30/06/2022 CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS 1 1 ; ; Bettin W1. [1]. Estudiantes del programa de Biología, VII semestre. Departamento de Biología y Química, Facultad de Educación y Ciencias. Universidad de Sucre. wbettinj@gmail.com; andreshxh23@gmail.com; libanjramos@gmail.com ___________________________________________________________________________ RESUMEN Teniendo en cuenta la guía de trabajo, las recomendaciones de la docente y el técnico de laboratorios, se realizó la cuantificación o proliferación de bacterias presentes en una muestra de suelo de 1 gr en 10 mil de agua destilada y rotulada con 10-¹ y luego se tomó una muestra de 1 ml, y se diluyó en 10-² y sucesivamente hasta llegar hasta 10-⁶, teniendo en cuenta el cambio de la pipeta en cada dilución. luego se utilizaron 3 cajas de petri con diferentes concentraciones de (1*10-⁶, 1*10-⁵ y 1*10-⁴) y se tomó 0.5 ml de los tubos de ensayo que estaban rotulados iguales que las cajas de petri y se agregaron en cada caja para posteriormente agregar medio de cultivo PCA para dejarlo en reposo por 24hrs, al pasar el tiempo se observó que la muestra 1*10-⁵ tenían alrededor de 54 UFC en este medio por último se realizó los respectivos cálculos para la conclusión. Palabras claves: Cuantificación, UFC, Medio, Dilución, Proliferación. INTRODUCCIÓN La cuantificación de microorganismos es muy utilizada en el area de microbiologia, también es utilizado en diferentes áreas como la industria alimenticia, en donde se quiere saber la cantidad de microorganismos en un producto, o en la industria hospitalaria, donde se busca conocer procesos patológicos infecciosos que puedan afectar a la gente. Los métodos de cuantificación pueden variar, unos establecen el número de microorganismos en una muestra y otros cuantifican la masa total de la población. La cuantificación bacteriana puede ser de forma directa o indirecta. El método de contaje de colonias provee una estimación del número de microorganismos viables en una muestra de acuerdo al medio empleado, el tiempo y la temperatura de incubación. Las células microbianas a menudo se encuentran como conjuntos o grupos de células, por cuanto, la muestra y las diluciones homogeneizadas pueden uniformemente distribuir los conjuntos de bacterias, ya que estos grupos no pueden ser disgregados completamente por ellos mismos. Cada colonia que aparece en las cajas de Petri con agar como grupos de células libres deben ser referidas como Unidades Formadoras de Colonias (UFC). (Acosta, 2020). El método utilizado con más frecuencia para la medición de poblaciones bacterianas es el recuento en placa, una ventaja importante de esta técnica es que mide el número de células viables. Una desventaja es que se requiere bastante tiempo, por lo general 24 horas o más, para que se formen colonias visibles. Esto puede plantear un grave problema en algunas aplicaciones, como por ejemplo el control de calidad de la leche, cuando no es posible mantener un lote determinado durante tanto tiempo. El recuento en placa se basa en la suposición de que cada bacteria crece y se divide para producir una sola colonia. Esto no siempre es cierto porque las bacterias con frecuencia crecen unidas en cadenas o como grumos. Por consiguiente, a menudo una colonia no se produce como resultado de una única bacteria sino de segmentos cortos de una cadena o de un agregado bacteriano. Este método lleva consigo el hacer un banco de diluciones seriadas, que no son más que un tipo de diluciones sucesivas manteniendo constante el factor de dilución en cada paso. (Ramirez., et al. 2021). El objetivo de la práctica fue el conocer el fundamento de las técnicas más utilizadas para la cuantificación microbiana, de igual forma, el establecer cuantificación de microorganismos a partir de muestras, mediante el método de recuento en placa en profundidad. METODOLOGÍA Inicialmente, se tuvo en cuenta que la disponibilidad de muestras era limitada por lo que las diferentes muestras sólidas o líquidas se repartieron de forma razonable y se procedió a la realización de las dos técnicas de siembra en superficie y siembra en profundidad. Sin embargo, cada grupo solo realizó uno de estos dos procedimientos. RECUENTO EN PLACA CON SIEMBRA EN FONDO 1. Se marcó las placas de petri de las siguiente manera 10-4 hasta 10-6 Figura 1. Placas de petri rotuladas. 