TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE ¿QUÉ ES LA TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE? • El término ADN recombinante hace referencia a la creación de nuevas combinaciones de segmentos o de moléculas de ADN que no se encuentran juntas de manera natural. • La tecnología del ADN recombinante utiliza técnicas que provienen de la bioquímica de los ácidos nucleicos unidas a metodologías genéricas desarrolladas originalmente para la investigación de bacterias y de virus. ¿CUÁLES SON SUS APLICACIONES? • Aplicaciones en investigación y medicina - Producción a gran escala de proteínas de utilidad médica - Animales transgénicos - Terapia génica • Aplicaciones industriales • Aplicaciones en agricultura - Mejora genética de los cultivos - Nuevos insecticidas naturales 2 FUNCIONES BÁSICAS • CLONAR (OBTENER MULTIPLES COPIAS) UN GEN • EXPRESAR UNA PROTEÍNA (CODIFICADA POR EL GEN DE INTERÉS) ¿Y CÓMO SE HACE? 2 ELEMENTOS ESENCIALES • SECUENCIA DE ADN DE INTERÉS • VECTOR VECTORES Agentes que pueden insertar un fragmento de ADN dentro de una célula huésped = MOLÉCULA DE ADN TRANSPORTADORA 1. Plásmidos • Inserción de hasta 10kb • Sistema más común 2. Fagos • Filamentosos (M13, capacidad de inserción 10kb) • Tipo I (T1, capacidad 23kb) • Lamba (capacidad 25kb) •P1 (capacidad 100 kb) 3. Cósmidos • Capacidad de 44kb • Plásmidos con sitios cos 4. BAC • Capacidad de 300kb • Cromosoma artificial de bacterias Células Huésped Levaduras Células mamíferas Bacterias Saccharomyces cereviseae, Pichia pastoris, etc. Líneas celulares como CHO ( cél. Ovario Hamster) GRAM NEGATIVAS (E. coli, P.aeruginosa) GRAM POSITIVAS (Bacillus subtilis, S.aureus, Streptommyces) 1. Plásmidos Los plásmidos son moléculas de ADN de doble cadena circular covalentemente cerrado (ccc) extracromosómicas de origen natural que tienen un origen de replicación (ori+) y que se replican autónomamente en las células bacterianas. ¿Porqué son empleados como vectores? Porque son: - Pequeños. - Producen múltiples copias. LOS PLÁSMIDOS SON ELEMENTOS DE TRANSFERENCIA DE INFORMACIÓN GENÉTICA ENTRE BACTERIAS PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE CLONADO GEN DE RESISTENCIA AL ANTIBIÓTICO (MARCADOR DE SELECCION) GEN LACZ (MARCADOR DE SELECCIÓN) SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE ORIGEN DE REPLICACION lacZ AmpR ADN foráneo GEN LACZ SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE AMPR PLÁSMIDO DE CLONADO ORIGEN DE REPLICACIÓN PRODUCTO DE PCR PLÁSMIDO DE CLONADO DIGESTIÓN DEL PLÁSMIDO Y DEL FRAGMENTO DE ADN CON LA MISMA ENZIMA DE RESTRICCION PRODUCTO DE PCR EcoRI EcoRI DIGESTIÓN CON LA MISMA ENZIMA DE RESTRICCION PLÁSMIDO DE CLONADO PRODUCTO DE PCR DIGERIDO CON EcoRI PLÁSMIDO DE CLONADO DIGERIDO CON EcoRI DIGESTIÓN CON LA MISMA ENZIMA DE RESTRICCION LIGACIÓN ¿CON QUÉ? ADN LIGASA ADN LIGASA TUBO CON MEZCLA DE FRAGMENTO DE ADN Y PLÁSMIDO DIGERIDOS CON EcoRI DOS RESULTADOS POSIBLES …. PLÁSMIDO NO RECOMBINANTE PLÁSMIDO RECOMBINANTE TRANSFORMACIÓN BACTERIANA ¿CÓMO? MÉTODO QUÍMICO O FÍSICO TUBO CON MEZCLA DE PLÁSMIDOS RECOMBINANTES Y NO RECOMBINANTES TUBO CON CULTIVO LÍQUIDO DE BACTERIAS BACTERIA NO TRANSFORMADA DOS RESULTADOS POSIBLES …. BACTERIA TRANSFORMADA SIEMBRA PLACAS CON MEDIO AGAR LB SUPLEMENTADO CON AMPICILINA, IPTG Y X-gal INCUBACIÓN A 37°C POR 16 HORAS TRES RESULTADOS POSIBLES …. A. BACTERIA