DETERMINACI´ÓN D E Q U I S T E S D E Giardia lamblia Y O O Q U I S T E S D E Cryptospordium parvum E N E L A G U A P O T A B L E D E CIUDAD OBREGÓN, S O N O R A , MÉXICO Tesis presentada por: E V A E S P E R A N Z A L E Y V A MICHEL Presentada ante la Dirección Académica de la Universidad Virtual del Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey como requisito parcial para optar al título de M A E S T R A E N CIENCIAS Diciembre de 1999 Maestría en Ciencias con Especialidad en Ingeniería Ambiental DETERMINACION DE QUISTES DE Giardia lamblia Y OOQUISTES DE Cryptospordium parvum EN EL AGUA POTABLE DE CIUDAD OBREGON, SONORA, MEXICO Tesis presentada por: E V A E S P E R A N Z A L E Y V A MICHEL Aprobada en contenido y estilo por: AGRADECIMIENTOS A Dios y a mis padres por permitirme estar aquí. A l Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey, Campus Ciudad Obregón, por haber hecho posible mis estudios de Maestría. A la M . C . Martha Elvia Díaz Cinco por su valiosa asesoría para la elaboración de este trabajo y por su amistad. Al Dr. Fernando Lares Villa y al Instituto Tecnológico de Sonora por su ayuda en la revisión de este trabajo y apoyo brindado. Al Dr. Ignacio Lujan. Al Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A . C . por facilitar sus instalaciones para la elaboración de la parte experimental de este trabajo. A los miembros de Educación Superior del Noroeste A . C . que apoyaron económicamente parte de este proyecto. Al Organismo Operador de Agua Potable, Alcantarillado y Saneamiento de Cajeme, por toda la información y valiosa ayuda, en especial a la Q. Leonor Frías Armenta. A los directivos del Programa de Graduados en Ingeniería y Tecnologías de la Universidad Virtual, por todo el apoyo brindado durante mis estudios de Maestría y en especial en esta última parte. A las Q.B Verónica Mata y Rosalba Pérez y a la M.C. Alma Rosa Bustamante del Laboratorio de Microbiología del CIAD, por su ayuda profesional y su amistad durante mi estancia en Hermosillo. A mis compañeros de trabajo Lic. Clara Elena Krafft y Lic. Froylán Vázquez por su comprensión y colaboración. Al M.C. Humberto González por su apoyo en la parte estadística. A mi hermano Rafael Alberto, por todo su apoyo y ayuda, sobre todo durante el período de muestreo. A mis compañeros de estudio: Magdalena Espinoza, Ing. Saldívar, Germán Ibarra, Moisés Larios, Ligia Saldaña y Francisco Fernández. Mucha suerte! Y de manera especial a todos aquéllos jóvenes que fueron mis alumnos paralelamente a mis estudios de Maestría y que compartieron conmigo un poco de su energía y entusiasmo por la vida. Les deseo lo mejor! i RESUMEN DETERMINACIÓN DE QUISTES DE Giardia lamblia Y OOQUISTES DE Cryptospordium parvum EN EL AGUA POTABLE DE CIUDAD OBREGÓN, SONORA, MEXICO DICIEMBRE D E 1999 E V A E S P E R A N Z A L E Y V A MICHEL INGENIERO B I O T E C N O L O G O INSTITUTO T E C N O L O G I C O D E S O N O R A M A E S T R A E N CIENCIAS INSTITUTO T E C N O L O G I C O Y D E E S T U D I O S S U P E R I O R E S D E M O N T E R R E Y Dirigida por la M en C Martha Elvia Díaz Cinco Cryptosporidium parvum y Giardia lamblia, son dos protozoarios parásitos que generalmente se encuentran asociados. Ambos son reconocidos como causa de diarrea en el hombre, siendo la acción de Cryptosporidium más severa en niños, ancianos y pacientes inmunocomprometidos. El agua es un importante vehículo de contaminación, ya que se ha encontrado que los quistes de ambos parásitos son resistentes a los procedimientos comúnes de potabilización e incluso, desinfección. S e han reportado brotes epidémicos en diversas regiones del mundo, tanto en países desarrollados como en países en vías de desarrollo; lo que ha llevado a naciones como Estados Unidos a cambiar su reglamentación en cuanto a la calidad microbiológica del agua potable que ingiere la población. ii E n nuestro país son escasos los estudios al respecto. E n este trabajo se tomaron muestras de 1000 litros, cubriéndose el área urbana de Ciudad Obregón, Sonora. Las muestras fueron transportadas en hielo y almacenadas en refrigeración hasta su tratamiento que consistió en una elución de los parásitos del filtro, una flotación y clarificación de la muestra, una segunda filtración en una pequeña membrana en donde se aplicaron anticuerpos monoclonales y colorantes para su posterior observación en el microscopio de epifluorescencia. Así mismo se realizó la prueba de eficiencia resultando una eficiencia del 5 9 % para recolección de ooquistes de Cryptosporidium y una eficiencia del 8 2 % para recolección de quistes de Giardia. De las muestras analizadas se encontraron ooquistes de parvum Cryptosporidium en el 6 9 % de ellas, con una media de 4.75 y quistes de Giardia lamblia, en el 2 5 % ellas, con una media de 1.68. Además se determinó viabilidad encontrándose un alto porcentaje de quistes y ooquistes viables. S e realizaron determinaciones de varios parámetros fisicoquímicos (valores promedio), dos determinados en el momento del muestreo: pH 7.39 y cloro libre residual 0.96 y el resto proporcionados por O O M A P A S de Cajeme: turbidez 1.14 N T U , temperatura 29.9 °C, cloruros 17.5 ppm y dureza 91.2 ppm. Mediante un estudio de correlaciones de Pearson se encontró relación entre los ooquistes y los quistes viables. iii Empleando una regresión lineal múltiple se efectúo una correlación entre el número de ooquistes totales y viables y cada uno de los parámetros fisicoquímicos, realizándose el mismo procedimiento para los quistes totales y viables. Encontrándose que los ooquistes totales tuvieron relación con turbidez y cloruros y los ooquistes viables, quistes totales y quistes viables tuvieron cada uno de ellos relación con la temperatura. iv ÍNDICE DE CONTENIDO Página i ü vii viii AGRADECIMIENTOS RESUMEN LISTA DE T A B L A S LISTA DE FIGURAS Capítulo 1. INTRODUCCIÓN 1.1 Situación problemática 1.2 Justificación del estudio 1 2 3 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo general 2.2 Objetivos específicos 7 7 7 3. REVISION BIBLIOGRÁFICA 3.1 Calidad del agua 3.1.1 Indicadores 3.1.2 Contaminantes patógenos 3.1.3 Legislación sobre agentes microbianos 3.2 Tratamientos y operaciones unitarias para la potabilización del agua en Ciudad Obregón 3.2.1 Floculación 3.2.2 Sedimentación 3.2.3 Filtración 3.2.4 Cloración 3.3 Protozoarios parásitos 3.3.1 Giardia lamblia 3.3.1.1 Clasificación 3.3.1.2 Morfología 3.3.1.3 Habitat 3.3.1.4 Ciclo vital 3.3.1.5 Patología 3.3.1.6 Vías de transmisión 3.3.1.7 Epidemiología 3.3.1.8 Regulaciones 3.3.2 Cryptosporidium parvum 3.3.2.1 Clasificación 3.3.2.2 Morfología 3.3.2.3 Habitat 3.3.2.4 Ciclo vital 3.3.2.5 Patología 3.3.2.6 Vías de transmisión 3.3.2.7 Epidemiología 3.3.2.8 Regulaciones 8 8 8 11 12 V 14 15 17 17 18 18 19 20 21 21 25 26 28 30 33 34 35 36 36 39 40 41 42 43 3.4 Detección de Giardia y Cryptosporidium en agua potable 3.4.1 Metodología 3.4.1.1 Muestreo 3.4.1.2 Concentración y purificación 3.4.1.3 Identificación 3.4.1.3.1 Inmunofluorescencia 3.4.1.3.2 Reacción en cadena de la polimerasa 3.4.1.3.3 Métodos basados en las propiedades biofísicas o bioquímicas 3.4.1.4 Prueba de viabilidad 45 45 46 46 47 47 49 4. METODOLOGÍA 4.1 Prueba de eficiencia 4.2 Muestreo 4.3 Recolección de la muestra 4.3.1 Determinación in situ de cloro libre residual y pH 4.3.2 Determinación de parámetros fisicoquímicos 4.4 Tratamiento de la muestra 4.4.1 Elución de quistes y ooquistes 4.4.2 Concentración del eluído 4.4.3 Clarificación y/o flotación de la muestra 4.5 Filtración en membrana de la muestra 4.6 Identificación y cuantificación de los quistes y ooquistes 4.7 Viabilidad de quistes y ooquistes 4.8 Análisis estadísticos 52 52 53 55 57 57 57 58 58 59 61 63 63 64 5. RESULTADOS Y DISCUSION 65 5.1 Análisis estadístico 50 51 69 6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 81 7. ANEXO 1 84 8. ANEXO 2 86 9. ANEXO 3 89 10. ANEXO 4 90 11. BIBLIOGRAFIA 93 vi LISTA DE TABLAS Tabla Página 1. Límites máximos permisibles de consituyentes comunes del agua potable (Estados Unidos) 2. Normas bacteriológicas para fuentes de abastecimiento de agua potable 3. Normas físicas, químicas y organolépticas para fuentes de abastecimiento de agua potable 4. Media y desviación estándar para cada uno de los parámetros fisicoquímicos vii 9 10 10 75 LISTA DE FIGURAS Figura Página 1. Proceso de tratamiento de agua potable 2. Trofozoitos de Giardia lamblia 3. Quistes de Giardia, sin teñir y teñidos con tricromo 4. Giardia invadiendo una sección del intestino 5. Ooquistes de Cryptosporidium parvum 6. Ooquistes de Cryptosporidium parvum, junto con quistes de Giardia lamblia, juntos para fines de comparación 7. Quistes de Giardia lamblia observados en el control positivo 8. Quistes de Giardia lamblia observados en una de las muestras analizadas 9. Ooquistes y quistes totales encontrados en las colonias abastecidas por las plantas potabilizadoras 1 y 2 10. Ooquistes y quistes totales encontrados en las colonias abastecidas por las plantas potabilizadoras 3 y 4 11. Distribuciones para Ooquistes totales y Ooquistes viables en las 32 muestras analizadas 12. Distribuciones para Quistes totales y Quistes Viables en las 32 muestras analizadas 13. Ajustes para los Ooquistes y Quistes totales en relación al área que pertenece el punto de muestreo 16 22 23 27 37 viii 48 67 68 70 71 72 73 77 1. INTRODUCCIÓN Existen dos protozoarios parásitos que frecuentemente se encuentran asociados como los responsables de diarrea en el mundo, sobre todo en niños, ancianos y pacientes inmunocomprometidos. Dichos parásitos son Giardia lamblia y Cryptosporidium parvum. En Sonora se cuenta con una prevalencia de giardiasis a través de los años, sin embargo, Cryptosporidium. no se cuenta con estadísticas para el caso de El agua es el principal vehículo de transmisión de ambos, ya que son resistentes a los tratamientos comunes de potabilización, específicamente a la desinfección por cloro. La presente investigación tiene como propósito fundamental establecer si el agua consumida en Ciudad Obregón posee quistes y/o ooquistes protozoarios parásitos que en la actualidad de dos están siendo objeto de muchos estudios debido a los brotes epidémicos que se han presentado en diversas partes del mundo: Giardia lamblia y Cryptosporidium 1 parvum. 1.1 Situación problemática El agua que beben la mayoría de las comunidades y municipalidades del mundo, se obtiene de fuentes superficiales, ríos, corrientes, lagos y pozos; este tipo de fuentes s e pueden contaminar con algunos desechos domésticos e industriales y aunque los sistemas municipales de purificación han sido perfeccionados, cada vez se necesita mayor cantidad de agua y a su vez, se generan más contaminantes. Además cuando el agua ha sido potabilizada, también puede contaminarse en el trayecto hacia el usuario. Jensen y Wright (1987) reportan que en 1978 se presentó una epidemia de giardiasis en Colorado, por lo cual la Agencia de Protección al Ambiente (EPA) y el C D C revisaron los registros del drenaje semanal. S e comprobó que durante la semana del brote epidémico, el número de galones de drenaje producido cayó en aproximadamente 50%, debido a la obstrucción de la línea y a una fisura en el río que proveía de agua a la ciudad. En sus inicios, Ciudad Obregón, Sonora, se abastecía de agua a través de la explotación de pozos, sin embargo al incrementarse la población, se vio la necesidad de construir una planta para potabilizar el agua proveniente de la presa Alvaro Obregón. Con el paso del tiempo fue necesario construir otras plantas potabilizadoras, todo esto en un lapso aproximado de 25 años. El agua para su potabilización se pasa por tres etapas: clarificación, desinfección y acondicionamiento organoléptico. La cloración se realiza en dos pasos: una precloración en el tanque clarificador y una post cloración en la salida del agua y 2 de los filtros. Stobbe y Reese (1996), Guerrant (1997) y Juranek (1998), coinciden en que los quistes de Giardia y los ooquistes de Cryptosporidium son altamente resistentes a los desinfectantes químicos usados en el tratamiento del agua y a la remoción física por filtración, especialmente si éstos no son mantenidos y operados de manera adecuada. Por otro lado, Business Editors and Legal Writers (1998), establecen que los productos de la desinfección por cloro pueden ser peligrosos, sobre todo en altas concentraciones. Debido a la aparición de infecciones gastrointestinales atribuibles a la ingesta de agua potable contaminada por Giardia lamblia y Cryptosporidium parvum y la ineficiencia relativa de la prueba de los coliformes como medio indicador de una posible contaminación por este tipo de organismos, se ha tratado de establecer un método de detección seguro y confiable. L a E P A (1998), establece en el Acta para Agua Potable Segura que se requiere del Análisis de Micropartículas (MPA), para poblaciones con aguas superficiales de más de 10,000 habitantes, usando el Método del Ensayo con inmunofluoresceína para determinar la presencia de quistes de Giardia y ooquistes de Cryptosporidium en agua potable. 