Morfofisiología temprana de agaves mezcaleros en condiciones limitantes de nutrientes PCB revisado

Morfofisiología temprana de agaves mezcaleros en condiciones limitantes de nutrientes.
Propuesta de investigación para el Doctorado en Ciencias Biológicas
Autor:
Nixon Florez Velasco I.A. Ms.C
Tutor Principal: Dr. Ulises Y. Rosas López
Comité tutor:
Dra. Margarita Collazo Ortega (Facultad de Ciencias)
Dr. Alfonso Valiente Banuet (Instituto de Ecología)
Universidad Nacional Autónoma de México
2022
Resumen
En un mundo que continuamente se calienta y se seca debido a efectos antropogénicos, a la
degradación de la tierra cultivable y al aumento en la población, se incrementará la demanda de
cultivos en regiones áridas y semiáridas. Los agaves han sido usados como fuentes de comida,
bebidas (mezcal) y fibras para sociedades desde hace cientos de años en México ya que pueden
crecer en zonas marginales con temperaturas y sequías extremas gracias a sus adaptaciones
morfológicas y metabólicas como el Metabolismo Ácido de las Crasuláceas (CAM por sus siglas en
inglés) y a la producción de fructanos. Sin embargo, la cosecha de plantas silvestres para la
obtención principalmente de mezcal conduce a la reducción de las poblaciones naturales y a la
erosión genética. Por lo tanto, el objetivo de este estudio es determinar el efecto de las interacciones
entre nutrientes minerales sobre la morfología, fisiología, y expresión de genes de plantas de Agave
potatorum, Agave angustifolia y Agave salmiana, tres especies usadas para la producción tradicional
de mezcal en México. Los resultados de este estudio permitirán conocer la capacidad de las plantas
de agave de adquirir los nutrientes del suelo, permitirá entender el papel de los fructanos en
respuesta a diferentes ambientes y eventualmente realizar una explotación sustentable del Agave
basada en propuestas de manejo nutricional.
Palabras Clave: mezcal, nutrición, estrés, erosión genética.
Introducción
El género Agave se incluye en la familia Asparagaceae, subfamilia Agavoidea (Bremer et al., 2009;
Chase et al., 2016). Este género es endémico de América, se encuentra distribuido desde el sur de
los Estados Unidos de América hasta el norte de Sudamérica (Good-Avila et al., 2006). Contiene
alrededor de 210 especies, de las cuales 159 están en México y 129 son endémicas del territorio
mexicano (García-Mendoza et al., 2019).
Las comunidades humanas en México han utilizado al Agave desde hace 10,000 años obteniendo
diferentes productos de sus diferentes estructuras (Callen, 1965). Las especies Agave tequilana y
Agave angustifolia son cultivadas en plantaciones agroindustriales monoespecíficas; la primera para
la extracción de tequila y la segunda ampliamente cultivada en Oaxaca para la obtención de mezcal
(Conabio, 2006; Gentry, 1982). Las demás especies de Agave se encuentran en diferentes
ambientes productivos desde producciones silvestres hasta agroecosistemas que incorporan la
mayor parte de la biodiversidad y el conocimiento tradicional asociado al mezcal y que exhiben
dificultades para su producción y conservación como la reducción de poblaciones naturales y erosión
genética (Aguirre-Dagua and Eguiarte, 2012).
En México, el 60% de su territorio está conformado en su mayoría por ecosistemas áridos y
semiáridos en donde las plantas de Agave habitan (Lara-Ávila and Alpuche-Solís, 2016; Montaño et
al., 2016). Allí, los suelos se caracterizan por presentar altos contenidos de carbonatos, pH alcalino,
textura arcillosa, poca profundidad y baja disponibilidad de nutrientes (de Jesús Romero Fernández
et al., 2019). En consecuencia, las plantas de Agave han evolucionado en adaptaciones fisiológicas
y anatómicas que le permiten habitar ambientes donde el agua y los nutrientes son limitados (Nobel,
1988; Stewart, 2015).