2. Se realizó el mismo proceso con los tubos de ensayo desde 10-1 hasta 10-6 3. Se tomó 1g de muestra sólida en este caso se utilizó una muestra de suelo. Figura 2. Muestra de suelo pesado en balanza. 4. Posteriormente, se transfirió 1g de la determinada muestra a los tubos marcados con dilución 10-1 con agua destilada → Se agitó por 10s. Figura 3. Preparación de las diluciones en pipetas volumétricas. 5. Con una pipeta se realizó la transferencia de 1ml de la primera dilución al tubo marcado con 10-2 → Se agitó por 10s. Figura 4. Transferencia de muestra diluida por medio de diluciones seriadas. 6. Se pipeteó de igual manera 1ml del tubo marcado con 10-2 al tubo marcado con 10-3 7. Este mismo procedimiento se realizó hasta la dilución 10-6, y se utilizó una nueva pipeta para cada uno. 8. Una vez terminada la última dilución, se transfirió 0.1 ml del tubo 10-6 a la caja de petri marcada con el mismo valor 10-6; se repitió este mismo paso para las demás placas de petri teniendo en cuenta su equivalente en tubo de ensayo, de forma decreciente. 9. Se vertieron 15 ml del medio fundido y de forma inmediata se procedió a homogeneizar la muestra. Figura 5. Adición del medio de cultivo Agar PCA en placa de petri. 10. Este mismo proceso se repitió de forma decreciente con las otras diluciones hasta 10-4 11. Se esperó a estar completamente solidificado y se llevó a incubación en posición invertida a 37°C por 24 hrs. Figura 6. Placas de petri con medios de cultivo en Agar PCA ya solidificado. 12. De las placas sometidas a incubación se seleccionó las que presentaron entre 30-300 colonias y se registró por medio del siguiente cálculo: 𝑈. 𝐹. 𝐶. = # 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠 * 1 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 * 1 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 RESULTADOS Al pasar de 24hr se extrajo de la incubadora el medio de cultivo con las bacterias proliferadas en este para su cuantificación () Figura 7. Cultivo de bacterias en Agar PCA luego de 24hrs. Se utilizó la siguiente fórmula para calcular la cantidad de estas bacterias proliferadas en el medio para constatar las unidades formadoras de colonias que se crearon en éste. Se lograron contar 52 colonias, sin embargo, es necesario determinar por medio de una fórmula las unidades formadoras de colonias. - Cálculo del factor de dilución 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝐷𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 = 𝐹. 𝐷. = - 1𝑔 1𝑔 + 10 𝑚𝑙 𝐺𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑜 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐺𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑜 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 + 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑦𝑒𝑛𝑡𝑒 = 1/11 = 0. 090𝑔 Cálculo de las Unidades formadoras de colonias por g de suelo. 𝑈. 𝐹. 𝐶 = 𝑈. 𝐹. 𝐶 = # 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 𝐹.𝐷. 52 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 = 0.090 577. 77 𝑈𝐹𝐶/𝑔 → 5.777×102 UFC/g ANÁLISIS DE RESULTADOS Es de suma importancia recordar que se tiene que tener en cuenta un número limitado de colonias en la muestra de cultivo, de lo contrario, estas colonias pueden sobrepoblarse y dificultar el conteo de las mismas. El rango sugerido de conteo de acuerdo a la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) es de 25-250 colonias, por otra parte Muchos microbiólogos prefieren placas con 30 a 300 colonias (Tortora, G. J., et al. (2007)) (Food and Drug Administration (2003)). Los resultados obtenidos dieron un número de colonias relativamente bajo al margen de microorganismos esperados, lo cual dio colonias relativamente aisladas y fáciles de cuantificar como se muestra en la figura 7. También cabe recalcar que por contratiempos en tiempos de muestreo solo se pudo cuantificar una de las 3 cajas de petri después de la