REACTIVIDAD CRUZADA DE LAS PROTEÍNAS DE Mycobacterium smegmatis CON SUEROS POSITIVOS A TUBERCULOSIS BOVINA M.C. Quevedo Rocha Gilberto Docente-Investigador del Centro de Bachillerato Tecnológico Agropecuario Núm. 261 de Villa Juárez, Navolato, Sinaloa Quevedo Rocha Gilberto1 quevedo-10@live.com.mx, Gaxiola Camacho Soila Maribel2 soilagaxiola@uas.edu.mx, Castro Del Campo Nohemí2 ncastro@uas.edu.mx, Cárdenas Contreras Miguel Antonio1 cardenasmca5@gmail.com, Rodríguez Gaxiola Miguel Ángel2 m_angel@uas.edu.mx,, Barraza Tizoc Claudia Leonor1 clavob@uas.edu.mx, Cepeda Quintero Higinio1 higinio.cepeda@uas.edu.mx Enríquez Verdugo Idalia2*. enver@uas.edu.mx del Doctorado en Ciencias Agropecuarias, Colegio de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Autónoma de Sinaloa. 2PITC Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Sinaloa. 3Docente Investigador Centro de Bachillerato Tecnológico Agropecuario (CBTA) 261. *Autor de correspondencia: Enríquez Verdugo Idalia. Blvd. San Ángel 3886, Mercado de Abastos, San Benito, 80260. 6677181650. Culiacán de Rosales, Sinaloa, México. 1Estudiante Noviembre del 2022 1 INTRODUCCIÓN GENERALIDADES • Bacteria aerobia. • Sobrevive en un ambiente hostil dentro de los macrófagos. • Se transmite por vía aérea. • Basta inhalar una pequeña cantidad de bacilos para contraer la infección. Mycobacterium tuberculosis • Fácil adaptación al medio intracelular de los macrófagos. • Pasa décadas en el hospedero, antes de expresarse. • Enfermedad aguda o reemergente. • Es una de las principales causas de muerte entre las enfermedades infecciosas. (Mehrotra et al., 2014; Álvarez et al., 2009; OMS, 2017) 2 La tuberculosis es una enfermedades infecciosas que causan grave daño a la salud pública. 10 millones de personas enfermaron y 1.6 murieron por esta causa. Además, un millón de niños enfermaron de los cuales 230 000 murieron (OMS, 2019). 3 Tuberculosis bovina: Enfermedad infectocontagiosa causada por Mycobacterium bovis. Es transmisible al hombre (enfermedad zoonótica), a través del consumo de productos lácteos contaminados, no pasteurizados o por el contacto con animales infectados (SENASICA, 2019). Hay disminución en la producción tanto de leche como en producción de carne, de igual forma, debido a la presencia de lesiones causadas por esta enfermedad, el decomiso de carne por pieza o en canal (SENASICA, 2019). 5 Manifestaciones Clínicas en Bovinos Principales síntomas. Debilidad progresiva. Pérdida de apetito. Pérdida de peso. Fiebre fluctuante. Tos seca intermitente y dolorosa. Aceleración de la respiración (taquipneas), dificultad de respirar (disnea). Sonidos anormales en la auscultación y percusión. Diarrea. Como se transmite? La vía respiratoria. Otra vía de infección es la vía digestiva. Los animales ingieren saliva u otras secreciones del animal infectado (comederos o bebederos infectados) algo muy importante es que un solo animal enfermo puede transmitir la enfermedad a muchos otros antes de manifestar los primeros signos clínicos. (SENASICA, 2019) 6 Homología M. smegmatis: Saprófita excepcionalmente causa daños en el cuerpo humano. Comparte con Mt mas de 2000 genes homólogos mas de un 90%. Proteína esat-6. 3 a 5 µm de longitud Ácido-alcohol resistentes Forman colonias visibles en un medio sólido a partir de un inóculo diluido en un período de 5-7 días. Crecimiento rápido. Tinción de Ziehl-Neelsen. M. tuberculosis: Patógena. 2-3 um de longitud y diámetro de .3 a .6 µm Lípido componen el 60% de la pared celular. Crecimiento lento 2 a 6 sem. No fotocromógena. Ácido-alcohol resistentes Resistentes a los ácidos, álcalis y desinfectantes. Resisten la desecación y la congelación. Luz ultravioleta y el calor (>65º C durante 30 min) las inactiva. Proteína ESAT 6. Tinción de Ziehl-Neelsen. M. bovis: Tamaño promedio de 0,2-0,7 micras de ancho por 1-10 micras de largo. Sus células no presentan una cápsula protectora ni producen esporas. Más del 60% de la membrana compuesta por lípidos. Genoma similar al de M. tuberculosis. Comparte con Mt mas de 2000 genes homólogos mas de un 90%. Ácido-alcohol resistentes. Forman colonias visibles en medio sólido a partir de un inóculo diluido en un período de 5-7 días. Crecimiento rápido Tinción de Ziehl-Neelsen. 