El arreglo en roseta de estas plantas permite una máxima absorción de la radiación
fotosintéticamente activa y permite la canalización del agua condensada hacia su sistema radical
superficial (Nobel, 1988). Las plantas de Agave incrementan el crecimiento de raíces laterales y la
densidad y longitud de los pelos radiculares en la superficie del suelo para la adquisición de
nutrientes limitantes y agua (Lynch, 2011; Miguel et al., 2013; Langlé-Argüello et al., 2019). A su vez,
la disponibilidad de nutrientes desencadenan mecanismos de respuesta en la síntesis de moléculas
protectantes o de reserva (Stewart, 2015). Es así que, plantas de Agave potatorum muestran
incrementos en la producción de fructanos frente a condiciones de estrés (Langlé-Argüello et al.,
2019). Los fructanos son polímeros solubles en agua basados en fructosa almacenados en vacuola,
actúan como reservas de carbohidratos para ser usadas a largo plazo, tienen una alta capacidad
bio-protectante y son usados para la producción de mezcal (Pérez-López and Simpson, 2020;
Morales-Hernández et al., 2019). Se ha reportado que en condiciones de estrés, las plantas de
Agave de las especies Agave tequilana y Agave inaequidens incrementan la expresión de
fructosiltransferasas y la producción de fructanos como mecanismo de tolerancia (Suárez-González
et al., 2014). Aunque estas especies de Agave crecen y se reproducen naturalmente en condiciones
de estrés existe evidencia que demuestran que aplicaciones de nutrientes estimulan el crecimiento y
la cantidad de azúcares almacenados y reducen su tiempo a cosecha (Enríquez del Valle et al.,
2016; Langlé-Argüello et al., 2019; Martínez-Ramírez et al., 2013).
Sin embargo, aún existe un amplio vacío en el conocimiento de la manera en que las plantas de las
diferentes especies de Agave detectan, traducen y se adaptan a las señales provenientes de la
disponibilidad de nutrientes en el medio que merecen ser abordadas para entender mejor la
regulación en la nutrición de estas plantas entender el papel de los fructanos en respuesta a
diferentes ambientes y eventualmente realizar una explotación sustentable del Agave basada en
propuestas de manejo nutricional. Es por esto que, el objetivo de esta propuesta es determinar el
efecto de las interacciones entre nutrientes minerales sobre la morfología, fisiología y expresión de
genes de plantas de tres especies de Agave usadas para la producción tradicional de mezcal en
México.
Pregunta de investigación
¿Cómo es que las combinaciones e interacciones de nutrientes minerales pueden causar cambios a
nivel morfológico, fisiológico y molecular, durante el crecimiento temprano de plantas de tres
especies de agave mezcalero?
Hipótesis
Las plantas de agave presentarán alteraciones morfológicas, fisiológicas y moleculares en respuesta
a las interacciones combinatorias entre nutrientes minerales. Por ejemplo, de acuerdo a Bouain et al.
(2019) las modificaciones en los niveles de P y la interacción con Fe y Zn modifican la arquitectura
de la raíz, afectan el crecimiento y reducen la acumulación de fructanos en plantas de Agave..
Objetivos específicos
1. Determinar las modificaciones sobre la arquitectura y el crecimiento del brote y raíz de
plantas de Agave potatorum, Agave angustifolia y Agave salmiana sometidas a variaciones
en las concentraciones de nutrientes minerales.
2. Determinar los cambios en la fisiología de plantas de Agave potatorum, Agave angustifolia y
Agave salmiana sometidas a variaciones en las concentraciones de nutrientes minerales.
3. Determinar a nivel molecular metabólico el efecto de variaciones en las concentraciones de
nutrientes minerales en plantas de Agave potatorum, Agave angustifolia y Agave salmiana
Antecedentes
Producción de Mezcal
El término mezcal proviene de la palabra náhuatl mexcalli “Agave al horno” aplicado a las bebidas
alcohólicas destiladas de forma tradicional en regiones ubicadas en el norte de Tamaulipas y Sonora
hasta el sur de Oaxaca (Aguirre-Dugua and Eguiarte, 2013). La producción de mezcal hace parte de
un sistema de producción altamente localizado, con prácticas altamente especializadas que lo hacen
difícil de imitar o producir en otro espacio geográfico (Camacho Vera et al., 2020). El mezcal, se
identifica con la región de Oaxaca dentro de una macro región definida en criterios normativos de la
Denominación de Origen Protegida Mezcal (DOP Mezcal). Así mismo, la Norma oficial mexicana
070-SCFI-1994 define al mezcal como una bebida alcohólica que se obtiene por destilación de los
jugos derivados de la fermentación de cabezas cocidas de maguey de cualquier especie de agave,
siempre y cuando sea cosechado dentro del área considerada como protegida por la DOP Mezcal
(Comite Consultivo Nacional, 2016). Últimamente, el mezcal ha llegado a convertirse en una bebida
de moda en el mercado mundial de bebidas alcohólicas, gracias a su proceso artesanal, exótico y
genuino que lo diferencia de otros procesos de bebidas similares como el tequila, aumentando su
demanda.
