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Revista Internacional de
Ciencias Moleculares
Artículo
Pan­plastoma del ñame mayor (Dioscorea alata) en China:
Variación genética intraespecífica, genómica comparada y
Análisis filogenéticos
Rui­Sen Lu 1,2 , Ke Hu 1,2, Feng­Jiao Zhang 1,2, Xiao­Qin Sun 1,2 , Min Chen 1,2 y Yan­Mei Zhang
1,2,*
1
Instituto de Botánica, Provincia de Jiangsu y Academia China de Ciencias, Nanjing 210014, China
Laboratorio clave de Jiangsu para la investigación y utilización de recursos vegetales, Nanjing 210014, China
* Correspondencia: yanmeizhang@cnbg.net
2
Resumen: Dioscorea alata L. (Dioscoreaceae), comúnmente conocida como ñame mayor, ñame de agua o
ñame alado, es un tubérculo vegetal/cultivo alimentario popular en todo el mundo, con importancia nutricional,
sanitaria y económica. China es un importante centro de domesticación de D. alata y se han establecido
cientos de cultivares (accesiones). Sin embargo, las variaciones genéticas entre las muestras chinas siguen
siendo ambiguas y los recursos genómicos actualmente disponibles para el mejoramiento molecular de esta
especie en China son muy escasos. En este estudio, generamos el primer panplastoma de D. alata, basado
en 44 muestras chinas y 8 muestras africanas, e investigamos las variaciones genéticas, la evolución del
plastoma y las relaciones filogenéticas dentro de D. alata y entre miembros de la sección Enantio phyllum . .
El panplastoma de D. alata codificaba 113 genes únicos y su tamaño variaba entre 153.114 y 153.161 pb. Se
identificaron un total de cuatro haplotipos de plastoma completo (Haps I­IV) en las muestras chinas, sin mostrar
diferenciación geográfica, mientras que las ocho muestras africanas compartieron el mismo haplotipo de
plastoma completo (Hap I). Los análisis genómicos comparativos revelaron que los cuatro haplotipos completos
de plastoma albergaban contenido de GC, contenido de genes, orden de genes y estructuras límite IR/SC
idénticos, que también eran altamente congruentes con otras especies de Enantiophyllum. Además, se
identificaron cuatro regiones altamente divergentes, es decir, trnC – petN, trnL – rpl32, ndhD – ccsA y el exón
Cita: Lu, R.­S.; Hu, K.; Zhang, F.­J.; Sol,
3 de clpP, como posibles códigos de barras de ADN. Los análisis filogenéticos separaron claramente todas
X.­Q.; Chen, M.; Zhang,
las accesiones de D. alata en cuatro clados distintos correspondientes a los cuatro haplotipos, y respaldaron
Y.­M. Pan­plastoma de ñame mayor
firmemente que D. alata estaba más estrechamente relacionada con D. brevipetiolata y D. glabra que con D. cirrhosa, D.
(Dioscorea alata) en China:
En general, estos resultados no sólo revelaron las variaciones genéticas entre las muestras chinas de D. alata, sino
variación genética intraespecífica,
que también proporcionaron la base necesaria para el mejoramiento asistido molecular y la utilización industrial de
genómica comparada y análisis
esta especie.
filogenéticos. En t. J. Mol.
Ciencia. 2023, 24, 3341. https://
Palabras clave: Dioscorea alata; panplastoma; variaciones de haplotipos; genómica comparada; códigos de barras
doi.org/10.3390/ijms24043341
de ADN ; análisis filogenéticos
Editor académico: Zhiqiang Wu
Recibido: 23 de diciembre de 2022
Revisado: 1 de febrero de 2023
Aceptado: 6 de febrero de 2023
Publicado: 7 de febrero de 2023
Copyright: © 2023 por los autores.
Licenciatario MDPI, Basilea, Suiza.
Este artículo es un artículo de acceso abierto.
distribuido bajo los términos y
condiciones de los Creative Commons
Licencia de atribución (CC BY) (https://
creativecommons.org/licenses/by/
4.0/).
1. Introducción
Dioscorea alata L. (también llamado 'ñame mayor', 'ñame de agua' o 'ñame alado') es
una hierba trepadora perenne que pertenece a la sección Enantiophyllum del género Dioscorea L.
(Dioscoreáceas) [1]. Es la especie de ñame (Dioscorea spp.) más cultivada y la segunda más
producida en todo el mundo, incluidos Asia, África, el Pacífico, el Caribe y América [2,3].