1.2 Justificación del estudio Giardia lamblia es un parásito capaz de producir diarrea y malabsorción intestinal; es huésped del intestino delgado del ser humano por lo que se elimina en su forma quística en las heces. Brown y Neva (1985), establecieron que se 3 transmite por alimentos y agua contaminada por alcantarilla, aguas negras, moscas, manipuladores de alimentos y manos llevadas a la boca. La F D A (1997) concluye que las mayores epidemias de giardiasis están asociadas con sistemas de agua contaminados o que presentaron alguna deficiencia. Freeman (1989), enumera algunas epidemias de giardiasis, en las que el agua de grifo fue la fuente más probable de contaminación: algunos brotes en Colorado en 1965 y 1974; en Roma, Nueva York ocurrió un brote muy extenso en 1975, en el que enfermaron más de 4800 personas de una población de 46,000 habitantes, con la probabilidad de que un número mucho más grande padeciera infecciones asintomáticas; también se han encontrado giardiasis graves en grupos de americanos que visitaron la Unión Soviética. Brown (1995), comenta que en Nueva Zelanda han sido reportados arriba de 1000 casos de giardiasis en los años de 1990, 1991 y 1992; después de que en 1988 se tuvieron que tomar medidas drásticas para combatir lo que se consideró como un problema de salud pública nacional. Cryptosporidium parvum puede infectar en forma severa el intestino de personas con deficiencias inmunológicas (por ejemplo: pacientes con SIDA), muy jóvenes o muy ancianos y producirles diarrea. Jawetz et al (1990), afirman que la criptosporidiosis se adquiere de excremento de animales, hombres infectados, alimento o agua contaminados con excremento. S e sabe que actualmente el 7% de los casos de diarrea en los Estados Unidos son causados por Butler y Mayfield (1996), enuncian que Cryptosporidium, Cryptosporidium. ha sido implicado en un gran número de epidemias de gastroenteritis. El primer gran incidente registrado ocurrió en Texas en 1984, pero el caso más notorio fue en Milwaukee en 1993, 4 donde más de 400,000 gentes fueron afectadas. También mencionan que los métodos actuales de tratamiento en los Estados Unidos no son suficientes para prevenir este tipo de brotes epidémicos. A raíz de esta problemática se han tomado medidas regulatorias, como cuando los epidemiólogos estatales detectan una posible epidemia, deben de notificar inmediatamente al Programa de Agua Potable. El Departamento de Recursos Naturales de Wisconsin (1996), afirma que a raíz de la epidemia de Milwaukee se han intensificado las medidas preventivas, como leyes más estrictas en el parámetro turbidez del agua potable; esto no previene la cryptosporidiosis, pero da más rápidamente una prevención al problema. L a Secretaría de Salud (1998), asegura que en Sonora se reportaron 138 defunciones por enfermedades infecciosas intestinales en el año de 1996. Hasta el mes de Octubre de 1999, se han presentado 105,626 casos de enfermedades diarreicas agudas, comparadas con los 124,861 casos registrados en 1998 en estas fechas. De estas enfermedades los casos de giardiasis acumulados registrados hasta la semana 39 de 1999, son 1972. Astiazarán era/(1999), indica que en un estudio realizado tomando muestras de 473 niños de jardines de niños en Hermosillo, solo el 49.9% resultó libre de parásitos, mientras que el 51.1% resultó positivo para uno o más parásitos, encontrándose en el 21.7% quistes de Giardia, situación que ha tenido una prevalencia a través de varios años, de acuerdo a lo reportado por Cuamea (1996). Así mismo existe el antecedente del trabajo realizado por Cryptosporidium Díaz et al (1999), concerniente a la detección de parvum en el agua potable para la ciudad de Hermosillo, Sonora, 5 en donde fue posible encontrar ooquistes, la mayoría de ellos viables. Además existe la posibilidad de que en un futuro se tenga que reutilizar el agua debido a la aridez de la región y a la sequía que la ha azotado en los últimos años y entonces como mencionan Rose et al (1989), sería necesario tener más vigilancia tanto de parásitos como de virus. El organismo operador de agua en Ciudad Obregón, da servicio a una población usuaria de aproximadamente 400,000 habitantes. La Norma Oficial Mexicana establece reglamentaciones en cuanto a la calidad microbiológica del agua, pero solo para bacterias coliformes. Además al ser Sonora un estado fronterizo, hay que considerar que en los Estados Unidos se han cambiado las reglamentaciones en cuanto a la calidad microbiológica del agua debido a la ocurrencia de brotes epidémicos como los mencionados anteriormente. El estudio a realizar será del tipo puntual; se desea establecer la frecuencia en la aparición de los quistes de estos parásitos, por lo que se puede afirmar que servirá como base para conocer la influencia que ejercen sobre la incidencia de enfermedades diarreicas y de esta forma en el futuro, implementar sistemas de vigilancia en caso de encontrarse en el agua potable. 6 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo general Determinar la presencia de quistes de Giardia Cryptosporidium lamblia y ooquistes de parvum en el agua potable de Ciudad Obregón, Sonora, México. 2.2 Objetivos específicos Cuantificar quistes y ooquistes en el agua. Determinar el porcentaje de quistes y ooquistes viables. Relacionar la cantidad de quistes y ooquistes totales y viables con cada uno de los parámetros fisicoquímicos: pH, cloro, turbidez, temperatura, cloruros y dureza. Relacionar la cantidad de quistes con la cantidad de ooquistes. 7 3. REVISION BIBLIOGRAFICA 3.1 Calidad del agua 3.1.1 Indicadores Cuando el agua es apta para consumo humano es llamada potable. López (1985), menciona que para que las aguas sean ingeridas por el hombre de manera que beneficie su salud, es necesario que lleven en solución ciertas sustancias que las hagan agradables y nutritivas como oxígeno y bióxido de carbono y sales minerales como potasio y magnesio en cantidades pequeñas; además debe estar exenta de materias perjudiciales a la salud, libre de olores, colores y gérmenes infecciosos. S u temperatura debe fluctuar entre 10 y 15°C y debe tener un sabor agradable. Los indicadores de la calidad del agua potable: - Componentes biológicos. L a examinación bacteriana siempre deberá incluir una estimación cuantitativa del número total de organismos del grupo coliforme, el cual es indicador de contaminación fecal. Además pueden aparecer 8 otra clase de microorganismos, para lo cual se emplearán únicamente examinaciones periódicas. - Características físicas. Incluyen a la turbidez, color, olor y sabor. - Características químicas. En la Tabla 1 se describen las impurezas más comunes establecidas por el Servicio de Salud Pública en los Estados Unidos. Tabla 1. Límites máximos permisibles de constituyentes comunes del agua potable (Estados Unidos). Bradford (1993). Concentración Constituyente Químicos inorgánicos: Arsénico Bario Cadmio Cromo Plomo Mercurio Nitrato Selenio Plata Fluoruros Químicos orgánicos: Endrin Lindano Metoxicloro .05 mg/l 1.00 0.01 0.05 0.05 0.002 10.00 0.01 0.05 1.60 0.0002 mg/l 0.0004 0.100 En México, el Diario Oficial de la Federación (1995) dicta las normas que debe cumplir el agua potable, en la Tabla 2 se encuentran las normas bacteriológicas para fuentes de abastecimiento de agua potable; en la Tabla 3 se encuentran las normas físicas, químicas y organolépticas, para el mismo tipo de agua. 9 Tabla 2. Normas bacteriológicas para fuentes de abastecimiento de agua potable. Diario Oficial de la Federación (1995). Límite Permisible 2 NMP/100 mi 2 U F C / 1 0 0 mi No detectable NMP/100 mi C e r o U F C / 1 0 0 mi 200 U F C / 1 0 0 m l Ausencia total Ausencia total Característica Organismos Coliformes Totales Organismos Coliformes Fecales Organismos Mesófilos Aerobios Bacteria Vibrio cholerae Salmonella U F C = Unidades formadoras de colonias N M P = Número más probable Tabla 3. Normas físicas, químicas y organolépticas para fuentes de abastecimiento de agua potable. Diario Oficial de la Federación (1995). Límite Permisible 20 unidades de color verdadero en la escala de platino cobalto Agradable (se aceptarán aquéllos que Olor y sabor sean tolerables para la mayoría de los consumidores, siempre que no sean resultado de condiciones objetable desde el punto de vista biológico y químico). 5 unidades de turbiedad nefelométricas o Turbiedad su equivalente (UTN) 250 mg/l Cloruros (CI) 500 mg/l Dureza total ( C a C 0 ) 10 mg/l Nitratos (como N) Nitritos 0.05 mg/l P H (Potencial de hidrógeno en unidades 6.5 - 8.5 de pH) 1000 mg/l Sólidos disueltos totales 400 mg/l Sulfatos ( S 0 " ) Característica Color 3 4 10 3.1.2 Contaminantes patógenos Pelczar et al (1991), indican que al ser el agua portadora de microorganismos patógenos, puede poner en peligro la salud y la vida. Además señalan que los microorganismos patógenos más frecuentemente transmitidos por el agua producen enfermedades del aparato digestivo: fiebre tifoidea, paratifoidea, disentería (amebiana y bacilar) y cólera; los agentes etiológicos de éstas se encuentran en las materias fecales y en la orina de los infectados y al eliminarse pueden llegar a un depósito que desemboque en agua para beber. Brock et a/(1984), explican que debido a que se consume agua en grandes cantidades, puede ser infecciosa aun si contiene solo un pequeño número de organismos patógenos; estos se alojan en el intestino, crecen, producen infección y enfermedad. Además también mencionan que una falla en los métodos de purificación de agua, la contaminación del agua en inundaciones, temblores y otros desastres o la contaminación cruzada de pipas de agua de líneas de alcantarillado con fugas en ocasiones originan epidemias. The National Research Council (1986), enumera a los principales organismos patógenos que merman la calidad del agua: - Bacterias. Salmonella typhi (fiebre tifoidea), Salmonella paratyphi-A (fiebre paratifoidea), otras especies de Salmonella y un gran número de serotipos (salmonelosis y fiebre entérica), Shigella dysenteriae, 11 S. flexneri y S. sonnei (disentería bacilar), Vibrio cholerae (cólera), Leptospira sp. (leptospirosis), Yersinia enterocolitica (gastroenteritis) y Pseudomonas aeruginosa (varias infecciones). - Virus. Los virus más importantes que afectan a los humanos son los enterovirus, retrovirus, parvovirus y adenovirus. - Parásitos. Entamoeba histolytica ha sido encontrada en epidemias de disentería y junto con Giardia lamblia y Cryptosporidium muchas parvum, pueden pasar las barreras sanitarias. trichiura Helmintos. Ascaris lumbricoides (el gusano del estómago), Trichuris (el gusano látigo), Ancylostoma Strongyloides dudodenale, Necator americanus y stercoralis. Todos ellos son nemátodos. 3.1.3 Legislación sobre agentes microbianos L a Norma Oficial Mexicana NOM-012-ssa1-1993 establece los requisitos sanitarios que deben cumplir los sistemas de abastecimiento de agua para uso y consumo humano públicos y privados. El control de la calidad del agua es la clave para reducir los riesgos de transmisión de enfermedades gastrointestinales a la población por su consumo; este control se ejerce evaluando los parámetros de calidad del agua y por otra parte vigilando que las características de las construcciones, instalaciones y equipos de las obras de captación, conducción, plantas de potabilización, redes de distribución, tanques de almacenamiento o regulación y tomas domiciliarias protejan el agua de contaminación. 12 Ramalho (1993), asevera que los organismos coliformes son bacterias en forma cilindrica presentes en el tracto intestinal humano, no son perjudiciales. Una persona puede descargar entre 0.1 y 0.4 billones de células por día, además de otras especies de microorganismos que si resultan patógenos pero cuyas poblaciones son más pequeñas y difíciles de localizar, por lo que tradicionalmente se les ha usado como indicador de la presencia potencial de patógenos. Esquer (1997), reporta que en un estudio realizado de Mayo de 1996 a Abril de 1997 del agua perteneciente a la red de Ciudad Obregón no se logró aislar ninguna bacteria patógena, utilizando los siguientes indicadores bacteriológicos: recuento de bacterias mesófilas aerobias, determinación del N M P de coliformes totales y fecales; para Salmonella se enriquecieron las muestras en caldo selenito y cistina y tetrationato base para resembrar en agar sulfito de bismuto y Mac Conkey; para Vibrio cholerae se enriqueció en caldo verde bilis brillante para coliformes totales, y caldo E C para coliformes fecales para resembrar en agar E M B . Sin embargo no se contempló el estudio parasitológico. Rose et al (1988), indican que en un estudio realizado en 39 muestras de agua, no s e encontró correlación entre la cantidad de quistes de Giardia y ooquistes de Cryptospordium con los niveles de coliformes totales y fecales, ni con la turbidez; por lo que aseveran que ambos parámetros de ninguna manera pueden ser un indicador de la ausencia de protozoarios entéricos en el agua. Generalmente la forma de controlar a los agentes microbianos presentes en el agua es utilizando compuestos de cloro sin embargo Ternus (1995), reporta que 13 a pesar de que estos productos son usados desde 1900 para controlar por ejemplo a bacterias patógenas que causan cólera o tifoidea, éstos pueden reaccionar con materia orgánica presente en el agua y formar unos compuestos cancerígenos: los trihalometanos. También mencionan que cada año en Estados Unidos, mas de 10,000 gentes sufren de cáncer rectal o de la vejiga debido al consumo de este tipo de compuestos presentes en el agua que beben. 