Variedades de agave
Por su parte, los seres humanos facilitaron la aparición de nuevas especies de Agave (Lara-Ávila
and Alpuche-Solís, 2016; Parker et al., 2010). Entre las especies de Agave de importancia
económica utilizadas para obtener el Mezcal se destacan; Agave angustifolia es la especie de Agave
con mayor distribución desde Panamá hasta el estado de Sonora. Es ampliamente cultivada en el
estado de Oaxaca y es la principal fuente del mezcal comercial producido en México (Aguirre-Dugua
and Eguiarte, 2013; Gentry, 2021). Creciendo en ambientes tropicales de bosques de pino y
matorrales xerófilos entre 300 y 1800 metros sobre el nivel del mar (Gentry, 2021). La morfología de
esta especie presenta rosetas de 1.5 a 2.0 m de altura y 1.5 a 2.0 de ancho. Se presentan de 40 a
120 hojas por individuo de forma lanceolada, rígida, cóncava de coloración verde claro, de 60 a 120
cm de largo y 35 -10 cm de ancho (Gentry, 2021). El Agave salmiana se localiza en los estados de
Zacatecas, San Luis de Potosí y Durango, México. En las poblaciones silvestres se han descrito las
variantes 'Blanco', 'Chino' y 'Liso' usadas principalmente para fabricar mezcal. Sus plantas adultas
presentan diferencias morfológicas en sus hojas y espinas laterales y en su reacción a la
temperatura de germinación en condiciones de laboratorio (Díaz et al., 2011). Es una especie con
rosetas de 1.5 a 2.0 m de altura con raíz "fibrosa", hojas de color verde obscuro a verde glauco,
emite un escapo floral de hasta 4 m entre los 8 y 10 años de edad, con flores hermafroditas
amarillo-verdosas de 10-12 cm de largo; el fruto es una cipsula oblonga con pequeñas semillas
negras (Gentry, 2021). Agave potatorum llamada comúnmente maguey tobalá. Es una especie de
Agave silvestre representativa por su uso para obtener mezcal del suroeste de México. Es endémica
de las pendientes en la Sierra Madre del Sur y del Valle de Tehuacán. Plantas de esta especie se
encuentran en ecosistemas secos como bosques de encino y bosques tropicales caducifolios
considerados entre los tipos de vegetación más amenazados en México debido a la fragmentación y
perturbación causada por actividades de desmonte, pastoreo y deforestación (Trejo et al., 2000). Se
ha reportado que esta especie depende únicamente de la reproducción sexual debido a que no
produce bulbos ni ramificaciones laterales (García-Meneses, 2004). El sistema de extracción de
plantas de A. potatorum se basa en la extracción de plantas reproductivas anualmente bajo un
enfoque forestal y contrasta con los periodos de 5 a 8 años para cosecha de A angustifolia y A.
tequilana (Aguirre-Dugua and Eguiarte, 2013).
Metabolismo del agave y adaptaciones fisiológicas en respuesta al estrés
Los agaves han sido usados como fuentes de comida, bebidas y fibras para sociedades desde hace
cientos de años en México. El Agave exhibe potencial como cultivo ya que puede crecer en zonas
marginales áridas y semiáridas gracias a la evolución de adaptaciones como el metabolismo ácido
de las crasuláceas (CAM) que le permite sobrevivir en condiciones de temperaturas y sequías
extremas (Stewart, 2015). Este mecanismo está presente en Agave, lo que significa que el aporte
de ganancias diurnas de CO2 por el mecanismo C3, que también se encuentra presente, es casi
nulo. Reflejándose en una baja plasticidad fotosintética en plantas de Agave y maximizando el uso
eficiente del agua al fijar el carbono en la noche (Holtum and Winter, 2014). Así mismo, las hojas
suculentas y ricas en fibra permiten la fijación continua de CO2 y demás procesos bioquímicos aun
en extensos periodos de sequía que pueden alcanzar 7 años o más (Lüttge, 2010). La morfología de
la planta de Agave ha evolucionado para permitir su establecimiento y colonización de ambientes
desérticos y suelos rocosos y de baja fertilidad (Gentry, 2021; Nobel, 1988).