Recientemente, esta especie ha ganado un interés creciente tanto por parte de los consumidores
como de los productores, debido a varios atributos valiosos. En primer lugar, D. alata es un importante
cultivo alimentario tradicional y se considera una rica fuente de carbohidratos (75–84%), proteínas
(~7,4%) y vitamina C (13,0–24,7 mg/100 g) [4,5]. En segundo lugar, D. alata tiene suficiente capacidad
para adaptarse a diversos ambientes agroecológicos y climáticos y puede propagarse vegetativamente
fácilmente mediante trozos de tubérculo [6–8]. En tercer lugar, sus tubérculos suelen tener un sabor
delicado, una apariencia atractiva y una excelente capacidad de almacenamiento a largo plazo (4 a 6 meses) [9
En t. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341. https://doi.org/10.3390/ijms24043341
https://www.mdpi.com/journal/ijms
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D. alata es rica en compuestos de metabolitos secundarios, por ejemplo, ácidos fenólicos, flavonoides y
antocianinas, y por lo tanto tiene un gran potencial como alimento saludable y funcional [11]. No hay
duda de que esta especie tiene diversas aplicaciones potenciales para ser utilizada en diferentes
industrias alimentarias y no alimentarias a nivel mundial.
China es un importante centro de domesticación de D. alata, donde se han desarrollado cientos
de variedades cultivadas /variedades locales a lo largo de su larga historia de cultivo [12]. Sin embargo,
la generación de estos cultivares depende en gran medida de la selección humana de mutaciones
somáticas [13,14], mientras que la mejora genética de D. alata está muy por detrás de la de la mayoría
de los demás cultivos. El éxito de los programas de mejoramiento genético radica principalmente en el
nivel de variación genética dentro de las especies, que guiará la selección de padres adecuados para la
reproducción de híbridos y el posterior desarrollo de cultivares mejorados [6,15]. Sin embargo, hasta la
fecha, las variaciones genéticas de las muestras chinas de D. alata siguen siendo ambiguas, aunque
se han realizado varios estudios basados en repeticiones de secuencias simples (SSR). Por ejemplo,
Wu et al. [12] dividieron las muestras chinas de D. alata en dos clados principales, basándose en el
método de grupos de pares no ponderados con media aritmética (UPGMA) y análisis de coordenadas
principales (PCA), mientras que Chen et al. [16] reveló la existencia de tres subpoblaciones en las
adhesiones chinas basándose en un análisis de la estructura de la población basado en modelos. Por
lo tanto, resolver las variaciones genéticas en las muestras chinas de D. alata es un paso esencial hacia
el mejoramiento molecular de esta especie económicamente significativa en China.
Los plastomas de las angiospermas suelen poseer una estructura circular cuatripartita altamente
conservada, con tamaños que varían de 100 a 200 kb, y codifican muchas proteínas clave en relación
con la fotosíntesis y otras funciones celulares importantes, incluida la síntesis de almidón, ácidos grasos,
pigmentos y aminoácidos. [17­19]. Debido a la ausencia de recombinación, los bajos niveles de
sustitución de nucleótidos, el modo de herencia uniparental y el pequeño tamaño efectivo de la población
[20,21], las secuencias de plastomas se han utilizado ampliamente para la identificación precisa de
especies y la inferencia filogenética en diferentes linajes de plantas [21­23 ]. Más recientemente, se han
desarrollado panplastomas para capturar variaciones inter e intraespecíficas [24­26]. Por ejemplo, Magdy
et al. [25] construyeron panplastomas de alta resolución a partir de 321 muestras de Capsicum para
diferenciar cultivares y linajes. Wang y cols. [26] de novo ensamblaron los plastomas de 316 accesiones
de Nelumbo para construir un mapa pan­plastoma confiable e investigar la filogeografía y la diversidad
genética entre ellos. Además, estos estudios también indicaron que los panplastomas tienen varias
ventajas sobre los pangenomas nucleares, como (i) un ensamblaje más fácil que no se ve afectado por
los poliploides, (ii) secuencias de referencia mucho más completas para el ensamblaje, anotación y
comparación, y (iii) la ausencia de grandes regiones sinténicas duplicadas, aliviando así los efectos de
la paralogía genética en la sistemática molecular [26].