3.2 Tratamientos y operaciones unitarias para la potabilización del agua en Ciudad Obregón El agua llega a la ciudad a través de dos canales provenientes de la presa Alvaro Obregón (Oviáchic), la cual está localizada a 40 Km de la ciudad, estos canales forman parte del Distrito de Riego 041. El Canal Principal Bajo provee a las plantas 1 y 2, ubicadas al norte de la ciudad y el Canal Principal Alto abastece de agua a las plantas 3 y 4, que se encuentran al sur de la ciudad. Para llevar el agua desde el canal hasta las plantas potabilizadoras, es necesario conducir el agua a través de un canal rectangular (plantas 1 y 2), o bien, una tubería cerrada (plantas 3 y 4). En las plantas 1 y 2 antes de ingresar al tratamiento se cuenta con un cárcamo, enseguida el agua es bombeada a través de 4 equipos de bombeo con una capacidad de 200 litros por segundo cada uno, debido a que se tiene que bombear el agua hacia un nivel más elevado. En las plantas 3 y 4 no es necesario el bombeo, ya que el nivel de agua proveniente del 14 Canal Principal Alto llega por gravedad hasta los floculadores. En ambas plantas se monitorea su calidad antes de cualquier tratamiento. Ver Figura 1. 3.2.1 Floculación Kemmer y Me Callion (1989), señalan que tanto la coagulación como la floculación son procesos que se emplean para extraer del agua los sólidos que en ella se encuentran suspendidos siempre que su rapidez natural de asentamiento s e a demasiado baja para proporcionar clarificación efectiva. El agua cruda turbia contiene material suspendido, tanto sólidos que pueden asentarse como partículas lo bastante grandes que se asientan en reposo, o sólidos dispersados que no se asentarían con facilidad, es posible que una parte considerable de estos sólidos que no se asientan sean coloides. La coagulación desestabiliza a los coloides neutralizando las fuerzas que los mantienen separados, es decir cada partícula o coloide se encuentra estabilizada por cargas eléctricas negativas sobre su superficie que hace que las partículas cercanas no se acerquen y esto impide que se formen masas mayores o flóculos que se puedan asentar. Generalmente esto se logra añadiendo coagulantes químicos como: sales de aluminio o de hierro o polielectrólitos y aplicando energía de mezclado. En las plantas de Ciudad Obregón lo que se hace antes de la floculación es añadir cloro como desinfectante (pre-cloración). Como coagulante se emplea Sulfato de Aluminio que actúa desestabilizando las cargas eléctricas, para que las partículas se adhieran mejor también es adicionado Polímero Catiónico 15 (que Figura 1. P R O C E S O DE T R A T A M I E N T O DE A G U A P O T A B L E ( O O M A P A S de Cajeme) P L A N T A S POTABILIZADORAS D E C D . OBREGÓN C A N A L DE A G U A FILTRADA TANQUE DE A L M A C E N A M I E N T O BOMBEO RED MUNICIPAL actúa como agente floculante) y los flóculos formados sedimenten con mayor rapidez. Este proceso se lleva a cabo mediante agitación y con una concentración alta de lodos, para una mejor formación de los flóculos. 3.2.2 Sedimentación Una vez, formados los flóculos, se pasa a un proceso de reposo, para que se lleve a cabo la sedimentación. Los lodos resultados de la sedimentación, se juntan por medio de rastras y se devuelven al floculador, sin embargo, para controlar la concentración de lodos, constantemente se están purgando hacia un dren. Enseguida el agua pasa a un canal de agua sedimentada en donde se monitorea su calidad y se le adiciona carbón activado con el fin de eliminar sabores y olores contenidos en el agua. 3.2.3 Filtración Mediante este proceso físico se hace pasar agua por un estrato de arena sílica, en donde s e retienen las partículas que no alcanzaron a sedimentar. Debido a esta retención de partículas, los filtros se tapan constantemente, por lo que es necesario limpiarlos mediante un retrolavado. 17 Actualmente se cuenta con 5 filtros en cada planta y después el agua pasa a un canal de agua filtrada, en donde nuevamente se monitorea la calidad y se procede a la siguiente etapa. 3.2.4 Cloración En el canal de agua filtrada se lleva a cabo de nuevo una cloración (postcloración), con el objetivo de tener una concentración suficiente para contar con cloro residual en cualquier punto de la red municipal que pueda desinfectar algún agente contaminante. Enseguida el agua se pasa al tanque de almacenamiento que sirve para poder administrar adecuadamente el agua producida, debido a que la demanda de agua de la población varia de acuerdo a la hora del día. Después hay un bombeo que sirve para mantener la presión adecuada y pasar a la red municipal. La calidad del agua es monitoreada al salir de la planta y en las diferentes colonias. 3.3 Protozoarios parásitos Casemore (1995), reconoce que el agua ha sido reconocida como vehículo de infecciones como tifoidea y cólera; precisamente por ello, el tratamiento de agua ha estado basado en la detección de bacterias. Sin embargo, ha surgido el problema de que los parásitos han resultado resistentes a los métodos tradicionales de tratamiento de agua y por lo tanto se ha abierto un nuevo capítulo 18 de estudio para la epidemiología y transmisión de enfermedad de estos patógenos, por medio del agua. 3.3.1 Giardia lamblia Joklik et al (1984), comentan que este flagelado fue descubierto por Leeuwenhoek en 1681, de sus propias heces fecales; pero la primera descripción identif¡cable fue hecha por Lambí en 1859 que le dio el nombre intestinalis. Delaat (1983), establece que junto con Entamoeba histolytica, Giardia lamblia es el protozoario intestinal de mayor importancia médica. Walsh (1986), Warhust y Smith (1992), citados por Girdwood (1995), indican que los protozoarios parásitos que afectan el tracto gastrointestinal humano, son una de las mayores causas de insalubridad y contribuyen significativamente a la tasa de mortalidad en el mundo. Los tres parásitos gastrointestinales más abundantes son: Giardia duodenalis (también llamada Giardia lamblia o Giardia intestinalis), Cryptosporidium parvum y Entamoeba histolytica causan más de mil millones de infecciones y contribuyen a más de un millón de muertes anualmente. Freeman (1989), coincide con lo anterior, y a que Giardia suele relacionarse con la erosión del epitelio dudoenal y con una irritación de la vesícula biliar; además hay evidencias de que puede provocar una irritación profunda de la mucosa. Astiazarán et al (1999), afirman que en un estudio realizado con 473 niños en edad prescolar en Sonora, el 51.1% resultó positivo con uno o más parásitos 19 de los cuales 21.7% estaban infectados por Giardia lamblia, similar a la reportada p o r C u a m e a (1996). El Centro de Control y Prevención de enfermedades (1998), muestra que Giardia ha sido reconocida como una de las causas más comunes de enfermedades adquiridas por agua contaminada en los Estados Unidos. Además asegura que es posible encontrar este parásito en cualquier región del mundo. La F D A (1997), menciona que en Europa también es llamada Lamblia intestinalis. El Departamento de Agua y Fuerza de Los Angeles (1996), afirma que a pesar de que fue descubierta en el siglo XIX, no fue hasta 1981 cuando la Organización Mundial de la Salud clasificó a Giardia como un patógeno (capaz de producir enfermedad). 3.3.1.1 Clasificación Joklik et al (1984), establecen que el género Giardia pertenece a la familia Hexamitidae, cuyos miembros difieren del resto de los flagelados por poseer dos núcleos adyacentes en el mismo plano transversal y seis u ocho flagelos. S e han descubierto y descrito muchas variedades de Giardia lamblia a través de los análisis de proteínas y DNA y esto tiene que ver con la severidad de los síntomas. 20 3.3.1.2 Morfología Brown y Neva (1985), muestran que el trofozoíto es un flagelado piriforme con simetría bilateral de 12 a 15 u.m, con un extremo anterior ancho y redondeado y un extremo posterior en punta. L a superficie dorsal es convexa, como tres cuartas partes de la superficie ventral plana están ocupados por un disco suctorio cóncavo oval, hay dos núcleos y cuatro pares de flagelos. Ver Figura 2. Además describen al quiste como elipsoide, de 9 a 12 \im, con pared lisa bien definida, contiene dos a cuatro núcleos y formaciones comparables a un trofozoíto. Ver Figura 3. Shostak (1998), afirma que por medio de la forma quística se puede transmitir el parásito, ya que está protegido para que sobreviva varias semanas o más. Schaechter et al (1993), aseguran que el ácido del estómago no mata a los quistes sino que los prepara para su cambio a la forma vegetativa de trofozoíto en el duodeno. L a O M S en 1998, indica que éste se adhiere al epitelio mucoso usando su superficie ventral y es así como causan diarrea. También es posible encontrar trofozoítos en el yeyuno. Girdwood (1995), señala que los trofozoítos se multiplican por fisión binaria. 3.3.1.3 Habitat Los quistes de Giardia lamblia pueden ser encontrados en cualquier lugar debido a s u resistencia. Tienen un período de incubación de 1 a 4 semanas. 21 Figura 2. Trofozoitos de Giardia lamblia. 22 Figura 3. Quistes de Giardia sin tenir y tenidos con tricromo. Darben (1996) 73 Brown y Neva (1985), explican que el ser humano es el huésped natural de Giardia lamblia, aunque también puede ocurrir una zoonosis, ya que en gran variedad de animales se han encontrado especies de morfología idéntica a Giardia. S e eliminan muchos quistes en las heces en forma intermitente, pero los trofozoítos son raros, salvo en heces diarréicas. Le Chevallier et al (1990), aseveran que individuos con una infección moderada puede contener 300 millones de quistes del parásito. Schaechter et a/(1993), comentan que Giardia en su forma quística ha sido encontrada en corrientes de agua contaminada por heces de animales o humanos, también causa problemas en ambientes urbanos con sanidad deficiente, como por ejemplo: en lugares en donde se manejan pañales sucios. Puede ser transmitida en climas fríos y cálidos. La giardiasis ataca a toda la población, sin embargo, es más común en niños. L a giardiasis crónica es más común en adultos que en niños. Le Chevallier et al (1990), establecen que los niveles de contaminación de quistes en agua están en un rango de 0.003 a 6 quistes por litro, además los quistes pueden sobrevivir en el agua potable y permanecer infectivos hasta por 16 días. Bingham et al (1979), reportan que después de seis días a 37 °C puede haber 100% de inactivación de quistes, después de 25 días a 21 °C y 77 días a 4°C en agua potable sin cloro. 3.3.1.4 Ciclo vital Vázquez y Velasco (1987), reseñan que al ser excretados los quistes inmaduros binucleados en la materia fecal y después de haber sufrido una simple división nuclear, pasan al estado maduro tetranucleado. Enseguida los quistes sufren un proceso de desenquistamiento debido a la acidez gástrica, a un pH de 2; debido a que el trofozoíto es intolerante a cambios de pH y sólo tolera un rango entre 6.4 y 7.4; dicho desenquistamiento se va a completar a nivel duodenal, emergiendo a través de la pared quistica un trofozoíto tetranucleado en proceso de división binaria que da lugar a dos trofozoítos binucleados. C a d a uno de los trofozoítos se multiplican por el proceso de división longitudinal, este proceso puede durar en el organismo de siete minutos a cinco horas, después de lo cual los flagelados establecen su habitat, constituido por el epitelio en cepillo en dos tercios superiores del intestino delgado, formados en parte por duodeno y yeyuno, sin embargo, también es posible encontrar trofozoítos en el intestino grueso y vesícula biliar. Por razones indeterminadas algunas de estas formas vegetativas se desprenden del borde en cepillo, entrando a la corriente fecal, comenzando el enquistamiento en el intestino delgado en donde el protozoo sufre retracción de sus flagelos y más tarde se rodea de una pared quistica, proceso que por lo regular ocurre en las porciones bajas del íleon, no siendo necesario el colon para que s e lleve a cabo el proceso. Como consecuencia de lo anterior los quistes son 25 excretados en las heces; sin embargo, algunas veces la transformación del trofozoíto a quiste falla, de manera particular cuando el tránsito intestinal se encuentra acelerado. Los trofozoítos no resisten fuera del organismo y mueren, pero los quistes resisten condiciones fuera de su habitat , lo que los hace susceptibles a ser ingeridos por otro huésped y reiniciar el ciclo biológico. 