Las interacciones entre nutrientes minerales y la arquitectura de la raíz
Las interacciones entre nutrientes inducen cambios en el desarrollo de las plantas como
modificaciones en la arquitectura del sistema radical (Richardson et al., 2009). Se han reportado
varios efectos antagónicos, sinérgicos y nulos de la combinación de deficiencias de nutrientes sobre
la arquitectura del sistema radical en comparación con las deficiencias de un solo nutriente
(Kellermeier et al., 2014; Ward et al., 2008). En el caso de las plantas de Agave los incrementos en
la fertilización nitrogenada (N) aumentaron el peso seco de los brotes sin cambios en el peso seco
de la raíz, cuando el elemento que varía es el fósforo (P), las plantas de Agave reducen el
crecimiento de sus raíces en respuesta a los incrementos de este nutriente (Quero and Linares,
1988). En ambos casos, se reduce la relación raíz/brote, esta reducción en tamaño de la raíz puede
ser una adaptación o una desventaja para la adquisición de agua y otros nutrientes. Así que,
estudiar la capacidad de las plantas de agave de adquirir los nutrientes del suelo es un objetivo
primordial para facilitar su explotación sustentable.
En México, predominan los ecosistemas áridos y semiáridos abarcando un 60% de su territorio
(Montaño et al., 2016). Allí, los suelos se caracterizan por presentar altos contenidos de carbonatos,
pH alcalino, textura arcillosa, poca profundidad y baja disponibilidad de fósforo (de Jesús Romero
Fernández et al., 2019). El fósforo (P) es un macronutriente esencial para el crecimiento y desarrollo
de las plantas. Se encuentra en los ácidos nucleicos (ADN), en las moléculas fuente de energía
como el ATP y actúa en la regulación de las señales de transducción vía fosforilación (Bouain et al.,
2019).
En el suelo la distribución del fósforo es heterogénea usualmente se encuentra en las capas
superiores (Heppell et al., 2015). El hierro (Fe) y el Zinc (Zn) están involucrados en procesos
biológicos que aseguran el adecuado funcionamiento celular. Son cofactores de numerosas enzimas
y están involucrados en los procesos de fotosíntesis y respiración (Couturier et al., 2013). La
reducción en el crecimiento de la raíz en deficiencias de P ha sido propuesta como un resultado de
la toxicidad de Fe (Ward et al., 2008).
Como adaptación, las plantas incrementan el crecimiento de las raíces laterales y la densidad y
longitud de los pelos radiculares en las capas superficiales para la adquisición de fósforo (Lynch,
2011; Miguel et al., 2013). A su vez, modificaciones en las concentraciones de nutrientes
incrementaron la producción de fructanos en plantas de Agave potatorum. Sin embargo, La manera
en que las plantas de Agave detectan, traducen y se adaptan a las señales provenientes de la
disponibilidad de nutrientes en el medio son cuestiones biológicas que merecen ser abordadas para
entender mejor la regulación en la nutrición de estas plantas.
Los fructanos y sus propiedades en plantas de Agave
Los fructanos son polímeros solubles en agua basados en fructosa sintetizados a partir de sacarosa
y acumulados en la vacuola. Actúan como reservas de carbohidratos para ser usadas a largo plazo
(Pérez-López and Simpson, 2020). Los fructanos presentan características como estructura flexible,
alta solubilidad, acumulación en altos niveles y asociación con membrana celular estas propiedades
son intrínsecas a su papel en la señalización en el desarrollo y en las respuestas al estrés (Van den
Ende, 2013; Versluys et al., 2018).
Los Agaves utilizan los fructanos como fuente de carbohidratos para el cambio entre la etapa
vegetativa y la reproductiva. El rápido crecimiento de la inflorescencia demanda grandes reservas de
fructanos, razón por la cual la inflorescencia es removida en condiciones de cultivo (Pérez-López
and Simpson, 2020). Así mismo, los fructanos son también utilizados durante la reproducción
asexual dado que los chupones se producen a partir de rizomas o bulbillos en las inflorescencias y
dependen de los fructanos almacenados en la planta madre (Szarek et al., 1996). La especie Agave
victoria-reginae acumula fructanos en el tejido de hidrénquima de las hojas apoyando la evolución de
la acumulación de fructanos como una adaptación de Agavaceae a condiciones áridas (Singh et al.,
2020).