Aquí, reunimos de novo plastomas para 44 muestras chinas y 8 muestras africanas , y
aprovechamos estos recursos a escala pan­plastoma para examinar las variaciones genéticas dentro
de las muestras chinas. Al combinarlos con cinco plastomas de la sección Enantiophyllum publicados
previamente (una accesión de cada uno para D. brevipetiolata, D. cirrhosa, D. glabra, D. japonica y D.
polystachya, respectivamente), también desarrollamos marcadores moleculares confiables para estudios
adicionales sobre la taxonomía, filogenia y genética de poblaciones de especies de Enantio phyllum, y
reconstruyó las relaciones filogenéticas dentro de esta sección.
2.
Resultados 2.1. Estructura y organización de los
plastomas de D. alata Se ensamblaron y analizaron con éxito de novo un total de 52 plastomas
(Tabla 1). El tamaño del plastoma en la mayoría de las muestras (34 de ellas, Haps I y II) fue de
153,161 pb, mientras que 16 y 2 muestras tenían tamaños de plastoma reducidos de 153,158 (Hap
III) y 153,114 pb (Hap IV), respectivamente (Figura 1, Tabla 1). Todos estos plastomas conservaron
la estructura cuatripartita típica de los plastomas de angiospermas, que consistía en un par de
regiones de repetición invertida (IR) (25.464 pb), separadas por una región grande de copia única
(LSC) de 83.351 a 83.415 pb y una pequeña copia única. (SSC) región de 18.815–18.836 pb (Figura
1). El contenido de GC en toda la secuencia del genoma (37,0%) y también en las regiones LSC
(34,8%), SSC (31,0%) e IR (43,0%) fue completamente idéntico entre todas las muestras de D. alata.
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Tabla 1. Nombres locales o de cultivares, regiones de cultivo y haplotipos de plastoma completo de Dioscorea
alata utilizadas en este estudio.
Número de adhesión.
Cultivar o nombre local
CDa001
CDa002
CDa003
CDa004
CDa005
CDa006
CDa007
CDa008
CDa009
CDa010
CDa011
CDa012
CDa013
CDa014
CDa015
CDa016
CDa017
CDa018
CDa019
CDa020
CDa021
CDa022
CDa023
CDa024
CDa025
CDa026
CDa027
CDa028
CDa029
CDa030
CDa031
CDa032
CDa033
CDa034
CDa035
CDa036
CDa037
CDa038
CDa039
CDa040
CDa041
CDa042
CDa043
CDa044
ADa001
ADa002
ADa003
ADa004
ADa005
ADa006
ADa007
ADa008
'Minghuai No. 1'
'Quanhuai 1515'
'Quanhuai 1815'
'Shanghang dashu'
'Taihuai No. 6'
'Wuyishan zishanyao'
'Zhenghe hongxinshu'
'Zhouning zishu'
'Ziyushanyao'
'Anxi saobashu'
'Dongyou kuaishu'
'Minghuai No 3
'Zhenghe jiaobanshu'
'Ziyushenshu'
'Hainan danshu'
'Hainan zazi'
'Hainan zabai'
Da90
Da94
'Yangxi nuomishu'
'Suyu No. 2'
'Suyu No. 4'
'Suyu No. 6'
'Ganzhoushangyou baixinshu '
' Ganzhoushangyou zixinshu'
'Hongshuzi'
'Jiaobanshu'
'Wantian zishu'
'Zixin yuantiao'
'Baishu'
'Jiaobanshu púrpura'
'Jiaobanshu'
'Longnante zipishanyao'
'Ximazhuang jiaobanshu'
'Weihai baishu'
'Miyi shanyao'
'Honglong shanyao'
'Yangmingshan shanyao
' 'Chengtuo baishanyao'
'Lijiang zishu'
'Quzhou kuaigenbaishu'
'Ruian shanyao'
'Taizhou yuanshanyao'
'Wencheng nuomishanyao'
Tda00/00005
Tda01/00039
Tda02/00012
Tda05/00015
Tda95­310
Tda95/00328
Tda99/000
48Tda99/00240
Región de cultivo
Sanming, Fujian
Quanzhou, Fujian
Quanzhou, Fujian
Fuzhou, Fujian
Quanzhou, Fujian
Wuyishan, Fujian
Nanping, Fujian
Ningdé, Fujian
Quanzhou, Fujian
Quanzhou, Fujian
Nanping, Fujian
Sanming, Fujian
Nanping, Fujian
Cantón, Cantón
Sanya, Hainan
Qiongzhong, Hainan
Wuzhishan, Hainan
Lingao, Hainan
Danzhou, Hainan
Loudi, Hunan
Xuzhou, Jiangsu
Xuzhou, Jiangsu
Nankín, Jiangsu
Ganzhou, Jiangxi
Ganzhou, Jiangxi
Ganzhou, Jiangxi
Ganzhou, Jiangxi
Ruijin, Jiangxi
Shangrao, Jiangxi
Ganzhou, Jiangxi
Fuzhou, Jiangxi
Ji'an, Jiangxi
Ganzhou, Jiangxi
Ruichang, Jiangxi
Weihai, Shandong
Paizhihua, Sichuan
Jiayi, Taiwán
Taibei, Taiwán
Wenshan, Yunnan
Lijiang, Yunnan
Quzhou, Zhejiang
Wenzhou, Zhejiang
Taizhou, Zhejiang
Wenzhou, Zhejiang
África
África
África
África
África
África
África
África
Haplotipo
I
I
I
I
I
I
I
I
I
III
III
III
III
I
I
I
II
III
III
IV
I
I
III
I
I
I
I
I
I
III
III
III
III
III
III
I
I
I
I
I
III
III
III
IV
I
I
I
I
I
I
I
I
Los detalles de ocho accesiones africanas se informaron en Bredeson et al. [27].