3.3.1.5 Patología El Centro de Prevención y Control de enfermedades (1998), enumera los síntomas de la giardiasis: diarrea, malestares abdominales, náuseas. Estos síntomas pueden ocasionar pérdida de peso y deshidratación. Aparecen usualmente 1 a 2 semanas después de la infección con el parásito, sin embargo no todos los individuos infectados muestran síntomas. La F D A (1997), establece que si bien ha sido demostrado que el organismo invade las células del duodeno, ver Figura 4, la mayoría de los investigadores piensan que ésta situación no es responsable de los síntomas de la enfermedad. La obstrucción mecánica de la superficie de absorción del intestino, ha sido propuesta como un posible mecanismo que tiene una relación sinergética con la flora intestinal. Además menciona que cerca el 40% de los pacientes que han sido diagnosticados con giardiasis demostraron intolerancia a los disacáridos (como la lactosa), durante la etapa detectable de la infección, e incluso seis meses después cuando la infección ya no se puede detectar. Los casos crónicos en individuos inmunodeficientes y normales son particularmente resistentes al tratamiento por 26 Figura 4. Giardia invadiendo una seccion del intestine Darben (1996) 27 medicamentos, incluso en pacientes inmunodeficientes, la giardiasis puede disminuir el tiempo de vida. Faust et al (1974), aseguran que además de la invasión del duodeno, en ocasiones la vesícula biliar también puede ser invadida por Giardia lamblia y en éstos pacientes se pueden presentar asociados cólico biliar e ictericia, debido a la obstrucción al paso de la bilis. 3.2.1.6 Vías de transmisión Boreham (1987), enumera que los cuatro principales mecanismos de transmisión conocidos son: Contaminación oral fecal Depende de la edad y es probablemente la forma más importante de transmisión resultando en infección endémica. Contaminación directa comúnmente ocurre entre infantes, de hecho esto es lo que ha provocado muchas de las epidemias registradas en guarderías e instituciones. Polis et al (1986) y Steketee et al (1989), coinciden mediante dos casos de epidemias registradas en Wisconsin, en afirmar que es frecuente la contaminación de este tipo en infantes durante su estancia en las guarderías debido a prácticas deficientes de higiene y que las infecciones son bastante recurrentes. Algunas 28 medidas de farmacológico control mencionadas son: muestreo periódico y tratamiento para las personas que resulten infectadas (tanto niños, como personal), desinfección de los utensilios y extremadas medidas de higiene en el personal y el ambiente de trabajo incluyendo recolección de pañales usados y lavado adecuado de las manos. Transmisión venérea La giardiasis ha sido reconocida como un problema en homosexuales y personas involucradas en contactos oral-anales. Transmisión por medio del agua L a importancia del agua como vehículo de transmisión de quistes fue primeramente reconocida en 1970 y después se han analizado los brotes epidémicos surgidos en diferentes lugares. Las infecciones han sido adquiridas cuando los individuos consumen agua sin tratar, un agua ha sido tratada inapropiadamente o bien, se ha contaminado por algún motivo con agua de drenaje. Porter et al (1988), mencionan además que se tienen reportes de una epidemia de giardiasis ocurrida en el año de 1985 en Nueva Jersey, debida a la ingestión de agua de alberca contaminada con quistes de Giardia. Esto se debió a un accidente de los nadadores y a los bajos niveles de cloro, incluso de cero 29 durante el brote, por ello se recomienda un especial cuidado en los niveles de cloración en las albercas. Transmisión por medio de los alimentos E s evidente que con una pequeña cantidad de quistes, (10-25) puede causar una infección en el hombre, por lo que alimentos contaminados pueden ser una importante causa de enfermedad. Los quistes pueden llegar a los alimentos de múltiples maneras basadas en los malos hábitos de manejo y preparación. Casemore (1991), afirma que en algunos casos de giardiasis se ha tenido correlación con la adquisición de Cryptosporidium parvum, durante la ingestión de alimentos o agua contaminada. 3.3.1.7 Epidemiología Las mayores epidemias están asociadas con sistemas de agua contaminada, que no usan filtros de arena o que tienen un sistema deficiente de filtración. También se tienen reportados casos por ingestión de alimentos contaminados en menor escala. L a contaminación de Giardia, a través de agua contaminada es un problema de salud pública en muchos países. Wallis (1994), indica que epidemias causadas por lo anterior han sido registradas en numerosas provincias de Canadá 30 y British Columbia, con más de 1500 casos reportados anualmente. Boreham (1987), enumera algunos brotes epidémicos registrados en Estados unidos: • E n 1965 fueron reportados 123 casos de giardiasis en un ski resort de Aspen, Colorado, el motivo: cisternas con agua potable contaminadas con drenaje. • E n una epidemia en Roma, Nueva York en 1974-1975 estuvieron involucradas 4800 personas. S e encontró que el agua superficial usada para abastecer al pueblo estaba contaminada con desechos humanos no tratados. Dicha agua no era filtrada y el único tratamiento recibido era la cloración. • Dos epidemias más ocurrieron en lugares donde la filtración operaba en las plantas. Seiscientas personas residentes de Camas, Washington fueron infectadas en el año de 1986 por deficiencias en los filtros y los tratamientos de cloración. • Durante el brote epidémico ocurrido en Red Lodge, Montana se cree que hubo una fuerte descarga proveniente de las fosas sépticas con materia fecal humana o animal a la fuente de abastecimiento de agua a la ciudad. Dicha agua no recibía filtración y la cloración era deficiente. Kent et al (1988), analizan otro brote epidémico de giardiasis ocurrida en Pittsfield, Massachusetts en 1985, en donde se llevó a cabo un estudio epidemiológico analizando primero las fuentes de abastecimiento y clasificándolas como A , B y C . L a fuente C , se utilizaba únicamente cuando había problemas con 31 las otras dos fuentes. Durante el brote epidémico se vio que en esos días hubo necesidad de utilizar la fuente C , después de 3 años de no haberse usado y como comúnmente el agua recibía cloración, pero no era filtrada se realizaron análisis para detectar la presencia y cantidad de quistes, encontrándose que en las tres fuentes de almacenamiento había quistes, pero en mucho mayor número en la fuente C . Además ellos aseguran que en Estados Unidos las comunidades que poseen mayor riesgo de ser infectadas por giardiasis son aquéllas que poseen sistemas de filtración inadecuados. Stobbe y Reese (1996), ponen en duda la acción del cloro y ozono sobre Giardia, ya que puede resistir la concentración de 5 ppm que habitualmente se usa en los procesos de potabilización. Además mencionan que lo más conveniente es la combinación de la desinfección con la filtración. Boreham (1987), señala que la mayoría de las epidemias registradas han ocurrido cuando la cloración ha sido usada para desinfectar al agua, ya que a pesar de que el cloro mata a las bacterias coliformes, resulta insuficiente para matar a los quistes de Giardia. También mencionan que la efectividad del cloro para matar a los quistes puede depender de diversos factores como: turbidez del agua, pH, temperatura, tiempo de exposición, etc. (por ejemplo: se sabe que los halógenos son menos efectivos como desinfectantes en agua helada, sin embargo, los quistes sobreviven más tiempo en agua helada que en tibia). 32 La E P A (1998), establece algunas medidas que se han tomado para garantizar la seguridad del agua potable, como el Análisis de Micropartículas (Microparticulate Analysis, M P A ) . 3.3.1.8 Regulaciones El Departamento de Agua y Fuerza de los Angeles (1996), asegura que para agua potable, Giardia es regulada bajo la Ley para Tratamiento de Aguas Superficiales (SWTR). A pesar de que esta Ley no establece un nivel máximo de contaminantes para Giardia, dice que los tratamientos deben de remover o inactivar al menos 99.9% de Giardia. Le Chevallier (1991), establece que debido al incremento de epidemias de giardiasis ocasionadas por agua contaminada, en los Estados Unidos la Agencia de Protección al Ambiente (EPA), generó un documento denominado Regla para Tratamiento de Aguas Superficiales (SWTR), en Junio 29 de 1989. Dicha reglamentación indica que las aguas superficiales destinadas a consumo humano, requieren tratamientos de filtración y desinfección (se especifican también criterios para determinar si un sistema puede evitar la filtración), como una medida primaria para controlar a Giardia y virus entéricos; también establecen una turbidez menor o igual a 0.5 N T U o Unidades de Turbidez Nefelométrica para el 9 5 % de las muestras mensuales. Sin embargo en el estudio realizado se encontró que una baja turbidez en el agua no garantiza que el agua este libre de quistes de Giardia y/o ooquistes de Cryptosporidium, ya que en los lugares en donde se tuvieron 33 resultados positivos se tuvo una turbidez promedio de 0.19 N T U , en comparación con los lugares en donde se tuvieron resultados negativos con una turbidez promedio de 0.18 N T U ; por lo que se concluye que la medición de turbidez no es un buen indicador de la eficiencia de los tratamientos para potabilización de agua. 3.3.2 Cryptosporidium parvum E s un parásito patógeno que está causando problemas a nivel mundial sobre todo en pacientes con SIDA. Juranek (1998), afirma que Cryptosporidium parvum fue reconocido como un patógeno humano en 1976. De 1976 a 1982 raramente se reportaron casos a excepción de algunos pacientes con problemas inmunológicos. Sin embargo, a partir de 1982, el número de casos se incrementó en gran medida como parte de la epidemia de SIDA. Juranek y Navin (1984), Goldstein e r a / (1996) y Vakil et al (1996), citados por Guerrant (1997), establecen que de los primeros 58 casos de Cryptosporidiosis descritos en humanos en 1984, 40 (69%) fueron pacientes con deficiencias inmunológicas quienes contrajeron diarrea severa o irreversible; de esos 40 pacientes, 33 (83%) tenía SIDA; 5 5 % de 40 pacientes con deficiencias inmunológicas murieron. Casemore (1990), asegura que Cryptosporidium parvum ha sido reconocido en las últimas décadas como agente causal de parasitosis intestinal en el hombre con rangos de prevalencia entre el 1 y el 5% para países desarrollados y más de 34 10% en países en vías de desarrollo, estimándose para México que el 2.3% de los niños mayores de tres años sufren criptosporidiosis. Soave et al (1989), reportan haber encontrado ooquistes en la comunidad de Soledad, San Luis Potosí, en un 3 2 % de las muestras de heces recolectadas utilizando el método convencional de flotación con Sulfato de Zinc; además ellos afirman no haber encontrado ooquistes ni en agua de la llave, ni en leche. Díaz et al (1999), establecen a través de un primer estudio realizado en Sonora, que de 100 niños con diarrea al 23.2% se les detectó el parásito, mientras que en muestras de agua potable tomadas en Hermosillo, Sonora el 37% de las muestras contenía el parásito, lo que significa un riesgo potencial y podría tener un papel importante como vehículo de transmisión. 3.3.2.1 Clasificación Fayer et al (1997), aseveran que Cryptosporidium pertenece taxonómicamente al filo Apicomplexa, orden Eucoccidiorida, suborden Eimeriprina y familia Cryptosporidiidae. L a especie C. parvum infecta el intestino delgado en un grupo de mamíferos, incluyendo a los humanos y especies zoonóticas responsables de la Criptosporidiosis. A pesar de que muchas especies han sido descritas durante muchos años, es sabido que la mayoría de los casos reportados en mamíferos es responsabilidad de C. parvum. Bornay-Llinares et al (1999), coinciden que mientras algunas especies del género Cryptosporidium solo a un grupo de hospederos como Cryptosporidium 35 se limitan baileyi (que infecta pollos), otras especies de este género como Cryptosporidium parvum, infectan a un gran número de mamíferos que van desde ratones a humanos; ellos reportan a través de un estudio realizado en ganado vacuno en Polonia que pudieron diferenciar tres especies: C. felis, C. muris y C. parvum, a través de la observación del tamaño de los ooquistes y del análisis de las secuencias moleculares de una región del R N A . 3.3.2.2 Morfología La F D A (1997), describe a Cryptosporidium parvum como un parásito unicelular y a su vez, intracelular obligado. Ver Figura 5. Jawetz et al (1990), coinciden en que los parásitos son esferas intracelulares minúsculas (2 a 5 |xm), que se encuentran justamente debajo del epitelio mucoso del estómago o intestino. El trofozoíto maduro (esquizonte) se divide en ocho merozoítos que se liberan desde la célula original para empezar un nuevo ciclo. Pueden verse ooquistes que miden de 4 a 5 \im, que se cree son los agentes infecciosos, pues son evacuados en el excremento. 3.3.2.3 Habitat El Departamento de Recursos Naturales de Wisconsin (Bureau Drinking Water and Groundwater, 1996), explica que a Cryptosporidium se le puede encontrar en ríos, lagos y corrientes contaminadas con excremento animal o que 36 37 reciben aguas residuales. También comentan que los investigadores encontrado niveles de 5,000 ooquistes por litro en agua no tratada, han 1,000 ooquistes por litro de agua residual tratada y 2 a 112 oocytos por litro en ríos del oeste de los Estados Unidos. Además establece que en un estudio realizado en 1991 en los Estados Unidos, se encontró Cryptosporidium en 8 7 % del agua no tratada y en 2 7 % de agua tratada proveniente de ríos y lagos. Casemore et al (1997), establecen que Cryptosporidium parvum es predominantemente un parásito de animales neonatos. Blagbum Cryptosporidium y Soave (1997), señalan que en los Estados Unidos empieza a ser un problema en aguas superficiales en la mayoría de las áreas de Norteamérica, sobre todo en marzo y junio cuando las lluvias caen y muchos animales neonatos están presentes para aumentar el número de ooquistes. Sin embargo Casemore (1991), indica que además de que pueden influir las épocas de lluvia, también tienen influencia prácticas como pastoreo y aplicación de abonos orgánicos como estiércol y que las epidemias que se han presentado, se deben a muy diversas causas, que no se han podido establecer con exactitud. Los animales mamíferos que contribuyen al número de ooquistes en áreas urbanas, pueden ser: rumiantes, gatos, perros, cerdos y otros mamíferos. 