6 (Urribarren, 2016; Aznar, 2016; OMS, 2017) 7 Tb depende de ciertos minerales para crecer la Tb incrementa su patogenicidad, los genes que codifican la proteína ESAT6, están presentes en el genoma de M. tuberculosis, H37RV, M. bovis, M. leprae, M. avium y en la cepa avirulenta de M. smegmatis y esta requiere de ciertas condiciones de cultivo durante su crecimiento (Pang et al., 2013). Existen diferencias muy marcadas donde se han probado que los cambios conformacionales dependientes del pH de MtbESAT-6 y MsESAT-6, en condiciones de pH ácido, MtbESAT-6 experimenta un cambio conformacional significativo, mientras que MsESAT-6 muestra poco cambio conformacional en respuesta a la acidificación (De león et al., 2012). 8 ANTECEDENTES DIRECTOS Autor Mycobacteria Lugar Resultado Reyrat y Kahn, 2001 M tuberculosis y M smegmatis USA Actividad metabólica similar Rifat et al., 2009 M smegmatis USA Secreción de Proteínas patógenas Ganguly et al., 2007 M tuberculosis Australia Expresión de proteínas ESAT6, CFP10 López et al., 2016 M smegmatis México, Sinaloa Expresa el mensajero esat-6. 9 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La TBB enfermedad infecto contagiosa del ganado vacuno causada Mycobacterium bovis (M. bovis), de categoría III y de notificación obligatoria por su alto contagio hacia los humanos (OIE, 2012). Afecta los pulmones (TBC pulmonar), otras partes del cuerpo, por ejemplo, ganglios linfáticos, riñones, huesos, articulaciones, etc. Además, puede afectar a personas de cualquier edad, de igual manera a los animales sin embargo las de mayor riesgo son aquellas que están inmunosuprimidas. A nivel mundial se encuentra dentro de las enfermedades bacterianas causantes del 90% de las defunciones en el mundo según la Organización Mundial de la Salud. Los mecanismos de patogenicidad del complejo Mycobacterium tuberculosis se relacionan con su capacidad de sobrevivir en un ambiente hostil dentro de los macrófagos. Al estar atrapadas en el interior de las células del hospedero M. tuberculosis debe responder a las condiciones de carencia de nutrientes. ¿Cuál es la reactividad cruzada de las proteínas de Mycobacterium smegmatis bajo condiciones de limitación con fosforo en sueros de Tuberculosis9 Bovina? 10 80 y 90 de muertos al año registrados por defunción de esta enfermedad (OMS, 2015) JUSTIFICACIÓN 40 millones de dólares por desechos, 17% Producción de leche, 15% ganancia de peso y la tasa de conversión alimenticia y fertilidad en un 6%, se afecta la movilización del ganado causando efecto en la economía por alrededor de los 450 millones de dólares anuales (SENASICA, 2019) • 775 CASOS BOVINOS Y 775 SACRIFICADO (OIE, 2017) 2600 - 2700 muertos por Tb Enfermedad degenerativa silenciosa. Afecta a animales enfermos y sanos. Los signos aparecen hasta que el animal infectado presenta su estado terminal con lesiones tuberculosas en pulmones, ganglios linfáticos y otras partes del cuerpo de acuerdo a la vía de contagio. Afecta principalmente a los hatos ganaderos con explotación Intensiva. Puede ser confundida con otras enfermedades frecuentes causando cuantiosas pérdidas económicas en producción de leche y carne. (Pulgar, 2010). 11 Situación actual de Tuberculosis Bovina Al 17 de enero de 2019 se ha reconocido el 85.77% del territorio nacional en fase de erradicación (Prevalencia menor al 0.5%). SENASICA 2019 11 HIPÓTESIS La limitación de fósforo en el medio de cultivo genera cambios en M. smegmatis que provocan la expresión antigénica con los sueros de bovinos positivos a tuberculosis. 