Los plastomas de las 52 muestras de D. alata codificaron 113 genes únicos idénticos, incluidos 79
genes codificadores de proteínas (PCG), 30 genes de ARN de transferencia (ARNt) y 4 genes de ARN ribosómico.
(ARNr), 19 de los cuales (7 PCG, 8 genes de ARNt y los 4 ARNr) se duplicaron en
los IR, dando un total de 132 genes (Figura 1, Tabla S1). Entre los genes únicos, ocho de
los PCG (es decir, atpF, petB, petD, ndhA, ndhB, rpoC1, rpl2 y rpl16) y seis de los tRNA
(trnK­UUU, trnG­UCC, trnL­UAA, trnV­UAC, trnI­GAU y trnA­UGC) contenían un único
intrón, mientras que tres PCG (ycf3, rps12 y clpP) poseían dos intrones (Figura 1, Tabla S1).
El gen rps12 consta de tres exones que están empalmados entre sí: los exones 2 y 3 son
proximal y ubicado en los IR, mientras que el exón 1 está a ~ 29,0 kb de la copia más cercana de
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,
ADa001
ADa002
ADa003
ADa004
ADa005
ADa006
ADa007
Un gen
intacto que codifica
ADa008
Tda00/00005
África
Tda01/00039
África
Tda02/00012
África
África
Tda05/00015
Tda95­310 África Tda95/00328 África
Tda99/00048 África exones 2 y 3 y ~70,5
kb de distancia de su copia repetida distal.
Tda99/00240 El factor de iniciación africano IF1
(infA)
estaba
mientras
queseelinformaron
gen rps16
se perdió
de[27].
forma independiente en el
Los detalles
de presente,
ocho accesiones
africanas
en Bredeson
et al.
I
I
I
Yo 4 de 16
I
I
I
I
Plastomas de D. alata (Figura 1, Tabla S1).
Figura 1. El mapa panplastoma de Dioscorea alata. Los genes que se muestran en el exterior del círculo son
se transcriben en el sentido de las agujas del reloj, mientras que los genes internos se transcriben en el sentido contrario a las agujas del reloj. Los genes que pertenecen
Figura 1. El mapa panplastoma de Dioscorea alata. Los genes que se muestran en el exterior del círculo pertenecen a diferentes grupos
funcionales y están codificados con diferentes colores. El contenido de GC/AT se muestra mediante
se transcriben en el sentido de las agujas del reloj, mientras que los genes internos se transcriben en el sentido contrario a las agujas del
reloj. Los genes pertenecen a barras grises más oscuras/claras dentro de las tétradas (LSC, IRA, SSC, IRB). Las duraciones de LSC, IRA, SSC y
Los que pertenecen a diferentes grupos funcionales están codificados con diferentes colores. El contenido de GC/AT se muestra en las
regiones IRB (pb) de los cuatro haplotipos de plastoma completo (Haps I­IV) identificados en D. alata.
en el círculo interior.