incubación así que solo se pudo tomar registro de la proliferación de una sola comunidad de colonias bacterianas; existió un posible error al momento de la inoculación, es decir, la muestra se diluyó más de lo esperado por lo que la cantidad de colonias encontradas era mínima en contraposición con las muestras de los demás grupos de laboratorio, es necesario tener en cuenta también el tipo de bacterias que se encontró y por qué no existió una proliferación notable, sin embargo, es más probable que este resultado sea consecuencia de un error técnico en el manejo de estos instrumentos para la inoculación por parte de la muestra de suelo diluido. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS - Ramírez S, J., Parra V., J., & Alvarez Aldana, A. (2017). Análisis de técnicas de recuento de Microorganismos. Mente Joven, https://doi.org/10.18041/2323-0312/mente_joven.0.2017.3665 - 6, 01-08. F., E., R, D., L., R., H., M., & M., E. (2022). Simulación y Conteo de Unidades Formadoras de Colonias.. Redalyc.org. Retrieved 27 June 2022, from https://www.redalyc.org/jatsRepo/5122/512253717006/html/index.html. - Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9thed.Arlington, VA: AOAC. - Ministerio de agricultura y ganadería MAG & Instituto interamericano para la cooperación para la agricultura IICA (2001) Manual de Procedimientos Para El Control Microbiológico de Alimentos. Asunción, Paraguay - Cely-Ramírez, Luz Edith, Pérez-Rubiano, Claudia Constanza, Parra-Arias, Helver, & Galindo, Daniel Humberto. (2021). Determinación de la Calidad Microbiológica del Río Toca-Boyacá, Sector Tuaneca abajo y el Centro. Revista Lasallista de Investigación, 18(1), 192-202. Epub March 20, 2022.https://doi.org/10.22507/rli.v18n1a12 - Acosta, A., Leguizamo, E. (2020) Métodos y técnicas de cuantificación microbiana empleados en la industria de alimentos, farmacéutica, agrícola y ambiental. revisión sistemática de la literatura [Tesis de pregrado]. Pontificia Universidad Javeriana de Colombia. CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es el objetivo de realizar diluciones seriadas para llevar a cabo cuantificación de microorganismos? R// Pequeñas alícuotas de estas diluciones son sembradas en medio nutritivo en placa, en el cual las bacterias se desarrollan formando colonias. En las placas donde la concentración de la alícuota sembrada es muy alta, las bacterias formarán un crecimiento masivo, no obstante si la concentración es muy baja, el número de UFC (Unidades formadoras de colonias) podrá ser muy bajo. Entre los dos extremos de las diluciones, alguna de las placas contendrá un número de colonias entre 30 y 300, permitiendo la cuantificación de las colonias de bacterias presentes en el medio de cultivo. Esta metodología tiene la ventaja de tener un buen límite de detección, sin embargo consume mucho tiempo durante los plaqueos; en el caso de realizar el recuento de bacterias a partir de muestras cuya población se desconoce se requiere realizar el extendido de siete diluciones y la muestra original (para cada conteo) lo que significa consumir ocho placas de cultivo y alrededor de 25 minutos para los plaqueos, sin tomar en consideración repeticiones. 2. Investigue el fundamento de las técnicas que existen para el conteo total de microorganismos. R// - Recuento en placa: Se utiliza para determinar cuál es el número de microorganismos viables en un medio líquido. Cuando la concentración es baja se procede a filtrar la muestra por medio de una membrana que será pasada al medio de cultivo, en una placa de Petri. Los microorganismos retenidos en la membrana se desarrollarán formando colonias, permitiendo su cuantificación. Cuando la concentración es alta, se procede a la preparación de diluciones seriadas en una secuencia de 1:10, alcanzando diluciones de 10-7 o mayores. Pequeñas alícuotas de estas diluciones son sembradas en medio nutritivo en placa, donde las bacterias se desarrollan formando colonias. En las placas donde la concentración de la alícuota sembrada es muy alta, las bacterias formarán un crecimiento masivo, pero si la concentración es muy baja, el número de UFC podrá ser