Metodología
Ob. 1. Determinar las modificaciones sobre la arquitectura y el crecimiento del brote y raíz de
plantas de Agave potatorum, Agave angustifolia y Agave salmiana sometidas a limitaciones en
nutrientes.
Actividad 1. Obtención de las plantas de Agave y establecimiento de las condiciones de
crecimiento.
Las plantas de Agave de las tres especies seleccionadas se obtendrán a partir de semillas
recolectadas en campo en localidades de los estados de Oaxaca, Jalisco, Michoacán y Zacatecas
lugares donde crecen naturalmente y son cultivadas las tres especies Así mismo, se tendrá en
cuenta las plantas de Agave de la colección del Jardín Botánico (UNAM) y de estas se recolectarán
semillas de ser necesario. Las semillas de estas plantas serán desinfectadas durante 5 minutos en
lejía comercial al 70% y lavadas tres veces con agua destilada dentro de una campana de flujo
laminar con filtro HEPA. Posteriormente, se suspenderán en agar al 0,1% para facilitar su
manipulación y adhesión a la placa de siembra. Las semillas se sembrarán en placas de Petri de 12
× 12 cm (Greiner Bio-One, Cat 688102), con 75 ml de medio Murashige-Skoog al 50 % (Caisson
Labs, Cat MSP09-1LT), con 0,05 sales MES (MP Biomedicals, Cat 152454), con un pH a 5,7 y agar
al 1 % (Sigma Life Science, Cat A1296-1KG). Las plántulas de Agave crecerán en cámaras de
crecimiento en condiciones controladas de temperatura 27°C, humedad relativa del 80% luz continúa
suministrada con tubos fluorescentes.
Actividad 2. Establecimiento de los tratamientos nutricionales y determinación de variables
de crecimiento y morfología.
Plantas de Agave regeneradas a partir del cultivo In-vitro serán sometidas a tratamientos de
variaciones en las concentraciones de P, Fe y Zinc. Se establecerán tratamientos de acuerdo a
Bouain et al. (2019), con ligeras modificaciones que se realizará mediante experimentos previos
sobre plántulas de Agave. Modificación del medio de cultivo de acuerdo con la concentración y el
nutriente mineral a variar. Se determinarán variables de crecimiento como longitud, pesos secos de
parte aérea y raíz y se evaluarán las modificaciones en la arquitectura de la raíz de acuerdo con
Rosas et al. (2021).
Ob. 2. Determinar los cambios en la fisiología de plantas de Agave potatorum, Agave angustifolia y
Agave salmiana sometidas a limitaciones en nutrientes.
Actividad 1. Establecimiento de los tratamientos variaciones en la concentración de los
nutrientes
Plantas de Agave obtenidas en el Ob. 1. Actividad 1. se cultivarán en dos conjuntos; en dos
tratamientos de nutrición. Se cultivará un primer conjunto de plantas en cultivo hidropónico con
solución nutritiva Hoagland; La solución nutritiva se renovará y se ajustará el pH 6.5 cada día y se
aireará diariamente a las 7:00~9:00, 11:00~13:00 y 15:00~17:00 (Xie et al., 2018). Un segundo
conjunto de plantas se cultivará en suelo. Posteriormente, se asignan los tratamientos de elementos
minerales que hayan presentado diferencias significativas en el objetivo 1. Todas las demás
condiciones ambientales (por ejemplo, intensidad y calidad de la luz, eliminación del aire, duración
del fotoperíodo) serán idénticas y controladas (Perdomo et al., 2017).
Actividad 2. Evaluación de variables fotosintéticas, concentración de ácidos en tejidos y
variables de crecimiento y desarrollo
La tasa de fotosíntesis (Pn), la conductancia estomática (gs) y la transpiración (E) serán medidas en
las hojas de las plantas de Agave, usando un sistema portátil conectado a un analizador infrarrojo de
El uso eficiente del agua (WUE) será calculado con los datos de fotosíntesis y transpiración (Pn/E).