2.2. Polimorfismos del plastoma en D. alata
La alineación de los plastomas de las 52 accesiones de D. alata dio como resultado una matriz de datos de
153.206 caracteres, de los cuales 69 eran variables. En total, cuatro haplotipos de plastoma completo.
fueron identificados (ver detalles en la Tabla S2), con los valores generales para el haplotipo (Hd)
y las diversidades de nucleótidos (π) fueron 0,51 y 0,05 × 10−3 , respectivamente. entre los cuatro
haplotipos (Haps), (i) Hap I fue el haplotipo más prevalente (encontrado en el 63,5% de todos
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las adhesiones), y presente en todas las adhesiones africanas; (ii) Hap II sólo se encontró en
una adhesión de la provincia de Hainan y solo tenía un polimorfismo de un solo nucleótido
diferencia (SNP) del Hap I; (iii) El Hap III ocurrió en seis de las ocho provincias
de China continental, incluidos Fujian (cuatro adhesiones), Hainan (dos adhesiones), Jiangsu
(una adhesión), Jiangxi (cinco incorporaciones), Shandong (una adhesión) y Zhejiang (tres
adhesiones) Provincias; y (iv) Hap IV fue compartido por dos accesiones, es decir, CDa020 de
Provincia de Hunan y CDa044 de la provincia de Zhejiang (Tabla 1). Prueba D de Tajima en el
El nivel de plastoma completo de D. alata mostró un valor negativo (–1,80), lo que puede indicar una
expansión poblacional reciente o alguna selección purificadora en esta especie.
2.3. Comparación de plastoma completo a niveles intra e interespecíficos
Las comparaciones exhaustivas de los nueve plastomas de Enantiophyllum (es decir, cuatro
haplotipos de plastoma de D. alata y un plastoma representativo de cada uno de D. brevipetiolata,
D. cirrhosa, D. glabra, D. japonica y D. polystachya, respectivamente) revelaron que la
La similitud de secuencia fue superior al 99,9% entre todos los haplotipos de D. alata, mientras que
algunos espaciadores intergénicos mostraron un alto grado de divergencia (<70% de similitud) entre
D. alata y otras cinco especies de Enantiophyllum (Figura 2). Además, tanto a nivel intra como
En niveles interespecíficos, las regiones codificantes estaban más conservadas que las regiones no codificantes,
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incluidos espaciadores e intrones intergénicos, y los IR mostraron menos divergencia que el LSC
y regiones CSS (Figura 2).
Figura2.2.Gráfico
Gráficode
deidentidad
identidadbasado
basadoen
enmVISTA
mVISTAque
quemuestra
muestralalaidentidad
identidadde
dela
lasecuencia
secuencia del
del plastoma
plastoma dentro
dentro de
de Dioscorea
Dioscorea alata
alata y
Figura
y entre los miembros de la sección Enantiophyllum, con Hap I de D. alata como referencia. La vertical entre los miembros de la
sección Enantiophyllum, con el Hap I de D. alata como referencia. la escala vertical
La escala representa el porcentaje de identidad entre 50% y 100%. Los genes anotados se muestran y representan el porcentaje
de identidad entre el 50% y el 100%. Los genes anotados se muestran a lo largo de la
la parte superior, con flechas grises que indican sus posiciones y direcciones transcripcionales. Exones, intrones, arriba, con
flechas grises que indican sus posiciones y direcciones transcripcionales. Exones, intrones y
y las secuencias no codificantes (CNS) conservadas están resaltadas en azul, cian y rojo, respectivamente. Las secuencias no
codificantes (CNS) conservadas están resaltadas en azul, cian y rojo, respectivamente.
Las uniones IR/SC eran idénticas o casi idénticas, no sólo entre los haplotipos. Las
uniones IR/SC eran idénticas o casi idénticas, no sólo entre los haplotipos.
de D. alata, pero también incluso entre D. alata y sus parientes cercanos (Figura 3). En general, las
diferencias de D. alata, pero también incluso entre D. alata y sus parientes cercanos (Figura 3). En general, el
El gen rps19 se extendió entre 62 y 63 pb en la región IRA en la unión de LSC/IRA (JLA), el gen rps19
se extendió entre 62 y 63 pb en la región IRA en la unión de LSC/IRA (JLA),
creando un pseudogén duplicado en la región IRB (pseudogén no mostrado). el ycf1
creando un pseudogén duplicado en la región IRB (pseudogén no mostrado). El gen ycf1
El gen cruzó la unión SSC/IRA (JSA), con la misma longitud (324 pb) en la región IRA, cruzó la unión
SSC/IRA (JSA), con la misma longitud (324 pb) en la región IRA, y un
y una longitud de 5241 pb a 5271 pb en la región SSC. De manera similar, el gen ndhF se ubicó con
una longitud de 5241 pb a 5271 pb en la región SSC. De manera similar, el gen ndhF se localizó en el
en las uniones SSC/IRB (JSB), con 2231 pb en la región SSC y 7 pb en la región IRB en todos los
plastomas (Figura 3). Además, todos los genes trnH­GUG estaban ubicados en las regiones IR, a una
distancia de 191 pb de sus uniones IR/SC adyacentes (Figura 3).
