas, de tanta trascendencia en muchas oportunidades. Se necesitan sólo cinco fluorocromos (con capacidad combinatorial de 31) para distinguir los 24 cromosomas, por hibridación de juegos de sondas de ADN cromosoma-específicas, cada uno es marcado diferencialmente y se le atribuye luego un color falso que lo identifica. Los procesos automatizados de análisis corrigen la imagen geométrica, calculan el delineamiento de cada cromosoma con una tinción general de ADN con DAPI (4’-6-diamidino-2phenilindole), calculan y sustraen el trasfondo de cada fluorocromo considerando un valor umbral, visualizan el material que hibrida con cada sonda cromosómica haciendo posible la asignación individual, crean una imagen compuesta de valores grises que codifica a cada cromosoma y presentan los resultados finales con la asignación de un pseudocolor a cada uno de estos valores grises, permitiendo asimismo un pronto resultado. Comunicamos algunos casos citogenéticos estudiados con esta técnica y analizamos brevemente el significado de la contribución de su información al diagnóstico. Nuestros datos apoyan que la técnica de hibridación in situ con fluorescencia múltiple (M-FISH) puede tener una amplia utilidad clínica y complementar la citogenética tradicional en cariotipos complejos. Aplicaciones del FISH convencional A menudo los padres de los niños con un retraso en el desarrollo quieren saber más sobre las condiciones de sus hijos antes de decidir tener otro hijo. Estas preocupaciones pueden abordarse mediante el análisis de los padres y el ADN del niño. En los casos en que el retraso del desarrollo del niño no se entiende, la causa de que se pueda determinar mediante FISH y técnicas citogenéticas. Algunos ejemplos de enfermedades que se diagnostican mediante FISH incluyen el Síndrome de Prader-Willi, el síndrome de Angelman, síndrome de deleción 22q13, leucemia mielógena crónica, Leucemia Linfoblástica aguda, Cri-du-chat, Síndrome Velocardiofacial, y Síndrome de Down. FISH en espermatozoides está indicado para hombres con un cariotipo somático o meiótico anormal, así como aquellos con oligozoospermia, ya que aproximadamente el 50% de los hombres oligozoospérmicos presenta una mayor tasa de anomalías cromosómicas del esperma. El análisis de los cromosomas 21 y X, y Y es suficiente para identificar a las personas en situación de riesgo oligozoospérmicos. En medicina, los peces pueden ser utilizados para formar un diagnóstico, para evaluar el pronóstico, o para evaluar la remisión de una enfermedad, como el cáncer. El tratamiento puede adaptarse específicamente. Un examen tradicionales, e incluye análisis de los cromosomas en metafase es a menudo incapaz de identificar las características que distinguen a una enfermedad de otro, debido a sutiles características cromosómicas; FISH puede aclarar estas diferencias. Los peces también se pueden utilizar para detectar las células enfermas con más facilidad que los métodos citogenéticos estándar, que requieren las células en división y requiere trabajo y preparación manual que requiere mucho tiempo y el análisis de las diapositivas por un técnico. FISH, por su parte, no requiere de células vivas y se puede cuantificar de forma automática, una computadora cuenta los puntos presentes fluorescentes. Sin embargo, un técnico capacitado es necesario para distinguir las diferencias sutiles en los patrones de bandas en los cromosomas metafásicos doblados y retorcidos. BIBLIOGRAFÍA Alberts B, A Johson, J Lewis, M Raff, K Robertss y P Walter: Biología Molecular de la Célula. 4ta Edic. Editorial OMEGA.España.2002 Cooper,G: La Célula. 3ra Edic. Editorial MARBAN. España.2002 Lodish H, A Berk, L Zipursky, P Matsudaria y J Darnell: Biologia Celular Y Molecular.4ta Edic. EDITORIAL MÉDICA PANAMERICANA.España.2006 Campbell, Reece: Biología. 7ma Edic. EDITORIAL MÉDICA PANAMERICANA. Buenos Aires - Argentina.2007 Curtis.Barnes.Schnek.Massarini: Biología. 7ma Edic. EDITORIAL MÉDICA PANAMERICANA. Buenos Aires - Argentina.2008 Karp G.: Biologia Celular y Molecular. 5ta Edic. Editorial Mc Graw Hill. México D. 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Desarrollo y evaluación de las técnicas de Western blot y ELISA para el diagnóstico serológico de la infección por Trypanosoma cruzi en Chile REFERENCIAS EN INTERNET: http://www.marsopa.es/page3/assets/Tema6C.pdf http://www.monografias.com/trabajos13/sepal/sepal.shtml http://aquiugr.googlepages.com/cromatografiayafines.pdf http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/ap quim-an-instr-14/skoog/30.html http://www.cultek.com/index.asp?p=Soluciones-ELISA-Principal www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/elisa.htm www.medmol.es/tecnica.cfm?id=28