muy bajo. Entre los dos extremos de las diluciones, alguna de las placas contendrán un número de colonias entre 30 y 300, permitiendo la cuantificación. En este método se estudian dos variables: el recuento en placa por siembra en profundidad, y el recuento en placa por siembra en superficie. - Recuento microscópico: Para estos recuentos se utilizan generalmente cámaras de recuentos, aunque también pueden realizarse a partir de muestras filtradas en membranas y transparentadas teñidas con colorantes fluorescentes. Los recuentos microscópicos directos permiten determinar el número de células microbianas, por observación directa en el microscopio. Presentan una gran ventaja ya que la muestra puede utilizarse tal cual, o puede prepararse una dilución tal como se realiza para otros métodos de recuento. 3. Para que se utilizan estas técnicas en el área médica e industrial R) Este método se utiliza con el objetivo de conocer qué tan probable es que un medio se contamine o que tantas bacterias o microorganismos se puedan desarrollar o tengan una alta tasa de proliferación en un medio. 4. Investigue qué métodos comerciales existen para el conteo de bacterias, mohos y levaduras y cuál es su fundamento? MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN MICROBIOLÓGICA EN LA INDUSTRIA DE ALIMENTOS se ha iniciado la implementación de técnicas fluorimétricas, inmunológicas, eléctricas y colorimétricas, para la detección y cuantificación microbiológica en alimentos ya que son rápidas y pueden ser utilizadas en varias fases del proceso de elaboración de un alimento .Una de las técnicas que cumple con las características descritas anteriormente, es la filtración por membrana utilizando como producto el petrifilm®, que se utiliza para monitorear la población microbiológica en el procesamiento de alimentos y los productos finales [28]. Al mismo tiempo, se emplea la microscopía de epifluorescencia (MDE) para detectar y cuantificar bacterias viables en superficies de supermercados, en los procesos de limpieza y desinfección, lo que permite realizar correcciones inmediatas a este tipo de programas, previniendo así la contaminación cruzada entre las superficies y los productos alimenticios MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN MICROBIOLÓGICA EN LA INDUSTRIA FARMACÉUTICA Los productos farmacéuticos se utilizan ampliamente para la prevención, diagnóstico y tratamiento de enfermedades. De acuerdo, con la Farmacopea Europea, no es requerido que todos los productos de origen farmacéutico sean estériles, pero deben ser monitoreados para prevenir la inactivación de los principios activos del producto, garantizando la seguridad pública. Además, la cuantificación en varios entornos es relevante para determinar la calidad en materias primas, en vista de que pueden presentar contaminantes como Clostridium tetani y Pseudomonas aeruginosa. En principio, para obtener un dato cuantificable de microorganismos se hace el uso de técnicas y métodos rutinarios como el recuento en placa y la estandarización de inóculo ya que permiten la determinación del número viable de los microorganismos, confirmando la eficacia de los métodos de prueba y los medios de cultivo MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN MICROBIOLÓGICA EN EL SECTOR AGRÍCOLA La microbiota del suelo cumple una amplia gama de funciones en los procesos biológicos (ciclos biogeoquímicos), debido a las diferentes capas que componen el suelo, las bacterias y hongos suelen acumularse en distintos puntos, algunos de estos puntos son conocidos como “hots spots o zonas calientes” regiones que son de interés para la actividad biológica que tiene lugar frente a las condiciones estándar del suelo. Algunas técnicas como microtomografía de rayos X, permiten cuantificar no solo la estructura del suelo, también, brinda información acerca de la actividad de las poblaciones bacterianas presentes. Además, cuando se emplea junto con la excitación por luz UV, se logra la visualización de Pseudomonas sp a través de una emisión de auto fluorescencia azul, permitiendo diferenciar las células del contenido arcilloso del suelo.