12 OBJETIVOS Objetivo General • Determinar los grupos de proteínas antigénicas de M. smegmatis que presentan reactividad cruzada bajo condiciones de limitaciones con fósforo con sueros de bovino positivos a tuberculosis. Objetivos Específicos: • Expresar proteínas de M. smegmatis bajo restricción de fósforo. • Obtener proteínas de sobrenadante y totales de M. smegmatis restringidas en fósforo. • Detectar proteínas antigénicas de M. smegmatis con sueros de bovinos positivos a tuberculosis. 13 MATERIAL Y MÉTODOS Tipo de estudio: observacional: descriptivo • El presente trabajo se realiza en el Laboratorio de Parasitología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Sinaloa. La cepa de M. smegmatis que se utiliza es la mc2 155 MEDIOS DE CULTIVO Tinción de Zi ehl-Neelsen Tinción de ZiehlNeelsen Tinción de ZiehlNeelsen Cultivo de M. smegmatis en 7h9 Sólido Cultivo de M. smegmatis en 7H9 Líquido HDB CON P Y -P 16 OBTENCIÓN DE PROTEÍNAS SOBRENADANTE Y TOTALES Las proteínas totales centrifugación a 4000 rpm/10 min Se precipitaron en alcohol absoluto 1:1, por 24 h a -70°C. Posteriormente se centrifugó a 20000 rpm 90 min a 4º C Proteínas totales por sonicación. Sonicado se centrifugó a 12000 rpm por 30 min 15 Cuantificación de proteína (calibración con BSA) La absorbancia en un espectrofotómetro, a 630 nm. La concentración por método de Bradford (1976), y curva de calibración con BSA. 16 CURVA PATRÓN 17 INMUNODOT (dot-blot) Goteo 1,2 Y 3 µg de muestra de proteínas de sobrenadante y precipitado de M. smegmatis en membranas de nitrocelulosa Incubación por 2 h con a peroxidasa Bloqueo de membranas con leche descremada incubación por 2 h a 37°C incubación por 24 h a 37°C con sueros de bovinos positivos a tuberculosis Revelado con diaminobencidina y sol. NICO 20 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Las proteínas del sobrenadante de M. smegmatis expresadas en limitación de fósforo que son reconocidas por sueros de bovinos positivos a tuberculosis como se presenta en las siguientes membranas donde claramente se observa la reacción cruzada de las proteinas de Mycobacterium smegmatis Fig. 1 Fig. 2 Fig. 3 23 CONCLUSIONES Contamos con un complejo de proteínas en sobrenadante de los cultivos de M. smegmatis que reaccionan antigénicamente, lo cual es esencial para el diagnóstico de Tuberculosis bovina. 24 25 Diciembre del 2019 • • • • • • • • • LITERATURA CITADA Andersen AB, Ljungqvist L, Olsen M. 1990 Evidence that protein antigen b of Mycobacterium tuberculosis is involved in phosphate metabolism. Journal of general microbiology.;136(3):477-80. Epub 1990/03/01. Álvarez N, Borrero R, Reyes F, Camacho F, Mohd N, Sarmiento ME, Acosta A. 2009 Mechanisms of evasion and persistence of Mycobacterium tuberculosis during the latencystate and potential strategies to control latent infectioVaccimonitor v.18 n.3 Ciudad de la Habana sep.-dic. Borrero R, Álvarez N, Reyes F, Sarmiento ME, Acosta A. 2011 Mycobacterium tuberculosis: factores de virulencia Instituto Finlay. Centro de Investigación – Producción de Vacunas. VacciMonitor;20(1):34-38. Brodin P, Rosenkrands I, Andersen P, Cole ST, Brosch R. ESAT-6 proteins: protective antigens and virulence factors? 2004, Trends in microbiology.;12(11):500-8. De Leon J, Jiang G, Ma Y, Rubin E, Fortune S. 2012.Sun J. Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 exhibits a unique membrane-interacting activity that is not found in its ortholog from non-pathogenic Mycobacterium smegmatis. The Journal of biological chemistry. 287(53):44184-91. Epub 2012/11/15. Derrick SC, Morris SL. 2007 The ESAT6 protein of Mycobacterium tuberculosis induces apoptosis of macrophages by activating caspase expression. Cellular microbiology.;9(6):1547-55. Falcone V, Collins F. 1997Growth of recombinant Mycobacterium tuberculosis H37Ra in mouse macrophages. Clinical and experimental immunology.;109(1):80-3. Ganguly N, Giang PH, Gupta C, Basu SK, Siddiqui I, Salunke DM, 2008. Mycobacterium tuberculosis secretory proteins CFP-10, ESAT-6 and the CFP10:ESAT6 complex inhibit lipopolysaccharide-induced NF-kappaB transactivation by downregulation of reactive oxidative species (ROS) production. Immunology and cell biology.;86(1):98-106. Groat RG, Schultz JE, Zychlinsky E, Bockman A, Matin A. 1986 Starvation proteins in Escherichia coli: kinetics of synthesis and role in starvation survival. Journal of bacteriology.;168(2):486-93. 