Se registraron las variables de tasa de transporte de electrones (ETR), eficiencia fotoquímica actual
del PSII (ФPSII), quenching fotoquímico (qP), quenching no fotoquímico (NPQ), Eficiencia
fotoquímica máxima del PSII (Fv/Fm) y Fluorescencia máxima (Fm). Después de lo cual se
recolectarán las raíces más jóvenes (en la parte inferior de 10 cm de la raíz) y la parte aérea, se
pesarán, se congelarán en N2 líquido, se pulverizan y se almacenan a -80 ° C hasta el análisis
metabolitos y extracción de RNA.
Ob. 3. Determinar a nivel molecular el efecto de la limitación de nutrientes en plantas de Agave
potatorum, Agave angustifolia y Agave salmiana
Actividad 1. Determinación de partidores específicos de genes candidatos involucrados en la
síntesis y degradación de fructanos, extracción, determinación de pureza e integridad de RNA
De los tratamientos contrastantes en el Ob. 2., se tomarán las muestras almacenadas en N2 a -80°C
y se realizará la extracción de RNA siguiendo el protocolo de (Maceda-López et al., 2021). Seguido a
esto, se realizará una búsqueda en las bases de datos de NCBI y revisión bibliográfica de genes
candidatos asociados a la síntesis y degradación de fructanos.
Cada una de las muestras de RNA total, se cuantifican en el equipo NanoDrop One (Thermo
Scientific©) y se determina su pureza de acuerdo con los datos de las relaciones A260/A280 y
A260/A230. En cada uno de estos valores son >2.0 corresponden a muestras de alta pureza. Para la
observación de la integridad se realiza una electroforesis en un gel de agarosa al 1%. Para la
síntesis de cDNA mediante una PCR-RT previamente se realiza un tratamiento de DNAasa
(Promega©). Para la obtención de cDNA se utiliza una transcriptasa reversa SuperScript™
(Invitrogen©).
Actividad 2. Determinación de la expresión (niveles de expresión) de genes candidatos
involucrados en la síntesis y degradación de fructanos en tejidos de plantas de Agave.
Se va a realizar con cada una de las muestras análisis de niveles de expresión (qRT- PCR) de los
genes candidatos asociados a la síntesis y degradación de fructanos identificados en ob. 3. Actividad
1.
Cronograma
OBJETIVOS ESPECÍFICOS PROPUESTA
Año 2022
Año 2023
Año 2024 Año 2025
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Preparación de propuesta de investigación
Act1. Preparación de presentación del proyecto de
título
Act2.Preparación documento del proyecto de título
Act3.Familiarización con sistemas de cultivo in-vitro
con plantas de Agave
Act4. Protocolos de extracciones de RNA en algunas
muestras de Agave
Act 5. Protocolos de medición de variables
fotosintéticas en hojas de plantas de Agave.
OBJ 1: Determinar las modificaciones sobre la arquitectura y el crecimiento del brote y raíz de plantas de Agave
potatorum, Agave angustifolia y Agave salmiana sometidas a limitaciones en nutrientes.
Act 1. Obtención de las plantas de Agave y
establecimiento de las condiciones de crecimiento
Act 2. Establecimiento de los tratamientos
nutricionales y determinación de variables de
crecimiento y morfología
Análisis de resultados
Escritura Primer articulo
OBJ 2: Determinar los cambios en la fisiología de plantas de Agave potatorum, Agave angustifolia y Agave
salmiana sometidas a limitaciones en nutrientes.
Act 1: Establecimiento de los tratamientos variaciones
en la concentración de los nutrientes
Act 2. . Evaluación de tasa fotosintética, concentración de
ácidos en tejidos y variables de crecimiento y desarrollo
Análisis de resultados
Envío de segundo artículo
OBJ 3: Determinar a nivel molecular el efecto de la limitación de nutrientes en plantas de Agave potatorum,
Agave angustifolia y Agave salmiana
Act 1. Determinación de partidores específicos de
genes candidatos fructosiltransferasas y fructano
exohidrolasas
Act 2. Determinación de la expresión (niveles de
expresión) de genes candidatos fructosiltransferasas
y fructano exohidrolasas en tejidos de plantas de
Agave
Análisis de resultados
Redacción de articulo 3
Escritura tesis
Defensa tesis
Literatura consultada
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