38 3.3.2.4 Ciclo vital Flanigan (1994), indica que la infección por Cryptosporidium en el humano inicia por un ingestión del ooquiste y una subsecuente exquistación o liberación de cuatro esporozoítos a través de una hendidura que se abre a lo largo de una comisura en la pared del ooquiste; la comisura es una especie de grieta que se extiende desde un polo hasta un tercio de la mitad de la circunferencia del ooquiste, al debilitarse la comisura por efecto de las enzimas producidas por este organismo, se separan los márgenes y se forma una abertura a través de la cual se escapan los esporozoítos, esto en la superficie del tracto gastrointestinal. Los esporozoítos inmediatamente se adhieren y penetran las células epiteliales y se desarollan hasta esquizontes en la superficie del epitelio. Después de la implantación el esporozoíto se desarrolla hasta trofozoíto y después a un esquizonte que contiene ocho distintos merozoítos. Los merozoítos de los esquizontes pueden reiniciar esquizongenia o entra hacia una fase sexual del ciclo y desarrollarse como gametocitos. La fertilización de los microgametocitos y macrogametocitos, resulta en el desarrollo de ooquistes, los cuales pueden ser excretados hacia el ambiente, donde pueden ingresar a otros huéspedes. 39 3.3.2.5 Patología Jawetz et al (1990), afirman que Cryptosporidium reside en el borde en cepillo, dentro de la membrana exterior limitante de las células epiteliales de la mucosa del aparato digestivo, en especial en la superficie de las vellosidades del intestino delgado inferior. El aspecto clínico prominente de la criptosporidiosis es la diarrea leve que cura sola (una a dos semanas) en personas normales, pero que puede ser grave y prolongada en las personas con alteraciones de la inmunidad o muy jóvenes o muy viejas. Medema et al (1995), efectuaron un análisis de riesgo para infecciones por Cryptosporidium vía agua potable. E s posible estimar el riesgo de infección por este y otros patógenos, además se puede estimar la dósis-respuesta; sin embargo ellos señalan que hay factores de inseguridad como grupos de población con problemas en su sistema inmunológico y la infección por diferentes variedades de Cryptosporidium parvum. Butler y Mayfield (1996), indican que los síntomas de la criptosporidiosis incluyen abundante diarrea acuosa, malestares abdominales, náusea y fiebre ligera (<39 °C). L a Universidad de Waterloo (1998), establece que los síntomas aparecen entre una y dos semanas después de la exposición, a pesar que los períodos de incubación pueden ser tan cortos como dos día; además establece que algunos pacientes pueden resultar asintomáticos, osea personas que poseen ooquistes en sus heces, pero que nunca han mostrado síntomas de enfermedad. 40 Chalmers et al (1995), afirman que Cryptosporidium es capaz de causar estos síntomas a cientos de personas en una sola vez, debido a la ingestión por agua contaminada. Fewtrell y Delahunty (1995), comentan que en un estudio realizado en el Reino Unido, más del 3 0 % de la gente infectada reportó un contacto previo con animales de campo; además tres cuartos de la muestra para el estudio eran chicos menores de 10 años. En este sentido establecen que la educación en salud para prevenir riesgos, puede ser un factor muy importante. 3.3.2.6 Vías de transmisión Fayer et al (1997), establecen que las mascotas y los animales de granja puede ser importantes fuentes de infección, esto a pesar de que pocas infecciones han sido reportadas como zoonoticas, sin embargo animales de laboratorio si han sido implicados. Los viajeros que beben agua del grifo han resultado infectados como resultado de que los ooquistes en algunas ocasiones escapan a los filtros y a los desinfectantes comunes. El emplear esta agua en la preparación de alimentos puede contribuir a la transmisión de Cryptosporidium, como podría ser el consumo de leche inadecuadamente pasteurizada. Otros casos comunes son las personas que trabajan con otras personas infectadas. Importantes reservónos de infección pueden ser personas con excreción persistente después de la desaparición de los síntomas clínicos o portadores 41 asintomáticos. El intervalo entre la exposición y la manifestación clínica de la enfermedad varía entre 5 a 21 días. La dosis infectiva ha sido calculada menor a 1 ooquiste. Atwill et a/(1997), reportan en un estudio realizado con puercos silvestres que los ooquistes de Cryptosporidium parvum y los quistes de Giardia lamblia, pueden contaminar el agua a través de las heces de estos animales y también observaron que los grupos que aportaron mayor número de ooquistes y quistes fueron aquéllos con puercos más jóvenes (con 8 meses de nacidos o menos) y aquéllos con mayor densidad de puercos (más de 2 puercos por kilómetro cuadrado). 3.3.2.7 Epidemiología L a F D A (1997), asegura que desde 1984 Cryptosporidium ha sido asociada con epidemias de diarrea en guarderías de todos los Estados Unidos y Canadá. Además establece que durante 1987 una epidemia por agua contaminada en Georgia fue el primer caso registrado en el que el sistema de agua municipal cumplía con todos los estándares federales y estatales. Sin duda, el foco de alerta fue la epidemia registrada en Milwaukee en 1993. Milwaukee es la ciudad más grande del estado de Wisconsin con una población de aproximadamente 630,000 habitantes y está situada al lado oeste de el Lago Michigan. El agua potable es suministrada a través de Milwaukee Water 42 Works (MWW), el cual tiene dos plantas de tratamiento, una en el norte y otra en el sur de la ciudad. Ambas plantas obtienen el agua de el Lago Michigan. El 5 de abril de 1993, el Departamento de Salud de Wisconsin fue notificado acerca de un sustancial incremento en el número de personas ausentes al trabajo a causa de enfermedades gastrointestinales en la región de Milwaukee. S e inició una investigación epidemiológica el 7 de abril, detectándose ooquistes en las heces de 7 habitantes. Addis era/(1995), aseguran que la epidemia aparece como la suma de varios eventos. Primeramente durante esa primavera, hubo muchas lluvias, lo que s e traduce en niveles más altos de lo nomal de materia orgánica que incluía estiércol, proveniente de corrientes que habían sido derramadas a los ríos que desembocaban al Lago Michigan. Asumiendo que los ooquistes entraron al Lago por esos ríos, las corrientes naturales del Lago y los vientos de marzo, favorecieron su transporte hacía la planta de tratamiento sur, en lugar de la dispersión a través del Lago. 3.2.2.8 Regulaciones Addis et al (1995), establecen que debido a la magnitud de la epidemia de Milwaukee, Wisconsin y a su asociación con una operación de la planta municipal de agua sin los estándares estatales y federales, se incrementó el interés de la gente por conocer la calidad del agua en los Estados Unidos. Además se vio la necesidad de coordinar a las agencias de salud pública y los servicios de agua potable y redoblar esfuerzos para desarrollar estándares Cryptosporidium en agua potable. 43 reguladores para Casemore (1991), indica que los ooquistes son resitentes a una gran variedad de desinfectantes incluyendo cloro en dosis altas; además los ooquistes son susceptibles al congelamiento, a temperaturas de aproximadamente 65°C entre 5 a 20 minutos y a secado. Las radiación ultravioleta también puede tener algún efecto, pero menor que las bacterias o levaduras, en condiciones similares de exposición. El ozono y el dióxido de cloro han sido reportados para matar ooquistes. The Enhanced Surface Water Treatment Rule (ESWTR) que incluirá a Cryptosporidium y regulará más ampliamente a Giardia, se estableció en diciembre de 1996. Los abastecimientos de agua deberán cumplir con ésta regulación en julio de 1998. El Departamento de Recursos Naturales de Wisconsin (Bureau Drinking Water and Groundwater, 1996), informa que a partir de junio de 1993 se han tomado requerimientos federales más exigentes para turbidez en el tratamiento del agua potable. Los operadores de las plantas deberán probar más frecuentemente la turbidez y deberán ser más estrictos. Butler y Mayfeld (1996), coinciden en que las regulaciones en Estados Unidos deberán incluir estándares para Cryptosporidium. Actualmente una guía de la American Waters Works Association sugiere que el agua potable contenga 0.5 unidades de turbidez nefelométrica (NTU) y que se ponga una meta de 0.1 N T U . 44 Carrington y Smith (1995), indican recientemente que no existe el mismo interés en detectar ooquistes de Cryptosporidium en agua, en otros países además de Estados Unidos y Reino Unido. Los pocos estudios siguen los patrones establecidos por Reino Unido y el problema es que las detecciones se hacen por solo un tiempo y con pocas muestras recolectadas de un gran número de sitios. 3.4 Detección de Giardia y Cryptosporidium en agua potable 3.4.1 Metodología Los métodos para la identificación de protozoos no están bien normalizados y deben ser considerados como procedimientos de investigación susceptibles de modificación. American Public Health Association et al (1992), aseguran que el análisis de agua para buscar quistes de Giardia exige concentración, purificación, detección e identificación. L a concentración se ha hecho por medio de filtros de arena, membrana o espesor microporoso. S u purificación y separación de detritus extraños s e consigue normalmente mediante técnicas de flotación con soluciones de sulfato de zinc, sacarosa o citrato de potasio. La detección e identificación se basan en el estudio microscópico de los concentrados purificados con técnicas de tinción cromogénicas o de anticuerpos fluorescentes y en criterios morfológicos. 45 Le Chevallier et al (1990), comparan las técnicas de inmunofluorescencia con la flotación con sulfato de zinc y posterior observación con Lugol y establecen que: la inmunofluorescencia puede detectar más parásitos en agua que la técnica del sulfato de zinc-Lugol y que incluso puede ser utilizada como parámetro para evaluar la eficiencia de filtración; además que el empleo de kits comerciales conteniendo anticuerpos monoclonales específicos para Giardia y Cryptosporidium son recomendables para el análisis de estos parásitos en agua. 3.4.1.1 Muestreo Al tomar la muestra, el agua tiene que pasar a través de un filtro en donde quedarán retenidos los quistes y ooquistes. Watkins et al (1994), mencionan que la eficiencia de la filtración puede variar de un filtro a otro, usando un restrictor de flujo. L a cantidad de agua muestreada dependerá de su calidad y/o procedencia. 3.4.1.2 Concentración y purificación Después de la filtración y purificación del material concentrado, es removido del filtro a contraflujo. Después de esto es común tener un volumen aproximado de 4 litros de agua, los cuales son concentrados por centrifugación. Smith (1994), indica que la concentración sólo por tamaño produce la acumulación de una gran 46 variedad de otras partículas grandes y extrañas que interfieren con la detección. La separación de los quistes de otras partículas puede darse por flotación, formándose una interfase. 3.4.1.3 Identificación L a detección de ooquistes de Cryptosporidium y quistes de Giardia generalmente se realiza al microscopio. Sin embargo, esto requiere de gran habilidad y experiencia del técnico para no confundir a los parásitos con otro material en el campo microscópico. Ver Figura 6. S e han desarrollado nuevas técnicas que han incrementado en gran medida la eficiencia de la determinación. 3.4.1.3.1 Inmunofluorescencia Collins y Lyne (1989), establecen que las proteínas pueden marcarse con anticuerpos fluorescentes por combinación química sin alteración, ni interferencia con las propiedades biológicas o inmunológicas de las proteínas. Dichas proteínas pueden verse después en preparaciones microscópicas por microscopía de fluorescencia. L a Universidad de Waterloo (1998), afirma que cuando se tratan de detectar quistes y ooquistes en grandes volúmenes de agua, numerosas partículas 47 Figura 6. Ooquistes de Cryptosporidium parvum junto con quistes de Giardia lamblia, juntos para fines de comparación. Lindquist (1998) extrañas pueden hacer la identificación imposible. Pero también afirma que el uso de ensayos con Inmunofluoresceína eliminan esta dificultad debido a su especificidad y facilidad de aplicación. García y Shimizu (1997), informan que los procedimientos basados en reacciones inmunológicas aumentan para la detección la sensibilidad y especificidad en de Giardia y comparación Cryptosporidium, a los métodos convencionales. Ellos analizaron nueve kits de diagnóstico, tres de ellos muestran un 100% de sensibilidad y especificidad. Sin embargo mencionan que son varios los factores (además de la sensibilidad y la especificidad) que influyen para la selección del kit comercial: costo, sencillez, facilidad de interpretación de resultados (color, intensidad de la fluorescencia, equipo, entre otros). 