PROTEÍNAS 8 Presentación elaborada por el Prof. José Bubis jbubis@usb.ve Trimestre Sep-dic 2021 1 Métodos para determinar la estructura secundaria de proteínas • Dicroísmo circular α – hélices α β – hojas β R – random coil T - vueltas β Mediciones usando péptidos sintéticos con estructuras conocidas han sido usados para definir los espectros CD de hélices α, hebras β y la conformación de enrollamiento al azar o random coil. Hélices α → bandas negativas a ~ 208 y ~ 222 nm, y una banda positiva a ~ 192 nm. - Hojas β → una banda positiva (~ 196 nm) seguida de una banda negativa (~ 218 nm), aunque las λ de las bandas son menos regulares (la forma se mantiene). Random coils → banda negativa a ~ 199 nm y banda positiva a ~ 212. Se puede hacer un estimado del contenido de hélices α y estructuras β de una proteína a partir de su espectro CD y estos estimados por lo general están de acuerdo con los valores obtenidos de los estudios cristalográficos de difracción de rayos X. Los espectros CD pueden ser complejos → hay que “desenmarañarlos” Existen programas Bioinformáticos que nos ayudan a desenmarañar los espectros CD mediante relaciones matemáticas y rinden estimados de estas estructuras 2rias en %. Aplicación: CD es muy útil para determinar cambios conformacionales en proteínas. Métodos para determinar estructura secundaria de proteínas • Espectroscopía de Absorción Infrarroja de Transformada de Fourier (FTIR) En la espectroscopía FTIR se determina cuáles longitudes de onda en la region infrarroja del espectro son absorbidas por una muestra, al incidir radiación infrarroja sobre dicha muestra. Cada tipo de compuesto tiene una serie característica de bandas de absorción en su espectro infrarrojo. Métodos para determinar estructura secundaria de proteínas • Espectroscopía de Absorción Infrarroja de Transformada de Fourier (FTIR) Este tipo de espectroscopia se fundamenta en la absorción de la radiación IR por las moléculas en vibración. Una molécula absorberá la energía de un haz de luz infrarroja cuando dicha energía incidente sea igual a la necesaria para que se de una transición vibracional de la molécula. Por lo general tiene una aplicación principalmente cualitativa, o sea, para detectar las moléculas presentes en el material que se está analizando. → también se utiliza para determinar la estructura 2ria de las proteínas y al igual que el CD es muy útil para determinar cambios conformacionales en proteínas. Las bandas características que se consiguen en los espectros infrarrojos de proteínas se producen a partir de los enlaces amida que unen a los aminoácidos. Las bandas características que se encuentran en los espectros infrarrojos de proteínas incluyen las bandas Amida I y Amida II, las cuales se producen de los enlaces amida que unen a los aminoácidos. La absorción asociada con la Amida I se produce principalmente por las vibraciones de estiramiento del enlace C=O de la amida. La absorción asociada con la Amida II se produce principalmente por las vibraciones causadas por las dobleces del enlace N-H. from L. K. Tamm and S. A. Tatulian, Quarterly Reviews of Biophysics 30 (1997) 365-429 → from L. K. Tamm and S. A. Tatulian, Quarterly Reviews of Biophysics 30 (1997) 365-429 Las bandas características que se encuentran en los espectros infrarrojos de proteínas incluyen las bandas Amida I y Amida II, las cuales se producen de los enlaces amida que unen a los aminoácidos. La absorción asociada con la Amida I se produce principalmente por las vibraciones de estiramiento del enlace C=O de la amida. La absorción asociada con la Amida II se produce principalmente por las vibraciones causadas por las dobleces del enlace N-H. Debido a que tanto los enlaces C=O como los N—H están involucrados en la formación de los enlaces de hidrógeno que ocurren entre los diferentes elementos descritos para la estructura secundaria, las bandas Amida I y Amida II son sensibles al contenido de estructura secundaria de las proteínas. Estudios con proteínas de estructura tridimensional conocida han sido usados para correlacionar sistemáticamente la forma de la banda Amida I con el contenido de estructura secundaria. The vibrational frequency of the C=O stretching mode of the amide groups depends on the protein secondary structure α-helix 1648-1660 cm-1 β-turn β-sheet 1660-1685 cm-1 1625-1640 cm-1 The Amide I band due mainly to the C=O stretching mode can be used to differentiate among different secondary structures from L. K. Tamm and S. A. Tatulian, Quarterly Reviews of Biophysics 30 (1997) 365-429 Ejemplo: Amide I and Amide II bands of Candida rugosa lipase 1 .12 .1 Absorbance .08 .06 .04 Amide II .02 0 1900 Amide I 1800 1700 1600 1500 Wavenumber (cm-1) FT-IR absorption and its second derivative spectra of CRL1 (20 mg/ml) at 20°C, at 2 cm-1 spectral resolution. The