Efecto de anapsos ·(Polypodium leucotomos) sobre la producción in vitro de citocinas en células mononucleares de sangre periférica humana l . Introducción 11. Material y� métodos ug/ml. Como control de la proliferación; se utilizaron células conteniendo sólo medio Anapsos (Calaguala; Polypodium Leu- - de cultivo. Las células se incubaron a conti­ Preparación del extracto nuación en estufa de cultivo, durante 3 días cotamos) es un helecho típico de determina­ das zonas de Centroamérica, siendo utiliza­ dos sus rizomas en el tratamiento de enfer­ medades cutáneas como el psoriasis y la der­ matitis atópica. Sus efectos clínicos han sido confirmados y documentados en ensayos clí­ nicos abiertos y doble-ciego controlados con Los rizomas del polipodium leucotomos a 37°C y 5% de C02; 1 8-20 horas antes de fueron recolectados en las Plantaciones finalizar el cultivo, se incorporó al medio 1 Experimentales y de Recuperación Ecoló­ uCi de 3 [H] -Timidina (AMERSHAM). de altitud (propiedad de ASAC Pharma-ceu­ tical International). Una vez examinados un contador beta y expresada en c. p.m . . do oralmente a los pacientes, y hasta el por la · Universidad de San Carlos de Guatemala, los rizomas ·fueron deshidrata­ momento sólo han sido observados efectos dos a 50° e durante 48 horas, sumergidos y secúndarios menores como gastralgias ( 1 -3). macerados con disolventes polares durante un grupo placebo. El extracto. es administra­ Finalmente las células fueron recolectadas en el Harvester y la proliferación, medida en gica de Guatemala, situada a 2000 metros Determinación de ci�oninas Las células se sembraron a l x l 06/ml en pla­ Los primeros estudios del producto 8 horas. El extracto obtenido, fue filtrado, cas (COSTAR) de 12 pocillos, a razón de 1 demostraron un efecto antitumoral (4). liofilizado y cedido por ASAC para el pre- mllpocillo. La estimulación se realizó con LPS Otros autores confirmaron su efecto antine­ sente trabajo. con �eceptores citoplasmáticos similar a la Muestra del estudio (20 ug/ml) y/o PHA (4 ug/ml) y/o Anapsos ( 1 50 ug/ml). Se utilizó esta dosis de Anapsos oplásico, atribuyénrlolo a una interacción ejercida por los glucocorticoides (5). Estudios "irí vivo" e "in vitro" en sujetos porque resultó ser la dosis óptima. Las células se incubaron en estufa (37°C, 5% de C02) y se realizó una cinética completa de cada una de Las células mononucleares se obtuvieron sanos demuestran que Anapsos posee, ade­ por centrifugación en gradiente de densidad las citocinas (a las O, 1 2, 24, 48, 72 y 96 horas), más, efectos inmunomoduladores. Así, la (Ficoll Hypaque) de un grupo de donantes para cada una de las condiciones de estimula­ administración de Anapsos por vía oral sanos de ambos sexos, con edades compren­ aumenta el índice de supresión, la respues� didas entre los 21 y 35 años. ción. Tras centrifugar los medios, se recolecta­ ron los sobrenadantes en viales de congela­ ción ( 1 ml/viq.l) y se guardaron en congelador ta linfoblástica a mitógenos, los niveles · séricos de inmunoglobulinas y la propor­ ción de_ células T OKT 8+ (supresoras cito­ a �70°C, hasta su ulterior procesamiento. Las Condiciones de cultivo Citocinas medidas fueron la lnterleuquina- 1 Las células separ�adas fueron ajustadas a Beta oi- 1 b) , Factor de necrosis tumoral-alfa (6). Otros estudios refieren éste efect? I X 106/ml con medio de cultivo RPMI 1 640 inmunomodulador del producto ·en diferen­ (WHITAKER), suplementado con 10% de Gamma (INF-g), lnterleuquina- 4 (IL-4) e tóxicas), de un modo tiempo-dependiente tes patologías (7 ,8). Otros autores han comprobado que este (GIBCO). dulando la producción de IL- 1 b, IL-2 y Respuesta proliferativa frente a mitógenos TNF-a en el sistema nervioso central (SNC) de ratas y mejorando la coordinación psi ca­ motora (9, 1 0). lnterleuquina- 1 O (IL- 10) y su dete�rninación se suero de ternera fetal (FLOW), 1 % de anti- realizó mediante ELISA (RD Diagnostics). . biótico (GIBCO) y 1 % de Glutamina compuesto actúa como potencial agente neurotrófico y neuroinmunoregulador, mo­ (TNF-a), lnterleuquina-2 (IL-2), Interferón­ Estadística · En el análisis estadístico se emplearon los Las células se sembraron por triplicado en coeficientes de correlación lineal y la t­ placas de 96 pocillos (NUNC) de fondo Student para datos pareados. del producto d�sde un punto de vista in­ ullpocillo) y estimuladas con 0,5 ug/ml de 111. Resultados munológico que nos permitiera hallar un Fitohemaglutinina (PHA) o 4 ug/ml de nexo coni.