3.4.1.3.2 Reacción en cadena de la polimerasa Kaucner y Stinear (1998), reportan que además de detectar quistes de Giardia y ooquistes de Cryptosporidium parvum a través de P C R , se pueden obtener excelentes resultados en establecer la viabilidad de dichos quistes y ooquistes, ellos realizan una comparación con pruebas realizadas con inmunofluorescencia y alcanzaron mayores niveles de detección. Drake (1995), afirma que Perkin Elmer C o . de Norwalk Connecticut ha anunciado que desarrollará pruebas del DNA, usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar parásitos en agua que causan problemas en 49 humanos. L a ventaja de este kit para Giardia y Cryptosporidium es que será muy factible, ya que es muy rápido y representa un tiempo mucho menor que otras pruebas convencionales. El uso de P C R es común en pruebas de laboratorio relacionadas con el medio ambiente, porque tiene la habilidad de detectar patógenos rápida y objetivamente en presencia de altas concentraciones de otros organismos. Sin embargo presenta la desventaja de que el equipo es muy caro, aún para equipar un pequeño laboratorio de análisis de agua. 3.4.1.3.3 Métodos de detección basados en las propiedades biofísicas o bioquímicas Smith (1994), establece que cuando los microorganismos se exponen a corrientes eléctricas, se producen interacciones moleculares con frecuencias eléctricas únicas que pueden ser caracterizadas. El uso de dielectroforésis y electrorotación, ambas basadas en el movimiento a través de corrientes eléctricas han sido usadas para identificar, concentrar y asignar el nivel de viabilidad de los quistes y ooquistes. Ambas dependen de las propiedades relativas de conductividad de la partícula que son como una "huella digital" para cada organismo. Rochelle et al (1999), indican que la separación inmunomagnética (IMS), con anticuerpos, partículas paramagnéticas y concentración magnética, proporciona una alternativa. Las células capturadas con IMS están asociadas con una superficie sólida la cual puede estar asociada con una capa de sobrenadante 50 que es removida con muchos lavados; por lo tanto, la técnica puede efectivamente eliminar o reducir enormemente la concentración de sustancias que después pueden inhibir o ser tóxicas para las células buscadas. Ellos compararon dos kits comerciales obteniendo eficiencias de 62 a 100% en un kit y de 34 a 74% en el otro, dependiendo estas eficiencias básicamente del mecanismo de agitación durante el procedimiento de captura magnética. Además mencionan que los ooquistes de Cryptosporidium parvum obtenidos por este método retienen su infectividad, comprobando esto a través del empleo de la técnica de P C R . 3.4.1.4 Prueba de viabilidad Pérez (1999), afirma que ya que los quistes son la forma usual infectiva, es sumamente importante saber si s e encuentran viables o no. L a infomración de la viabilidad de una población de quistes es necesaria para los estudios de desinfección quistica y en la valoración del riesgo de fuentes de agua potable contaminadas. C o m o lo reportado por Isaac-Renton et al (1996), quienes encontraron al efectuar un estudio de viabilidad mediante un modelo animal que la viabilidad puede decrecer después de un tratamiento de cloración. Aguilar (1997), realizó una modificación a lo propuesto por Campbell et al (1992), usando loduro de propidio (IP), molécula polar que puede penetrar únicamente la membrana de células dañadas o muertas, intercalándose en su DNA y RNA , en combinación con la técnica de inmunofluorescencia; observándose los quistes y ooquistes no viables de color rojo brillante. 51 4. METODOLOGIA 4.1 Prueba de eficiencia El procedimiento de recolección de quistes y ooquistes puede variar según la habilidad del analista. Por ello fue necesario realizar la prueba de eficiencia, para la cual se realizó primero inoculando 10 mi de una suspensión con una 5 cuenta aproximada de 10 de quistes de Giardia por mi, en 200 mi de agua. Enseguida se tomaron 10 mi del homogeneizado y se pasaron por la membrana y s e le aplicaron los anticuerpos para su detección, observación y conteo al microscopio. El resto de la suspensión se aplicó a 120 litros de agua bidestilada y se pasó por el filtro de propileno (como si se estuviera tomando una muestra de cualquier llave). S e siguió el procedimiento de elución, filtración y detección de quistes y se contó el total de quistes encontrados en la membrana. 52 Para sacar el porcentaje de eficiencia se tomó como 100% el número de quistes presentes en la primera membrana y de ahí se obtuvo el porcentaje equivalente al número de quistes en la segunda membrana. El mismo procedimiento se aplicó para obtener el porcentaje de eficiencia en la recolección de ooquistes. 4.2 Muestreo El estudio realizado en Ciudad Obregón, Sonora se elaboró con base en el área que abastece el Organismo Operador de Agua Potable, Alcantarillado y Saneamiento de Cajeme ( O O M A P A S ) se seleccionaron colonias de la zona abastecida por las plantas potabilizadoras 1 y 2 y colonias de la zona abastecida por las plantas potabilizadoras 3 y 4. Dichas colonias fueron aquéllas que tiene registradas el Organismo Operador como puntos de muestreo para verificar la calidad del agua potable. S e realizaron cuatro recorridos de muestreo en los meses de junio y julio de 1999, que es cuando en la región empiezan las primeras lluvias, según lo recomendado por Hutton et al (1995) quienes indican que es cuando hay mayor probabilidad de encontrar quistes y/o ooquistes. Durante el primer recorrido, realizado en los días 11 al 13 de junio de 1999 se tomó una muestra en el tanque 53 de almacenamiento de las plantas potabilizadoras 1 y 2 y otra en el tanque de almacenamiento de las plantas potabilizadoras 3 y 4, esto para tratar de identificar de alguna manera donde estaba la fuente de quistes y/o ooquistes. Además se tomaron muestras en tomas de agua domiciliarias en las colonias: Villa Itson, Matías Méndez, Real del Sol, Primero de Mayo, Benito Juárez y Campestre. Durante el segundo recorrido, realizado en los días 20 al 22 de junio de 1999 se tomaron muestras domiciliarias en las siguientes colonias: Villa Fontana, Municipio libre, Centro, Constitución, Sochiloa, Gamesa, Miravalle y Del Valle Después de analizar dichas muestras, resultados negativos (ausencia de quistes y ooquistes) llevaron a realizar una segunda repetición, durante el tercer recorrido. Resultados positivos a continuar el recorrido en otras colonias diferentes. Durante el tercer recorrido, realizado en los días 2 al 4 de julio de 1999, se repitió el muestreo en el tanque de las plantas potabilizadoras 3 y 4 y en muestras domiciliarias de las colonias: Constitución, Del Valle, Primero de Mayo, Gamesa, Benito Juárez y Sochiloa. Además de nuevos muéstreos en tomas domiciliarias de las colonias: Villa California, Bellavista y México. Después de analizar dichas muestras, resultados negativos en las muestras tomadas por segunda ocasión , llevaron a realizar una tercera repetición durante el cuarto recorrido; resultados negativos en las colonias muestreadas por 54 primera vez en el tercer recorrido llevaron a realizar una segunda repetición y resultados positivos a continuar el recorrido en otras colonias. Durante el cuarto recorrido, realizado en los días 13 y 14 de julio de 1999 se repitió el muestreo en las tomas domiciliarias de las colonias: Sochiloa y Benito Juárez y s e realizaron nuevos muéstreos en las colonias: Cumuripa, Fovissste y 200, Algodones-Nuevo Palmira y Ladrillera. S e procesaron y analizaron un total de 32 muestras, que representan todos los sectores absastecidos en el área de Ciudad Obregón. 4.3 Recolección de la Muestra Musial et al (1987), recomiendan el empleo de filtros de polipropileno para recolección de muestras; por lo que se utilizaron filtros de este material de 10 pulgadas de longitud y con poro nominal de una miera (Micro-Wynd II, modelo 3 M S 1 . A M F - C u n o , Meriden Conn, USA). Todo el equipo (Anexo 1), recibió un tratamiento previo que consistió en sumergirlo en una solución de hipoclorito de sodio 10-15 mg/l por 30 minutos y después se enjuagó con agua bidestilada. S e procedió a conectar el extremo de la manguera con una entrada para llave de jardín al medidor de velocidad de flujo y el otro extremo a una manguera 55 con entrada especial para el portafiltro, asegurándose de que no existan fugas en las conexiones. S e dejó correr el agua por 5 minutos aproximadamente para arrastrar material adherido en las tuberías. Enseguida se colocó el filtro dentro del portafiltro, se colocó el cabezal y se cerró fuertemente. S e conectó a la entrada que venía de la toma a la parte marcada como "IN" en el portafiltro, se abrió la llave y se anotó la lectura inicial. Aquí fue importante verificar que el flujo estuviera entre 15 a 35 litros por minuto. El agua filtrada salió por la parte "OUT" y como se tomaron muestras de 1000 litros para una mayor precisión en los resultados y para tener la seguridad de detectar concentraciones bajas de quistes y/o ooquistes, se buscó aprovechar esa agua en el riego de jardines. En las tres muestras tomadas en los tanques de almacenamiento no hubo problemas, pues el Organismo Operador instaló llaves para su muestreo interno. Una vez terminado el muestreo se procedió a transportar los filtros en bolsas de plástico (triple) cerradas con ligas de hule y en hieleras con suficiente hielo para ser procesados en el Laboratorio de Microbiología del Edificio de Ciencia de los Alimentos en el Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A . C . , en Hermosillo, Sonora. 56 4.3.1 Determinación in situ de cloro libre residual y pH Durante cada muestreo se procedió a realizar una determinación colorimétrica de cloro libre residual y pH, utilizando un kit ( Blue Devil TK-20 Pool and S p a 2-way test kit) con un rango de 0.4 a 3.0 ppm para cloro y 6.8 a 8.2 para pH. 4.3.2 Determinación de parámetros fisicoquímicos De manera adicional a las determinaciones de cloro libre residual y pH, la gerencia de control de calidad de O O M A P A S de Cajeme proporcionó los valores de los parámetros fisicoquímicos: turbidez, temperatura, dureza, cloruros; para las muestras analizadas. Dichos parámetros fueron determinados mediante las siguientes metodologías, recomendadas por la A P H A (1992): • Turbidez. Nefelómetro. • Dureza. Por titulación con EDTA. • Cloruros. Por el método de Demohr. 4.4 Tratamiento de la Muestra Para recuperar los quistes y ooquistes se realizaron tres pasos. Los procedimientos de preparación para cada una de las soluciones empleadas se encuentran en el Anexo 2. 57 4.4.1 Elución de quistes y ooquistes Primero se preparó una solución con 2700 mi de agua destilada y 5 mi de Tween 80, para llenar el presurizador. Enseguida el presurizador se tapó y se conectó al tanque de nitrógeno. El portafiltros se conectó al presurizador por la parte "OUT", para producir la contracorriente que despegó a los quistes y ooquistes del filtro, a una presión de 15 psi. El agua que salió se recolectó en un recipiente grande. Después se removió el filtro del portafiltro y se colocó en papel aluminio para cortarlo con la ayuda de una navaja previamente esterilizada. Los trozos de filtro se fueron remojando en el recipiente conteniendo el agua de lavado, hasta llegar a la parte interna del filtro. Enseguida s e deshebraron y estuvieron agitando manualmente por espacio de veinte minutos. 4.4.2 Concentración del eluído Después de agitar se colocó el eluyente en botellas para centrifuga con capacidad para 500 mi, s e exprimió el filtro y se desechó. Las botellas llenas se balancearon y fueron centrifugadas a 2500 rpm durante 10 minutos. 58 C o n la ayuda de una bomba de vacío se aspiró el sobrenadante y se juntó el sedimento en una sola botella, para repartirlo en tubos para centrífuga de 50 mi y volverlo a centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos. S e aspiró el sobrenadante y se determinó el tamaño del sedimento, para después dividirlo en dos (un volumen para Giardia y otro para Cryptosporidium). Cuando las muestras requirieron ser almacenadas para su análisis posterior se tuvo que agregar 4 veces el volumen del sedimento de formalina al 10% en el caso de identificación de quistes de Giardia y 4 veces el volumen del sedimento de dicromato de potasio al 2.5% en el caso de identificación de ooquistes de Cryptosporidium. Una vez agregadas las soluciones, se agitaron los tubos con ayuda de un vortex y se guardaron en el refrigerador con su identificación correspondiente. 4.4.3 Clarificación y/o flotación de la muestra Los sedimentos que fueron almacenados con las soluciones de formalina y dicromato requirieron de un tratamiento previo para eliminar dichas soluciones que consistió en llenar los tubos con agua destilada hasta la marca de 50 mi y centrifugación a 2500 rpm por 10 minutos. Enseguida se eliminó el sobrenadante. Para los sedimentos que no recibieron soluciones y para los que si recibieron, después de el lavado se continuó resuspendiéndolos en tres veces el volumen de la muestra original en una solución de SDS/Tween 80 al 1 %. 