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Uniones SSC/IRB (JSB), con 2231 pb en la región SSC y 7 pb en la región IRB a lo7 de
largo
17
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todos los plastomas (Figura 3). Además, todos los genes trnH­GUG estaban ubicados en el IR.
regiones, a una distancia de 191 pb de sus uniones IR/SC adyacentes (Figura 3).
JLA
JSA
217 pb 62 pb
rpl22
D. alata
(los cuatro haplotipos)
rps19
324 pb
trnH
217 pb 62 pb
rpl22
D. brevipetiolata
rps19
trnH
IRA
D. cirrosa
rps19
trnH
217 pb 62 pb
rpl22
D. glabra
rps19
trnH
217 pb 62 pb
rpl22
D. japonica
rps19
trnH
216 pb 63 pb
rpl22
D. polistaquia
LSC
rps19
trnH
LSC
191 pb 81 pb
trnH
trnN
psba
IRB
ndhF
CSS
LSC
192 pb 81 pb
2231 pb 7 pb
ycf1
psba
IRB
ndhF
5244 pb
IRA
trnH
trnN
CSS
324 pb
LSC
191 pb 81 pb
2231 pb 7 pb
ycf1
psba
IRB
ndhF
5241 pb
IRA
LSC
trnH
trnN
CSS
324 pb
LSC
191 pb 81 pb
2231 pb 7 pb
ycf1
psba
IRB
ndhF
5265 pb
IRA
LSC
trnH
trnN
CSS
324 pb
LSC
191 pb 81 pb
2231 pb 7 pb
ycf1
IRA
LSC
ndhF
5271 pb
psba
IRB
CSS
324 pb
trnH
trnN
2231 pb 7 pb
5244 pb
ycf1
217 pb 62 pb
rpl22
ndhF
CSS
324 pb
LSC
191 pb 81 pb
2231 pb 7 pb
5244 pb
ycf1
IRA
LSC
JLB
JSB
trnH
trnN
IRB
psba
LSC
Figura 3. Comparación de las uniones IR/SC entre los nueve plastomas de Enantiophyllum ( es decir ,
cuatro haplotipos completos de Dioscorea alata y un plastoma de cada uno para D .brevipetiolata, D.
cirrhosa, D. plastoma haplotipos de Dioscorea alata, y un plastoma de cada uno para D. brevipetiolata, D.
cirrhosa, D. glabra,
glabra, D. japonica y D. polystachya, respectivamente). JLA, JSA, JSB y JLB se refieren a uniones de LSC/
IRA, D. japonica y D. polystachya, respectivamente). JLA, JSA, JSB y JLB se refieren a uniones de LSC/IRA,
SSC/IRA, SSC/IRB y LSC/IRB, respectivamente.
SSC/IRA, SSC/IRB y LSC/IRB, respectivamente.
2.4. Repeticiones dispersas y SSR
2.4. Repeticiones dispersas y SSR
Se identificaron un total de 292 repeticiones dispersas en los nueve plastomas de Enantiophyllum . Se
identificaron un total de 292 repeticiones dispersas en los nueve plastomas de Enantiophyllum.
tomos, incluidos cuatro haplotipos de plastoma completo de D. alata, y un plastoma cada uno para incluir cuatro
haplotipos de plastoma completo de D. alata, y un plastoma de cada uno para D. brevipetio D. brevipetiolata, D.
cirrhosa, D. glabra, D .japonica y D.polystachya, respectivamente. Entre lata, D. cirrhosa, D. glabra, D. japonica y
D. polystachya, respectivamente. Entre todos los identificados
En todas las repeticiones identificadas, las repeticiones directas y palindrómicas fueron repeticiones
considerablemente más altas, las repeticiones directas y palindrómicas fueron considerablemente mayores en número que las
en número que las repeticiones inversas y complementarias (Figura 4A), y las longitudes de repetición
inversas y complementarias (Figura 4A), y las longitudes de repetición de 30 a 39 pb fueron las más
de 30 a 39 pb fueron los más comunes (Figura 4B). Dentro de D. alata, Haps I, II y III tenían algo en común (Figura
4B). Dentro de D. alata, Haps I, II y III compartieron las mismas 13 repeticiones directas.
las mismas 13 repeticiones directas y 14 repeticiones palindrómicas, mientras que Hap IV albergaba 10 for y 14
repeticiones palindrómicas, mientras que Hap IV albergaba 10 repeticiones directas y 13 repeticiones palindrómicas.
repeticiones
de (Figura
sala y 13
repeticiones
palindrómicasD.(Figura
4A).