ún capaz de jústificar la mayor Pokeweed (PWM), con y sin Anapsos En un intento de ahondar en la actuación parte de sus efectos, decidimos testar la _capacidad inmunomoduladora de dicha sustancia "in vitro': . 38 plano, a razón de 2X l 05/pocillo (200 (ANP), así como con Anapsos solo. Las dosis de Anapsos utilizadas en todos los casos fueron d� 75, 1 50, 500, 1 500 y 4500 NATURA MEDICATRIX n.• 49 Invierno 1 998 Cuando las células se estimularon con Anapsos solo, se observó un aumento esta­ dísticamente significativo en la prolife­ ración, con las concentraciones de . 75 (p=O.O 1 3 ) y 1 5 0 ug/ml (p=0.0 1 7) vs . control (Figura l ); dichas concentraciones coinci­ den respectivamente con las dosis terapéuti­ cas del producto. Dicho incremento quedó enmascarado cua·ndo las células · fueron simultáneamente estimuladas con los mitó­ genos PHA o PWM (datos no mostrados). La viabilidad celular fue buena en todos los casos (>90%), salvo con la concentración más alta de Anapsos (4500 ug/ml). Los niveles de lL- l b de células estimula­ das con LPS+PHA, fueron siempre inferio­ res a los producidos p or células estimuladas solo con LPS, aunque sólo-a las 1 2 horas de cultivo las diferencias fueron estadística- . mente significativas (798+6'Z_ pg/ml vs. l 04 1 +98) (p<0.05). También se aprecia en estas primeras 12 horas, una reducción esta­ nas para las distintas condiciones de estimu­ dísticamente significativa en los niveles de lación, quedan reflejadas en la Tabla I. IL- 1 b en el grupo de células estimuladas con LPS+ANP versus LPS (p<0.025). Del mismo modo, pudimos observar un retraso IV· Discusión munes se han asociado con· producción excesiva "in vitro" de citocinas inflamato­ rias como la IL- 1 b y el TNF-a; y otras enfer­ medades como el SIDA o el lupus eritema­ toso sistémico, se han asociado con una pro­ de 1 2 horas en la síntesis y/o libyración de Las citocinas son glicoproteínas general­ IL- 1 b cuando las células fueron estimuladas mente secretadas por los leucocitos, que median respue.stas del huesped frente a estí­ con Anapsos, con un máximo de producción a las 24 horas de cultivo. Las células estimu­ mulos inflamatorios y/o infecciosos. Su ladas sólo con LPS y/o LPS+PHA alcanza­ papel en la respuesta inmunitaria se conoce ron este máximo a las 1 2 horas (Figura 2.A). Cuando las células fueron estimuladas desde hace tiempo ( 1 1 ). Así, citocinas como producción de IL-2 fue practicamente idén- · papel en la regulación de las funciones celu­ con LPS+PHA, la cinética de la curva de la IL- l b o el TNF-a, j uegan un importante tica a la obtenida con LPS solo. Sin embar­ lares ( 1 2), compartiendo multitud de efectos go, la adición de Anapsos a LPS+PHA, pro­ dujo siempre un incremento significativo en ( 1 3- 1 5 ) . Se ha propuesto una subdivisión de los los niveles de dicha citocina (Figura 2.B) . . La estimulación con LPS+PHA se tradu­ linfocitos T CD4+ de ratón, basada en dife­ rencias en sus · patrones de producción de niveles de INF-g, si se comparaban con los TH l , sintetizan y secretan entre otras citoci­ citocinas. Hoy sé acepta que los clones jo en un incremento significativo ·en · los ducción disminuída de citocinas TH l -like · como la IL-2 y el INF-g ( 1 9-22). "In vitro", PBMNc de controles sanos estimuladas con ConA demostraron que dosis altas de Anapsos_añadidas al cultivo, producían una supresión de la proliferación, una_ inhibición en la secreción de IL-2 y un incremento en la secreción de diversas monocinas, todo ello de forma dosis-depen­ diente (23) . Nosotros demostramos que Anapsos "in vitro" a dosis terapéuticas, es capaz de esti­ mular la proliferación de PBMNc, de dismi­ nuir la secreción de IL- 1 b y, por el contra­ rio, de aumentar la de IL-2. Estos resulta­ obtenidos al estimular las células con LPS nas IL-2 e INF-g, pero no IL-4 ni IL-5, dos, en principio contradictorios con los del solo. Cu.ando a LPS+PHA también se aña.