59 Enseguida se encendió el baño ultrasónico y se calentó por 5 minutos para sonicar las muestras por 4 minutos. S e prepararon las soluciones de flotación: Solución de Sheaters 4/5 para la primera flotación de Cryptosporidium y solución de Sheaters 3/5 para la segunda flotación. Para Giardia se utilizó solo una flotación con una solución de citrato de potasio al 52%. Ambas soluciones se agregaron en relación 3:1 deslizándolas lentamente por las paredes del tubo. Luego se procedió a centrifugar: Para las dos flotaciones de Cryptosporidium, 2500 rpm por 10 minutos cada una. Para Giardia, 1600 rpm por 2-3 minutos. Después de la centrifugación se colectó el sobrenadante en la capa superior de la inferíase hasta 10 mi con una pipeta, mientras que el sedimento se descartó. Dicho sobrenadante s e lavó con agua destilada en una relación 1:4 y se centrifugó a 2500 rpm por 10 minutos. Posteriormente se aspiró el sobrenadante sin desbaratar el sedimento. S e combinaron los sedimentos de la misma muestra, usando el eluyente para lavar las paredes y el tapón del bote. S e pusieron en un tubo de 50 mi y si el volumen no fue de 5 mi, se llevó a 5 mi con agua destilada, si fue mayor, fue necesaria una segunda centrifugación a 2500 rpm por 10 minutos. 60 E n situaciones especiales, como cuando la muestra está muy sucia puede ser necesaria una segunda flotación, la cual debe realizarse con sumo cuidado pues afecta la recuperación de los quistes y ooquistes. 4.5 Filtración en membrana de la muestra El procedimiento de inmunodetección utiliza el principio de inmunofluorescencia indirecta. L a muestra ambiental preparada es incubada con anticuerpos monoclonales de ratón dirigidos contra los componentes antigénicos de la superficie de quistes de Giardia y ooquistes de Cryptosporidium. La muestra es enjuagada e incubada por segunda vez con anticuerpos anti-ratón conjugados con isotiocianato de fluoresceína. Este conjugado unirá a las inmunoglobulinas de ratón que ha permanecido como resultado de una reacción específica con quistes de Giardia u ooquistes de Cryptosporidium. El conjugado no unido es enjuagado y retirado y las preparaciones son examinadas utilizando un microscopio de epifluorescencia, para reconocer a los organismos que muestren el típico color verde manzana y la morfología característica de los quistes de Giardia y los ooquistes de Cryptosporidium. Una vez que se concentra y clarifica la muestra se procedió a su filtración en membranas de nitrocelulosa. Para ello se utilizaron los portafiltros previamente lavados con bactericida, agua destilada y esterilizados. Para ello se ensamblaron de la siguiente manera: primero se colocó la tapa en la base, luego se colocó un 61 anillo plástico, enseguida una malla de acero inoxidable, después el filtro (con poro de 5 |i para Giardia y de 1.0 u para Cryptosporidium) y enseguida otro anillo plástico. Todo esto se realizó con sumo cuidado y con la ayuda de pinzas, que también necesitaron ser esterilizadas como los portafiltros. Posteriormente se inyectó la muestra con una jeringa desechable nueva en una cantidad de 2 mi. El orificio del filtro fue cubierto después con parafilm para R agregar tres gotas de anticuerpos primarios ( kit Hydrofluor-combo de Meridian , para ambos parásitos). S e dejaron reposar a temperatura ambiente y cubiertos de la luz por 30 minutos. Transcurrido este tiempo se lavó la muestra con entre 5 y 10 mi de P B S , usando una jeringa y nuevamente se cubrió el orificio con parafilm para agregar tres gotas de anticuerpo secundario (proveniente del mismo kit), dejándose reposar por 30 minutos a temperatura ambiente y cubiertos de la luz para evitar que ésta afecte a los anticuerpos. S e enjuagó nuevamente con entre 5 y 10 mi de P B S , aplicados con ayuda de una jeringa. Cabe mencionar que los anticuerpos y a vienen marcados con isotiocianato de fluoresceína. Para determinar la viabilidad de quistes y ooquistes se procedió a aplicar 3 gotas de loduro de propidio, se cubrió la muestra y se incubó por 30 minutos a 37 °C. Enseguida s e enjuagó con entre 5 y 10 mi de P B S . Además se aplicó 1 mi del colorante azul de Evans al 0.002% y se dejó reposar entre 10 y 15 minutos, esto con el fin de lograr una mejor apreciación de los quistes y ooquistes. S e enjuagó con agua destilada. 62 C o n una pinza se quitó muy delicadamente la membrana del portafiltros y se colocó sobre un portaobjetos, agregándose una gota de PBS/glicerol para fijarla y encima se le puso un cubreobjetos. Después se almacenó en una caja de Petri envuelta en papel aluminio (para protegerla de la luz) y se guardó en el refrigerador. 4.6 Identificación y cuantificación de quistes y ooquistes S e realizó un recorrido completo de la preparación en la membrana de filtración utilizando un microscopio de Epifluorescencia de la marca Olympus BH2, con el objetivo 40 X y con luz azul. Los quistes fueron diferenciados por su forma oval y su tamaño mayor que el de los ooquistes que mostraron una forma más esférica. Además ambos mostraron el color verde manzana. 4.7 Viabilidad de quistes y ooquistes Ongerth et al (1989) mencionan dos caminos para distinguir a los quistes viables y a los quistes y ooquistes no viables. Para distinguir a los quistes y ooquistes viables es posible usar diacetato de fluoresceína que hace que se vean de un verde fluorescente, únicamente si estos están vivos. Para distinguir a los 63 quistes y ooquistes no viables se utiliza el ioduro de propidio o bromuro de etidio que son absorbidos y se ven de un rojo fluorescente. Para determinar la viabilidad de los quistes y ooquistes presentes en la muestra s e aplicó durante el proceso de filtración en membrana el colorante ioduro de propidio que tiñe de rojo a los quistes y ooquistes no viables, éstos se hacen visibles cambiando el filtro de la luz del microscopio a luz verde. Para determinar el número de quistes y ooquistes viables se efectuó una resta entre los quistes y ooquistes totales menos los no viables. 4. 8 Análisis estadísticos C o n los datos obtenidos se realizaron análisis estadísticos, utilizando para ello el paquete computacional J M P IN 3.2.1 en su versión estudiantil, con el cual se realizó primero estadística descriptiva, enseguida se efectuaron correlaciones de Pearson y por último una regresión lineal múltiple por el método de mínimos cuadrados para cada una de las variables de interés, seleccionando el mejor modelo de predicción en base al incremento de la R cuadrada y a la disminución en el cuadrado medio del error, para lo cual fue necesario eliminar del modelo aquéllos términos que tuvieran menor significancia. 64 5. RESULTADOS Y DISCUSION S e realizaron las pruebas de eficiencia para cada parásito, obteniéndose una eficiencia del 8 2 % en la recuperación de quistes de Giardia lamblia, la cual se realizó al inicio del experimento y una eficiencia del 5 9 % en la recuperación de ooquistes de Cryptosporidium experimento. parvum, que se realizó durante la segunda mitad del E s importante señalar que estas eficiencias resultaron muy buenas en el procesamiento y cuantificación de quistes y ooquistes presentes en las muestras, comparadas con Cryptosporidium las reportadas por Aguilar (1997) que para se tuvo una eficiencia promedio del 15.24%, por Hansen y Ongerth (1991) que tuvieron una eficiencia del 26.2% y por Hutton era/(1995) que señalan una eficiencia promedio del 3 3 % para Cryptosporidium y del 5 0 % para Giardia. Mientras que entra en los rangos reportados por Rose et al (1991b) que fueron del 29 al 5 8 % y por Musial et al (1987) que tuvieron una eficiencia entre el 12 y 8 5 % . Adicionalmente Musial ef al (1987) reportan que hay pérdida de quistes y ooquistes en cada una de las fases de ésta técnica y depende de la habilidad de cada analista, la eficiencia del proceso. Este porcentaje de eficiencia no se tomó 65 Figura 12. Distribuciones para Quistes totales y Quistes viables en las 32 muestras analizadas. Quistes totales Quistes viables 73 en cuenta a la hora de analizar los resultados, puesto que hubiese sido necesario correr un número considerable de muestras control para cada parásito y realizar una análisis de regresión lineal, lo que no se encontraba en los objetivos de este estudio y se utilizaron los porcentajes de eficiencia solo como una referencia. Además de que con las eficiencias registradas se encontraron quistes y ooquistes en un alto porcentaje de los puntos de muestreo, lo que lleva a establecer que hay una mayor cantidad de la que se reporta. De las Cryptosporidium 32 parvum muestras analizadas se encontraron ooquistes de en el 69% de ellas y quistes de Giardia lamblia, ver Figuras 7 y 8, en el 2 5 % ellas. Esta relación es similar a la establecida por Rose et al (1991) quienes tomaron muestras de agua en 17 estados de la Unión Americana y encontraron ooquistes de Cryptosporidium en un 5 5 % de las muestras y quistes de Giardia lamblia en un 16%. Mientras que Grimason et al (1995) reporta la presencia de Giardia en solo un 19% de 26 muestras analizadas en Escocia. Un detalle importante a señalar es que para el caso de Cryptosporidium, existe el antecedente de un trabajo similar realizado en el mismo estado de Sonora por Díaz et al (1999), en el que se encontraron ooquistes en el 3 3 % de las muestras analizadas. Lo que implica que en Ciudad Obregón existe un riesgo potencial mayor. Cabe mencionar que esto concuerda con lo reportado por Rose et al (1991 b), quienes afirman que hay es posible encontrar un mayor número de quistes y ooquistes en aguas superficiales que en agua proveniente de pozos, ya 66 Figura 7. Quistes de Giardia lamblia observados en el control positivo. 67 Figura 8. Quistes de Giardia lamblia observados en una de las muestras analizadas. 68 que Ciudad Obregón se abastece de agua superficial únicamente y Hermosillo a través de una combinación entre agua de pozos y superficial. En las Figuras 9 y 10 se realiza una comparación gráfica entre el número de ooquistes y quistes totales encontrados en las muestras de las diferentes colonias y donde se puede apreciar claramente como hay un predominio de ooquistes de Cryptosporidium parvum sobre los quistes de Giardia lamblia, similar a lo encontrado por Le Chevallier et al (1991) y Díaz et al (1999), quienes encontraron un mayor número de ooquistes en muestras de agua potable filtradas, es decir con un tratamiento similar de potabilización al realizado en Ciudad Obregón. 5.1 Análisis estadístico Primero se obtuvieron las medias y desviaciones estándar para ooquistes totales y viables y para quistes totales y viables. Así mismo, se realizaron las distribuciones para dichos parámetros, las cuales se muestran en las figuras 11 y 12. 69 Figura 9. Ooquistes y quistes totales encontrados en las colonias abastecidas por las plantas potabilizadoras 1 y 2. • Figura 10. Ooquistes y quistes totales encontrados en las colonias abastecidas por las plantas potabilizadoras 3 y 4. Figura 11. Distribuciones para Ooquistes totales y Ooquistes viables en las 32 muestras analizadas. Ooquistes totales Ooquistes viables 72 L a media para ooquistes totales fue de 4.75, por 1000 litros de agua muestreada, con una desviación estándar de 6.60 y para ooquistes viables se obtuvo una media de 3.53 por 1000 litros de agua muestreada, con una desviación estándar de 4.62; lo anterior muy por encima de lo reportado por Aguilar (1997), quien tiene una media de 1.21 para agua muestreada en las tomas domiciliarias de Hermosillo, Sonora. Mientras que para quistes totales se obtuvo una media de 1.68 por 1000 litros de agua muestreada, con una desviación estándar de 3.92 y para quistes viables una media de 1.15 por 1000 litros de agua muestreada con una desviación estándar de 2.81. Al comparar los promedios de ooquistes y quistes totales con los promedios de ooquistes y quistes viables, se observa que la mayoría de los ooquistes y quistes se encuentran viables lo que implica un riesgo potencial mucho mayor para la población. E s importante aclarar que se determinó viabilidad, más no infectividad, dando pie a futuras investigaciones para determinar si dichos ooquistes y quistes son capaces de producir enfermedad. Como lo realizado por Díaz et al (1999) en la ciudad de Hermosillo, quienes afirman haber encontrado ooquistes de Cryptosporidium parvum en 23.2% de las muestras de heces analizadas en niños de 0 a 5 años de edad y señalan que posiblemente el agua podría ser el principal vehículo transmisor. Los valores obtenidos de media y desviación estándar para los parámetros fisicoquímicos se enumeran en la tabla 4. 