A nivel
interespecífico,
D. el
japon se repite
4A).
A nivel interespecífico,
japonica
y D.
polystachya
contenían
ica
y D. polystachya
contenían
mayor cantidad
de repeticiones
(16 directas,
14 inversas,en21complemento),
palindrómicas,seguidas
la
mayoría
de las repeticiones
(16ladirectas,
14 inversas,
21 palindrómicas
y 10 repeticiones
ybrevipetiolata
10 repeticiones
complementarias),
seguidas
de
D.
alata,
D.
brevipetiolata
(11
directas
y
14
pal
por
D.
alata,
D.
(11 directas y 14 repeticiones palindrómicas) y D. glabra (10 directas,
repeticiones
D. glabra (10 directas,
inversa
y 11 repeticiones
mientras
que 1
inversa y 11 indrómicas),
repeticiones ypalindrómicas),
mientras1que
D. cirrhosa
(7 directas palindrómicas),
y 12 repeticiones
palindrómicas)
D.
cirrhosa
repeticiones
12 palindrómicas) contenía la menor cantidad (Figura 4A).
contenía
la (7
menor
cantidaddirectas
(Figura y4A).
Machine Translated by Google
7 de
16 8 de 17
En t. J. Mol. Ciencia. 2023, 24,
3341 Int. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341
Figura
4. Análisis
repeticiones
en losde
nueve
Enantiophyllum
cuatro
tomo completo
dede
Dioscorea
alatadispersas
y un plastoma
cadaplastomas
uno de D. de
brevipetiolata
(Db),[es
D. decir,
cirrhosa
(Dc),haplotipos
haplotiposde
de
plastoma de Dioscorea alata y un plastoma de cada uno de D. brevipetiolata (Db), D. cirrhosa
D. glabra (Dg), D. japonica (Dj) y D. polystachya (Dp), respectivamente]. (A) Números de cuatro diferentes (Dc), D. glabra
(Dg), D. japonica (Dj) y D. polystachya (Dp), respectivamente]. (A) Números de cuatro
tipos repetidos; (B) frecuencia de repeticiones dispersas por longitud.
diferentes tipos de repetición; (B) frecuencia de repeticiones dispersas por longitud.
El
total
de SSR
en losen
plastomas
de Enantiophyllum
osciló entre 62
(D. glabra)
Elnúmero
número
total
de SSR
los plastomas
de Enantiophyllum
osciló
entre
62 (D. glabra) y
ay 69
japonica),
y los
tipos de también
motivos variaron
repetidosentre
también
variaron
entre
estos 5,
plastomas (Fig. 69 (D. japonica),
los(D.
tipos
de motivos
repetidos
estos
plastomas
(Figura
figura
5,
Tabla
S3).
De
todos
los
SSR,
el
tipo
de
SSR
más
abundante
fueron
los
mononucleótidos
(todos en la
Tabla S3). De todos los SSR, el tipo de SSR más abundante fueron los mononucleótidos
(todos A/T
repeticiones
A/T),
variando
(53,97%)
D. cirrhosa
40 (58,82%)
en alata,
Haps I y II de D. repeticiones),
variando de 34
(53,97%)
ende
D.34
cirrhosa
a 40en(58,82%
) enaHaps
I y II de D.
alata,
seguido (11
de dinucleótidos
a 13y en
D. japonica)
trinucleótidos (7 en seguido de
dinucleótidos
en D. glabra a(11
13 en
en D.
D. glabra
japonica)
trinucleótidos
(7yen
D.
D. glabra
glabra aa 10
10 en
en D.
D. japonica
japonica yy D.
D. polystachya),
polystachya), mientras
mientras que
que los
los tetranucleótidos
tetranucleótidos (5
(5 en
en D.
D. brevipetiolata
brevipeti y 4 en los
otros
ocho
plastomas
de
Enantiophyllum
),
pentanucleótidos
(3
en
D.
alata
y
D.
olata
y
4
en
los otros ocho
Plastomas de Enantiophyllum), pentanucleótidos (3 en D. alata
cirrhosa
a 4 en D. D.
brevipetiolata,
D. glabra,
japonica y D.y polystachya),
y hexanucleótidos
D. cirrhosa
a 4 en
D. brevipetiolata,
glabra, D. japonica
y D.D.polystachya),
rara vez se observaron
hex (1 eny cada
plastoma)
en
los plastomas
Enantiophyllum
(Figura 5, Tabla Los anucleótidos (1 en cada plastoma) rara vez se
observaron
en losde
plastomas
de Enantiophyllum
S3).