26 • Gumber S, Taylor DL, Marsh IB, Whittington RJ. 2009 Growth pattern and partial proteome of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosisduring the stress response to hypoxia and nutrient starvation. Veterinary microbiology.;133(4):344-57. Epub 2008/09/13. • Herbst A, Hemann MT, Tworkowski KA, Salghetti SE, Lowe SW, Tansey WP. 2005 A conserved element in Myc that negatively regulates its proapoptotic activity. EMBO reports.;6(2):177-83. Epub 2005/01/29. • Li Q, Engelhardt JF. 2006 Interleukin-1beta induction of NFkappaB is partially regulated by H2O2-mediated activation of NFkappaB-inducing kinase. The Journal of biological chemistry.;281(3):1495-505. Epub 2005/11/16. • Lopez HM, Velarde FS, Enriquez I, Xicotencatl R, Gaxiola SM. 2016 Adaptacion de Mycobacterium Smegmatis ante el agotamiento de nutrients y su efecto en la expression de esat.6, Rev Mex Cienc Pecu;7(1):127-139. • MacGurn JA, Cox JS. 2007. A genetic screen for Mycobacterium tuberculosis mutants defective for phagosome maturation arrest identifies components of the ESX-1 secretion system. Infection and immunity. 75(6):2668-78. Epub 2007/03/14. • OIE. (20 de 11 de 2012). Tuberculosis Bovina. • OMS. (09 de 03 de 2015). Informe mundial sobre la tuberculosis 2014. Recuperado el 26 de 07 de 2015, de who.int: http://www.who.int/tb/publications/global_report/gtbr14_execsummary_summary _es.pdf?ua=1 • Pang X, Samten B, Cao G, Wang X, Tvinnereim AR, Chen XL, Howard ST. 2013 MprAB Regulates the espA Operon in Mycobacterium tuberculosis and Modulates ESX-1 Function and Host Cytokine Responce. J. Bacteriol. 195(1):66. DOI: 10.1128/JB.01067-12 • Pulgar, C. M. 2010. Tuberculosis Bovina. Recuperado el 18 de 07 de 2015, de umag.cl: http://www.umag.cl/biblioteca/tesis/pulgar_inostroza_2009.pdf • Recuperado el 19 de 04de 2015, de oie.int/doc/ged: http://www.oie.int/doc/ged/D14008.PDF • Reyrat JM, Kahn D. 2001 Mycobacterium smegmatis: an absurd model for tuberculosis? Trends in 27 microbiology.;9(10):472-4. Epub 2001/10/13. • Rifat D, Bishai WR, Karakousis PC, 2009. Phosphate Depletion: A Novel Trigger for Mycobacterium tuberculosis Persistence. The Journal of Infectious Diseases; 200:1126–35 • Roach SK, Schorey JS. 2002 Differential regulation of the mitogen-activated protein kinases by pathogenic and nonpathogenic mycobacteria. Infection and immunity.;70(6):3040-52. Epub 2002/05/16. • Russell DG, VanderVen BC, Lee W, Abramovitch RB, Kim M, Homolka S, Niemann S, Rohde KH. 2010 Mycobacterium tuberculosis wears what it eats. Cell Host Microbe 2010. July 22; 8(1): 68–76. doi:10.1016/j.chom.2010.06.002. • Siegele DA, Kolter R. 1992 Life after log. Journal of bacteriology.;174(2):345-8. • Simeone R, Bobard A, Lippmann J, Bitter W, Majlessi L, Brosch R. 2012 Phagosomal rupture by Mycobacterium tuberculosis results in toxicity and host cell death. PLoS pathogens.;8(2):e1002507. Epub 2012/02/10. • Tobian AA, Potter NS, Ramachandra L, Pai RK, Convery M, Boom WH. 2003 Alternate class I MHC antigen processing is inhibited by Toll-like receptor signaling pathogen-associated molecular patterns: Mycobacterium tuberculosis 19-kDa lipoprotein, CpG DNA, and lipopolysaccharide. J Immunol.;171(3):1413-22. • Van der Wel N, Hava D, Houben D, Fluitsma D, van Zon M, Pierson J. 2007 M. tuberculosis and M. leprae translocate from the phagolysosome to the cytosol in myeloid cells. Cell.;129(7):1287-98. • Yadav M, Roach SK, Schorey JS. 2004 Increased mitogen-activated protein kinase activity and TNF-alpha production associated with Mycobacterium smegmatis- but not Mycobacterium avium-infected macrophages requires prolonged stimulation of the calmodulin/calmodulin kinase and cyclic AMP/protein kinase A pathways. J Immunol.;172(9):5588-97. 28