NO TRANSFORMADA EN UN MEDIO CON AMPICILINA LA BACTERIA SIN PLÁSMIDO NO CRECE TRES RESULTADOS POSIBLES …. B. BACTERIA TRANSFORMADA CON PLÁSMIDO NO RECOMBINANTE EN UN MEDIO CON AMPICILINA LA BACTERIA CON PLÁSMIDO CRECE EN UN MEDIO CON IPTG Y Xgal LA BACTERIA CON PLÁSMIDO NO RECOMBINANTE (GEN LACZ INTEGRO) ES AZUL TRES RESULTADOS POSIBLES …. C. BACTERIA TRANSFORMADA CON PLÁSMIDO RECOMBINANTE EN UN MEDIO CON AMPICILINA LA BACTERIA CON PLÁSMIDO CRECE EN UN MEDIO CON IPTG Y Xgal LA BACTERIA CON PLÁSMIDO NO RECOMBINANTE (GEN LACZ DISRUPTO) ES BLANCA PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE EXPRESIÓN COMPONENTES: PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL GEN EN BACTERIAS 1. ORIGEN DE REPLICACIÓN 2. GEN DE RESISTENCIA AL ANTIBIÓTICO (para seleccionar las bacterias que contienen el plásmido; ej. ampicilina) 3. SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE 4. PROMOTOR (debe ser fuerte para tener una expresión elevada) 5. SEÑAL DE TERMINACIÓN (finalización del ARNm) PARA LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA EN CÉLULAS DE MAMÍFEROS PARA LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA EN BACTERIAS 6. GEN REPORTERO 7. GEN DE RESISTENCIA AL ANTIBIÓTICO (para seleccionar las células que hayan incorporado el plásmido a su genoma; ej. neomicina) PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE EXPRESIÓN PLÁSMIDO DE EXPRESIÓN EN BACTERIAS PLÁSMIDO DE EXPRESIÓN EN BACTERIAS: PROTEÍNAS DE FUSIÓN ¿SE PUEDEN EXPRESAR PROTEÍNAS HUMANAS O DE MAMÍFEROS EN BACTERIAS? • Las células bacterianas son extremadamente útiles para la traducción activa de proteínas de mamíferos, immunológicamente activas. • La expresión de genes de mamíferos en bacterias necesita resolver los problemas siguientes: 1. Las proteínas producidas por estos métodos no presentan modificaciones post-tranduccionales. 2. los promotores eucariotas no son reconocidos por las ARN polimerasas bacterianas. 3. los genes eucariotas contienen intrones. 4. los ARNm eucariotas no son todo el tiempo traducidos por los ribosomas bacterianos. 5. las proteínas presentes en grandes cantidades en las bacterias forman cuerpos de inclusión insolubles 6. las proteínas eucariotas pueden ser reconocidas como cuerpos extraños por las proteasas de la bacteria y ser degradadas. EL CASO DE LA INSULINA HUMANA SELECCIÓN DEL PROMOTOR • Según la célula huésped: - Bacteria - Célula eucariotas • Según el tipo de ARN deseado en células eucariotas: - ARNm: ARN POLIMERASA tipo II -ARNsh: ARN POLIMERASA tipo III PLÁSMIDOS DE EXPRESIÓN EN CÉLULAS DE MAMÍFEROS PLÁSMIDOS DE EXPRESIÓN EN CÉLULAS DE MAMÍFEROS MÉTODOS DE TRANSFECCIÓN TRANSFECCION ESTABLE Y TRANSITORIA • Se denomina trasfección transitoria aquella en la que el plásmido no ha sido integrado a uno de los cromosomas eucarióticos. • Se habla de transfección estable cuando el plásmido se ha integrado a uno ó más cromosomas eucariotas. CO-TRANSFECCION La co-transfección es la transfección simultánea de varios plásmidos. Mediante la co-transfección se puede verificar si la transfección se ha realizado correctamente. Para lograrlo se cotransfecta un plásmido cuya presencia es verificada por una reacción rápida y simple que indica que el plásmido de interés ha sido bien transfectado. GENES REPORTEROS O MARCADORES GENES REPORTEROS O MARCADORES GENES REPORTEROS O MARCADORES