óió Anapsos, dichas diferencias aumentaron, otras IL-4, IL�5, IL-6 e IL- 1 O pero no IL-2 básicamente a diferencias metodológicas. mientras que los clones TH2 producen entre estudio previo, creemos pueden ser debidos De hecho, cuando nosotros utilizamos dosis alcanzando una mayor significación (Figura 2.C} a partir de las 24 horas de cultivo. ni INF-g; una tercera subpoblación de linfo­ citos T (THO), sintetiza un patrón mixto de siempre un incremento significativo en los aislado clones de linfoc-itos T humanos, similares a los THO, TH l y TH2 del ratón. aunque en ningún caso llega a ser significa­ añadir Anapsos a LPS y/o LPS+PHA, se Algunos de estos autores han comprobado efecto incrementador sobre la proliferación además que dichos patrones pueden acumu­ se hizo evidente cuando las células fueron de pacientes con distintas enfermedades. La subpoblación TH l represe nta a las células lación eón otros mitógenos. La cinética de dichas citocinas ( 1 6) . Diversos autores han La estimulación con LPS+PHA produjo niveles de la IL- 1 0 versus LPS solo. Tras produjo igualmente un incremento en los larse en los tejidos o en la sangre periférica niveles de dicha citocina, que en el caso del LPS+PHA se tradujo a partir de las 24 horas de cultivo, en un nivel de significación · s up eriore s también observamos una tenden­ cia a a la disminución en la proliferación, tiva (datos no mostrados). Por otro lado, el estimuladas sólo con Anapsos, quedando dicho efecto enmascarado por la coestimu­ efectoras más importantes en reacciones producción de citocirias del presente estu­ Los niveles ..obtenidos de IL-4 y TNF-a para las distintas condiciones de estimula­ hipersensibilidad retardada, pero con baja Anapsos -retrasa la máxima secreción de IL- ción, fueron practicamer¡te idénticas, no cional de la mayor parte de los clones TH2, nos solos, lo que concuerda con estudios · mayor (vs. LPS) que el obtenido al añadir la PHA al LPS (Figura 2.D). existiendo en ningún caso diferencias signi­ ficativas entre ellas (datos no mostrados) Las principales correlaciones entre citoci- inflamatorias asociadas a respuestás de producción de anticuerpos. El fenotipo fun­ dio, demuestra que la coestimulación con 1 b, respecto de la estimulación con mitóge­ se asocia a producción persistente de an­ ticuerpos (incluyendo IgE) y eosinotllia realizados "in vivo" con el producto (9, 1 0) . E l hecho d e que Anapsos pueda ser capaz ( 1 7, 1 8) . Numerosas enfermedades autoin� de bloquear la producción o la liberación dé NATURA MEDICATRIX n.' 49 Invierno 1 998 39 ·citocinas inflamatorias como la IL- l b, F.J. "Comunicación . sobre un nuevo tratamiento efectuado con 130 niñ.os puede resultar de interés para explicar los efectos observados empíricamente en - pacientes con psoriasis (24). Se ha demos� trado el papel que niveles aumentados de IL- 1 b y/o TNF-a, juegan en la patogenia de afectados de dermatitis así como él papel terapéutico de agentes anti-nflamatorios no esteroideos en estas enfermedades (28). Del mismo modo, los efectos observados con Anapsos sobre la IL1 b pueden j ustificar la act.ividad colageno­ poyética del producto (29,30), pues es sabi­ do que citocinas como la IL-1 a, la IL- 1 b y el a11ct plasma of rheumatoid patients" . Clin Exp Rheumatol 1 994, arthritis 12(1\ 55-8. atópica". 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Estos efectos se verían· reforzados por su acción incrementadora de la IL-2. Basándonos en los resultados de las dis­ tintas cmrelaciones del presente estudio, concluímos que Anapsos ejerce un efecto opuesto e independiente sobre la IL- 1 b y la IL-2, así como entre la IL- 1 b y· el INF-g y l a IL- 1 b e IL- 1 O . S i n embargo ejerce u n efecto en Alvarez, X.A., Franco-Maside, A., similar sobre la IL- 1 0 Y· el INF-g. Estos Cacabelos, "New R.: strategies for and mu/tifactoria/ intervention ". In. Alzheimer's Fernández-Novoa, L., Cacabelos, R. "Effect of Disease: Anapsos on behaviour and brain cytokines in Giacobini and R. Becker, Birkausser Boston, Therapeutic Strategies, ed by E., rats". Ann Psych 1993, 3: 329-34 1 . 1 994: 493-498. 10.- Alvarez, X.A., Zas, R., Lagares,R., Franco, 27.- Chofflon, M., Juillard, C., Juillard, P., A., Gauthier, G., Grau, GE.: "Tumor necrosis fac­ Maneiro, E., Miguel-Hidalgo, JJ., Fernández-Novoa, L., Diaz, J. 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