derivative spectrum at 4 cm-1 is also reported (dotted line) for comparison. Thermal unfolding of Candida rugosa lipase 1 Second Derivative 0 Tyr Amide II 20°C 87°C aggregates Amide I 1700 1650 1600 Wavenumber 1550 1500 (cm-1) Second derivative spectra of CRL1 as function of temperature in the Amide I and Amide II region from 20 to 87 °C. The arrows point to the direction of the increasing temperature. PREDICCIÓN DE ESTRUCTURA SECUNDARIA Inicio: Tenemos que conocer la secuencia de AAs de la proteína Hay métodos estadísticos empíricos que usan parámetros derivados de estructuras 3D conocidas almacenadas en bases de datos computacionales, como el método de Chou y Fasman. En este método, se calcula la propensión (probabilidad) de que un AA adopte conformaciones de hélice α (< Pα >), hoja β (< Pβ >) o vuelta (vuelta β) (< Pt >) para los 20 AAs usando las siguientes ecuaciones: < Pα > = Xαi/<Xα >, < Pβ > = Xβi/<Xβ > y <Pt> = Xti/<Xt> donde Xαi, Xβi y Xti representan los números obtenidos para un tipo i de residuo que ocurre en una estructura de hélice α, hoja β o vuelta β, respectivamente, entre el número total de AA del mismo tipo i en la base de datos analizada (frecuencia). < Xα >, < Xβ >, y < Xt > son los valores promedio de Xαi, Xβi y Xti para todos los 20 AAs, respectivamente (al promediar las frecuencias de los 20AAs). P=1 P>1 P<1 Reglas para predecir la estructura 2ria: 1. Asigne símbolos (H, h, I, i, B, b para los residuos que son formadores fuertes, formadores, formadores débiles, formadores indiferentes, rompedores o no formadores, y rompedores fuertes, respectivamente) 2. Busque sitios de nucleación para hélices α y hojas β : a. Para hélices α: Un péptido con 6 residuos conteniendo al menos 4 formadores de hélices (Hα o hα), donde Iα cuenta como ½ hα, y no más de un rompedor de hélice (Bα o bα). b. Para hojas β: Un péptido con 5 residuos conteniendo al menos 3 formadores de hojas β (Hβ o hβ) y no más de un rompedor de hojas (Bβ o bβ). 3. Cuando las asignaciones de hélices α y hojas β son similares: calcule el promedio de < Pα > y < Pβ > para el grupo de residuos. El sitio de nucleación es asignado como hélice α u hoja β dependiendo del valor que de la probabilidad más alta. 4. Propagación: Extienda la hélice α y la hebra β desde el sitio de nucleación en ambas direcciones hasta que la probabilidad promedio para el tetrapéptido final caiga por debajo de 1. Los residuos que están al final y que corresponden a rompedores no se deben incluir en la estructura 2ria. 5. Predicción de vueltas (vueltas β): Las frecuencias de cada tipo de AA presente en la vuelta β que consta de 4 residuos se calcula a partir de la base de datos (fi, fi+1, fi+2 and fi+3). Para cada péptido que no se le pueda asignar una estructura de hélice α u hoja β, se calcula la probabilidad de que sea una vuelta como el producto de 4 residuos contiguous (el cálculo es más complejo). Ejemplo: Predicciones al azar ~ 30% El éxito de estas predicciones está entre ~ 50% a ~ 80% Las vueltas se caracterizan por ocurrir en regiones de la cadena polipeptídica donde existe un mínimo de hidrofobicidad. Método de Rose → las vueltas ocurren en posiciones de la cadena donde la hidropatía es mínima. Así se puede deducir por inspección la posición de la mayoría de las vueltas. Índice de hidropatía • Una escala que expresa las tendencias relativas de hidrofobicidad e hidrofilicidad de un grupo químico. • Aminoácidos altamente cargados (+ y -mente) presentan altos valores negativos de índice de hidropatía. • Aminoácidos hidrofóbicos tienen altos valores positivos de índice de hidropatía Las vueltas se caracterizan por ocurrir en regiones de la cadena polipeptídica donde existe un mínimo de hidrofobicidad. Método de Rose → las vueltas ocurren en posiciones de la cadena donde la hidropatía es mínima. Así se puede deducir por inspección la posición de la mayoría de las vueltas. Proteinas en membranas biologicas Glicoforina La suma de los índices de hidropatía de 9 residuos consecutivos Si el índice de hidropatía da + es una región hidrofóbica Si el índice de hidropatía da - es una región hidrofílica Bacteriorodopsina MÉTODOS PARA DETERMINAR LA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE UNA PROTEÍNA • DIFRACCIÓN DE RAYOS – X • RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR CRISTALOGRAFIA - DIFRACCIÓN DE RAYOS X Principios basicos: -Los electrones dispersan a los rayos X. La amplitud de la onda dispersada por un atomo es proporcional a su numero de electrones -Las ondas dispersadas no son independientes sino que se recombinan. Se refuerzan si estan en fase o se cancelan si estan fuera de fase -La manera como las ondas dispersadas se recombinan depende solo del arreglo atomico Estos son los datos experimentales. La intensidad de cada mancha se mide y la