74 Tabla 4. Media y desviación estándar para cada uno de los parámetros fisicoquímicos. pH Media 7.39 Desviación 0.1865 estándar Cloro ppm 0.9656 0.3543 Turbidez Temperatura °C NTU 29.9241 1.1431 1.9216 0.7083 Dureza ppm 91.2414 23.9920 Cloruros ppm 17.5344 4.0221 El parámetro pH entra en el rango en el que no ocasiona alteración a los ooquistes o a los quistes, sin embargo se sabe que valores más bajos (ácidos) pudiesen tener efecto sobre el número de quistes y ooquistes. Aquí es importante señalar que aunque se tienen valores considerables de cloro libre residual, como menciona Boreham (1987), la mayoría de las epidemias han ocurrido usando agua desinfectada, a pesar de que el cloro mata a las bacterias coliformes, su uso resulta insuficiente para matar quistes de parásitos y se necesitarían más de 5 ppm de cloro para eliminar quistes de Giardia y más de 80 ppm de cloro para eliminar quistes de Cryptosporidium. Sin embargo mencionan también que la efectividad del cloro puede tener relación estrecha con el resto de los parámetros fisicoquímicos, como por ejemplo la temperatura, ya que los halógenos son menos efectivos como desinfectantes en agua helada. Además las temperaturas encontradas permiten la presencia de los quistes y ooquistes de ambos parásitos, ya que se encuentran en el rango de temperatura que ellos toleran. 75 Para el parámetro turbidez se observa que está muy por encima del valor que dicta la Regla para Tratamiento de Aguas Superficiales (SWTR) de la Agencia de Protección al Ambiente (EPA) que indica una turbidez menor o igual a 0.5 NTU o Unidades de Turbidez Nefelometría, dentro de las referencias e inclusive en la muestra s e encuentra correlación de la turbidez con la presencia de ambos parásitos. Para los parámetros cloruros y dureza no se tienen reportes de los valores que pudiesen influir sobre la presencia y viabilidad de los ooquistes y quistes. No se reportan los datos coliformes totales y fecales, debido a que en la información proporcionada por O O M A P A S hay ausencia total de estos organismos en las muestras analizadas, sin embargo Le Chevallier (1991) y Rose et al (1991 b) encontraron correlación de este parámetro con la cantidad de quistes y ooquistes. Por otro lado se realizaron ajustes entre el número de ooquistes y quistes totales y el punto de muestreo, encontrándose claramente una mayor presencia de ooquistes en los puntos de muestreo de las plantas 1 y 2 que en los puntos de muestreo de las plantas 3 y 4. Es decir que el área más contaminada es la que abarca las colonias de la parte oeste de la ciudad, y cabe mencionar que son más que en la parte sur. E n el caso de los quistes, el comportamiento fue semejante con excepción de un punto de muestreo en el que el número de quistes se incrementó considerablemente al resto de los puntos analizados, figura 13. En 76 Figura 13. Ajustes para los ooquistes y quistes totales, en relación al área que pertenece el punto de muestreo (1: puntos abastecidos por las plantas potabilizadoras 1 y 2, 2: puntos abastecidos por las plantas 3 y 4) 77 toda la ciudad existe contaminación desde los tanques de almacenamiento, puesto que ahí fueron encontrados ooquistes y quistes, sin embargo se cree que puede haber contaminación adicional en el trayecto hasta la toma domiciliaria por daños y/o averías en las tuberías. Además se efectuó un estudio de correlaciones de Pearson (anexo 3), para establecer la fortaleza de la relación entre las variables ooquistes totales y quistes viables y enseguida la relación entre los ooquistes viables y quistes viables, la medida de este coeficiente es adimensional, encontrándose sus valores entre el -1 y el 1, donde valores cercanos al cero indican una escasa o nula relación. Por lo que se puede observar la escasa relación (0.3456, valor muy alejado del 1) entre los ooquistes totales y los quistes totales. Sin embargo, se encontró un coeficiente de correlación aceptable entre ooquistes viables y quistes viables (0.6052). Esto último coincide con lo establecido por Le Chevallier (1991), que indica que hay una correlación significativa entre la ocurrencia de quistes y ooquistes y a su vez coincide con Rose et al (1991 a), quienes también encontraron una correlación significativa en la ocurrencia de ambos parásitos. Ongerth y Stibbs (1987), establecen que al tener Giardia y Cryptosporidium una dosis similar de infectividad en humanos, el peligro potencial de transmisión de uno, es equiparable con el del otro. Sin embargo, como mencionan Jokippi et al (1985) existe controversia sobre la posible relación sinérgica entre ellos. Por otro lado, al efectuarse un análisis multivariado, mediante una regresión lineal múltiple por el método de mínimos cuadrados, se realizaron ajustes para 78 obtener el valor de R 2 (Coeficiente de determinación múltiple de muestra) que implique el modelo adecuado (anexo 4), es decir se eliminaron algunos parámetros fisicoquímicos, conservando sólo aquéllos con los que se obtenía un R 2 aceptable (anexo 4). Para ooquistes totales y cada una de los parámetros fisicoquímicos: pH, cloro libre residual, turbidez, temperatura, cloruros y dureza; se encontró relación con turbidez (P< 0.0340) y cloruros (P<0.0226). Esto concuerda con lo establecido por Le Chevallier (1991), que indica que incluso se pueden diseñar modelos de regresión lineal para predecir los niveles de Giardia Cryptosporidium, y con base en parámetros fisicoquímicos; sin embargo menciona que es muy importante el factor tipo de agua, ya que dice que al incrementarse los niveles de contaminación por coliformes fecales o turbidez, los niveles de estos parásitos se elevarán automáticamente. Al efectuar el mismo procedimiento estadístico entre ooquistes viables y cada unos de los parámetros se encontró que tenían relación con la temperatura (P<0.0734). Esto es contrario a lo establecido por Letorney (1994) quien afirma que los rangos de temperatura para la viabilidad de los ooquistes son muy amplios y van desde los -20 °C y 65 °C, y en el estudio se tuvo una temperatura de 29.9 °C con una desviación estándar de 1.92. Sin embargo Sherwood et al (1982 ) señalan que los ooquistes se mantienen perfectamente viables por dos semanas a temperaturas desde 5 hasta 20 °C, lo que podría significar que aparentemente tendrían una estancia o permanencia menor. 79 Al relacionar quistes totales significativas de ambos con y quistes viables se encontraron relaciones la temperatura (P<0.0530 y P<0.0343, respectivamente). Esto a pesar de que Boreham (1987) afirma que los quistes sobreviven por más tiempo en agua helada que en tibia y la temperatura promedio en las muestras analizadas fue de 29.9 °C. 80 6.C0NCLUSI0NES Y RECOMENDACIONES Durante el verano de 1999 fueron encontrados en el agua potable de Ciudad Obregón, Sonora, México, quistes de Giardia lamblia Cryptosporidium parvum; y ooquistes de ambos parásitos patógenos. Este trabajo constituye un primer indicio de la existencia de estos dos organismos patógenos en el agua potable de Ciudad Obregón, por lo que queda el precedente para investigaciones futuras. S e encontraron quistes de Giardia lamblia en el 2 5 % de las 32 muestras analizadas, mientras que se encontraron ooquistes de Cryptosporidium parvum en el 6 9 % de las mismas. En el 19% de las muestras fue posible encontrar ambos parásitos. S e observó una mayor presencia de quistes y ooquistes en los puntos de muestreo pertenecientes a las áreas abastecidas por la plantas potabilizadoras 1 y 2, cuya antigüedad supera a las plantas potabilizadoras 3 y 4. 81 C o m o opciones para eliminar dichos parásitos durante el proceso de potabilización: luz ultravioleta, nuevas técnicas de coagulación, la electrólisis ha dado buenos resultados, además ozono; sin embargo estos son tratamientos costoso el agua se puede contaminar en el trayecto hacia el usuario.Se recomienda que en cada hogar exista un filtro de diámetro menor al tamaño de estos quistes y ooquistes o hervir el agua, por lo menos durante 15 minutos. 82 ANEXO 1. Equipo utilizado Filtros El filtro empleado para la detección de ooquistes en agua potables MicroWynd H de la compañía AlVff-Cuno en Meriden, Conn., U S A . , el cual permite concentrar hasta 1000 litros de agua de baja turbidez. El filtro está hecho de fibras de polipropileno y tiene una porosidad nominal de una miera, presenta forma tubular con una longitud de diez pulgadas (modelo 3 M S I). Portafiltros Dispositivo para contener el filtro durante el proceso de filtración, producidos por las compaflias ANff-Cuno y Ametek en Sheboygan, Wyoming- Bomba de agua El agua puede ser recolectada por medio de una bomba, preferentemente de gasolina para toma de muestras y controlando el flujo de 15 a 35 litros por minuto. Conexiones y mangueras E s conveniente utilizar conexiones a base de balines, ya que facilitan el trabajo y ahorran tiempo. El tipo de manguera más recomendada es aquella que presenta refuerzos, por el aumento de presión que se presenta entre la bomba y el cartucho de filtración durante el bombeo de la muestra. 83 Medidor de flujo Cualquier medidor de flujo portátil que pueda ser desinfectado con cloro es adecuado. 84 ANEXO 2. Soluciones Tween 80 al 1 % 10 rnl de Tween 80 Aforar a 1 litro con agua destilada S D S al 1% 10 g S D S (dodecil sulfato de sodio) Aforar a 1 litro con agua destilada Solución SDS/Tween 400 mi de solución Tween 80 al 1 % 500 mi de solución S D S al 1 % Solución A 27.6 g de N a H P 0 Aforar a 1 litro con agua destilada 2 4 Solución B 53.65 g de N a H P 0 . 7 H 0 ó 28.4 g de N a H P 0 dibásico anhídrido Aforar a 1 litro con agua destilada 2 4 2 2 PBS 0.025M (solución de buffer de fosfatos 0.025) 40 mi de Solución A 210 mi de Solución B 1750 mi de agua destilada 1 7 g d e NaCI pH: 7.2-7.4 85 4 PBS/Tween 1 mi Tween 80 100 mi P B S 0.025 M Medio de montaje 25 mi de P B S 5 mi de glicerol Dicromato de potasio 2.5 % 25 g de dicromato de potasio Aforar a 1 litro con agua destilada Citrato de potasio Solución 4 0 % 400 g de citrato de potasio Aforar a 1 litro con agua destilada Gravedad específica: 1.16 Solución de formalina 100 mi de formaldehído al 37% 900 mi de agua destilada 4 g de fosfato monobásico de sodio o 6.5 g de fosfato dibásico de sodio (anhidro) Solución de Sheathers 500 g de sacarosa 320 mi de agua destilada 9.7 mi de fenol Para la solución 4/5, gravedad específica: 1.24 3/5, gravedad específica: 1.17 Para cambiar la gravedad específica: Si la densidad es mayor necesitará agregar agua destilada Si la densidad es menor necesitará agregar solución 86 Debido a que no es posible obtener la densidad requerida, f = 1.24 para la solución Sheaters 4/5 con el densitómetro, es necesario estimar la concentración por medio del método de pendientes pues la densidad y concentración de la solución es una constante. Ioduro de Propidio 5 mg de Ioduro de Propidio 50 mi de P B S 87 ANEXO 3. Salida del paquete JMP, para los estudios de correlación entre las variables Y. Variable oqt oqv qt qv Correlations oqt oqv 1.0000 0.7666 0.7666 1.0000 0.3456 0.5452 0.3939 0.6052 oqt = ooquistes totales oqv = ooquistes viables qt = quistes totales qv = quistes viables 88 qt 0.3456 0.5452 1.0000 0.9793 qv 0.3939 0.6052 0.9793 1.0000 ANEXO 4. Salida del paquete JMP, para el análisis multivariado entre los ooquistes totales, ooquistes viables, quistes totales y quistes viables y cada uno de los parámetros fisicoquímicos. Response: Summary of RSquare 0.261393 R S q u a r e A d j 0.172761 Root Mean Square Error 5.811907 Mean of Response 4.241379 Observations (or Sum Wgts) 2 Parameter Estimates Term Estímate Std Error t Ratio Prob>ltl Intercept -7.23649 6.22841 -1.16 0.2563 cloro -5.540907 3.24722 -1.71 0.1003 turbidez 3.8699233 1.724797 2.24 0.0340 cloruros 2.43 0.0226 0.715033 0.294226 oqt Eff ect Test Source cloro turbidez cloruros Nparm D F Sum of Squares 1 1 98.35030 1 1 170.04589 1 1 199.49303 F Ratio 2.9116 5.0342 5.9060 Prob>F 0.1003 0.0340 0.0226 Response: Summary of Fit oqv RSquare 0.234408 RSquare Adj 0.067975 Root Mean Square Error 3.675564 Mean of Response 2.931034 Observations (or Sum Wgts) 29 Parameter Estimates Term Intercept cloro turbidez tempe ph cloruros Estímate -1.890273 -3.004197 1.3915104 0.8316639 -2.575586 0.0194344 Std Error t Ratio Prob>ltl 30.92113 -0.06 0.9518 2.103598 -1.43 0.1667 1.102655 1.26 0.2196 0.443239 1.88 0.0734 3.761642 -0.68 0.5004 0.215015 0.09 0.9288 Eff ect Test Source Nparm DF Sum of Squares 89 F Ratio Prob>F 27.553651 21.515024 47.562777 6.333521 0.110371 cloro turbidez tempe ph cloruros 2.0395 1.5926 3.5206 0.4688 0.0082 0.1667 0.2196 0.0734 0.5004 0.9288 Response: Summary of Fit RSquare 0.154943 RSquare Adj 0.053537 Root Mean Square Error 3.662468 Mean of Response 1.37931 Observations (or Sum Wgts) 29 Parameter Estimates Term Intercept cloro turbidez tempe Estímate -22.38914 0.3721551 0.246539 0.7725645 Std Error t Ratio -1.95 11.4882 0.18 2.056088 0.23 1.059539 2.03 0.380432 Prob>ltl 0.0626 0.8578 0.8179 0.0530 Effect Test Source cloro turbidez tempe Nparm DF Sum of Squares 1 0.439453 1 0.726248 1 55.317433 F Ratio 0.0328 0.0541 4.1240 Prob>F 0.8578 0.8179 0.0530 Response: Summary of Fit RSquare 0.161227 RSquare Adj 0.096706 Root Mean Square Error 2.459101 Mean of Response 0.862069 Observations (or Sum Wgts) 29 Parameter Estimates Term Intercept tempe ph Estímate -21.32105 0.5429812 0.8035081 Std Error t Ratio Prob>ltl -1.05 0.3014 20.21998 2.23 0.0343 0.243123 0.33 0.7460 2.454426 Effect Test Source tempe ph Nparm DF Sum of Squares 1 1 30.162625 1 1 0.648087 90 F Ratio 4.9879 0.1072 Prob>F 0.0343 0.7460 oqt = ooquistes totales oqv = ooquistes viables qt = quistes totales qv = quistes viables 91 BIBLIOGRAFIA Addis, D., W . 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