imagen de la proteina se reconstruye a partir de las intensidades observadas. Hay que aplicar una relacion matematica llamada Transformada de Fourier Uno de los grandes problemas es cristalizar la proteina, es decir, lograr que las proteinas se dispongan de forma ordenada en el espacio formando un cristal Procedimientos empiricos Sustitución isomórfica o reemplazo isomórfico PLEGAMIENTO Plegamiento • Conduce a las proteínas a adoptar su conformación nativa, la cual es estabilizada por interacciones no covalentes. • En el caso de proteinas citosólicas o en ambientes hidrofilicos, su interior está constituído por un núcleo de aa’s hidrofóbicos/no polares estabilizados por interacciones hidrofóbicas. En su exterior encontraremos numerosos enlaces H, interacciones iónicas e interacciones dipolo-dipolo. • Para las proteínas de membrana ocurre lo contrario. 48 PLEGAMIENTO La desnaturalización consiste en la pérdida de estructura nativa de la proteína y la formación de un enrrollamiento al azar u ovillo aleatorio (random coil). 49 Enrollamiento al azar (ovillo aleatorio) o random coil: Conformación parecida a un polímero lineal, en la cual hay total libertad de rotación en los enlaces que unen los AAs de una proteína → no existen interacciones de tipo no covalente entre los residuos ni ningún tipo de interacción entre los grupos R. Enrollamiento al azar (ovillo aleatorio) o random coil: Conformación parecida a un polímero lineal, en la cual hay total libertad de rotación en los enlaces que unen los AAs de una proteína → no existen interacciones de tipo no covalente entre los residuos ni ningún tipo de interacción entre los grupos R. Estado desplegado o desnaturalizado Agentes desnaturalizantes Curva sigmoidea Desnaturalización de proteínas Proceso Cooperativo Ambas gráficas demuestran cooperatividad en el proceso de plegamiento. *Apomioglobina= mioglobina sin el grupo hemo GdnHCl= hidrocloruro de guanidina (agente desnaturalizante) 55 PLEGAMIENTO La estructura tridimensional de una proteína particular depende en gran parte de su secuencia de aminoácidos. 60 Experimento de Anfinsen Renaturalización de la ribonucleasa Urea es un agente desnaturalizante, al igual que GdnHCl. El mercaptoetanol reduce los enlaces disulfuros Evidenció que la secuencia aminoacídica de la ribonucleasa contiene la información requerida para adoptar su conformación nativa y plegarse. La diálisis permite eliminar la urea y el mercaptoetanol y renaturalizar la ribonucleasa. 61 Conclusion: La informacion necesaria para que una proteina se pliegue y obtenga su estructura tridimensional esta contenida en su estructura primaria. Uno de los primeros pasos en el estudio del plegamiento de proteínas, se debe a C. Levinthal, quien en 1968 demostró que el problema de hallar la conformación terciaria de una proteína no es un proceso al azar. Para llegar a esta conclusión, observó que si una proteína estuviese integrada por N aminoácidos, y si cada uno de ellos pudiese adquirir, en promedio, un número ν de conformaciones espaciales, entonces el número C de posibles conformaciones tridimensionales está dado por C = νN Si consideramos el caso de una proteína de dimensiones pequeñas, digamos, con N = 100, y suponiendo para el parámetro ν su valor mínimo ν = 2, tendríamos que el número de conformaciones posibles C es, C = 2100, el cual es número astronómicamente grande. El tiempo necesario para que una proteína con estas características explorase al azar todas las posibles conformaciones tridimensionales hasta encontrar la estructura más estable correspondería a un tiempo mayor que la edad del Universo. Las proteínas más pequeñas (N ~ 64 aminoácidos), alcanzan su estructura terciaria en tiempos del orden de milisegundos (t ~ 10–3 seg), en tanto que proteínas más complejas se pliegan en tiempos no mayores a algunas decenas de segundos (t ~ 101 seg) La Paradoja de Levinthal planteó la necesidad de que los mecanismos de plegamiento deben poseer elementos de presión evolutiva que dirigen el proceso en una dirección particular y evitan una búsqueda aleatoria dentro de todo el espacio de posibles conformaciones. INTERMEDIARIOS Simulación de ruta de plegamiento-vilina Contiene 36 residuos aa’s Simulación en un lapso teórico de 1µs 1. se forman estructuras secundarias 2. se forman interacciones de largo alcance que dan lugar a estructuras super-secundarias 72 PREDICCION DE ESTRUCTURA SECUNDARIA Termodinámica del plegamiento de proteínas: como un embudo de energía libre Alto número de conformaciones Entropía conformacional alta Aumenta Entropía Decrece la energía libre Intermediarios Semi-estables * *Glóbulo fundido: alto contenido de estructuras secundarias, pero las cadenas de aa’s no han alcanzado su conformacion nativa CONFORMACION NATIVA 74 Formacion de interacciones especificas BPTI