Los5,
tipos
de repeticiones
dede
dinucleótidos
dominantes
fueron AT/TA,
que representan
el 12,90%
glabra).
(Figura
Tabla
S3). Los tipos
repeticiones
de dinucleótidos
dominantes
fueron AT/TA,
lo que (D.
representa
15,87%
de todos(D.
loscirrhosa)
SSR en de
cada
plastoma,
mientras
el GA (uno
en cada
y el
12,90% (D. cirrhosa)
glabra) –15,87%
todos
los SSR
en cadaque
plastoma,
mientras
queplastoma)
el GA ( uno
Los
motivos TC
(dos en
cada plastoma)
fueron
los plastoma)
menos abundantes
Tabla S3). (Figura
Los motivos
abundantes
en cada
plastoma)
y TC (dos
en cada
fueron los(Figura
menos5,abundantes
5,
Las
repeticiones
A/T y AT/TArepeticiones
probablemente
a la riquezacontribuyeron
general de ATaldel
Enantiophyllum
Tabla
S3). Las abundantes
A/Tcontribuyeron
y AT/TA probablemente
aumento
general de AT.
plastomas.
riqueza de los plastomas de Enantiophyllum.
Machine Translated by Google
En t. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341
9 de 17
8 de 16
100
suerte yo
90
Db
feliz II
Corriente continua
feliz IV
feliz III
dg
DJ
dp
80
70
10 11 12 13 14 15 16 17 10 11 12 13 14 15 10 10 10 12 14 18 10 12 12 15 18 15 18 12 12 12 12 12 12 12 12 12 15 15 15 15 1 5 20 15 15
A
tata
TATT
TCTTA
TCTTG
HACER
ENCAJE
taa
0
ATA
EN
10
ejército
de
reserva
20
TC
AGÁ
30
TCT
ATT
TTC
AAAG
40
AATG
AGAT
TATT
TTTA
AAATA
50
ATAAA
ATAGA
ATATA
60
Georgia
3341
t
5. Los tipos
de motivos
y las longitudes
losplastoma
SSR en cuatro
haplotipos
de I­IV)
plastoma
completo (Haps I­IV) de
Figura 5. Tipos de motivos Figura
y longitudes
de SSR
en cuatro
haplotiposdede
completo
(Haps
de Dioscorea
alata
y
otros
cinco
plastomas
de
Enantiophyllum.
Abreviaturas:
Db,
D.
brevipetiolata;
Corriente
continua,
Dioscorea alata y otros cinco plastomas de Enantiophyllum . Abreviaturas: Db, D. brevipetiolata; Dc, D. cirrosa; Dg,
D.
glabra; Dj, D. japonica; Dp, D. polistachya.
D. cirrosa; Dg, D. glabra; Dj, D. japonica; Dp, D. polistachya.
2.5. Puntos críticos de plastoma divergente en el Enantiophyllum
2.5. Puntos críticos de plastoma divergente en el Enantiophyllum Basado
en la alineación del plastoma completo de nueve plastomas de Enantiophyllum (es decir, cuatro
Basado en la alineación
de plastoma
del plastoma
completo
completo
de D.
dealata
nueve
y un
plastomas
plastomade
deEnantiophyllum
cada uno para (es
D. brevipetiolata,
decir, cuatro haplotipos
D. cirrhosa,
D.
glabra,
D.
japonica
y
D.
polystachya,
respectivamente),
un
total
de
120
regiones
(6011
CDS, 45 IGS,
Se sometieron haplotipos de plastoma completo de D. alata y un plastoma de cada uno para D. brevipetiolata, D. cir
intrones y cuatro ARNt) a análisis de diversidad de nucleótidos (π). El
rhosa, D. glabra, D. japonica y D. polystachya, respectivamente), un total de 120 regiones (60 CDS, los valores de π para
estas regiones oscilaron entre 2,44 × 10−4 (IGS rps12–trnV) y 1,90 × 10− 2 (IGS
45 IGS, 11 intrones y cuatro
sepromedio
sometieron
análisis
de (Figura
diversidad
de nucleótidos
trnC–
petN),tRNA)
con un
de a2,90
× 10−3
6). Las
regiones no(π).
codificantes
(incluidas
Los valores de π para estasmostraron
regiones variaron
un valordesde
de π promedio
2,44 × 10−4
más(IGS
alto rps12–trnV)
(3,83 × 10−3hasta
) que1,90
el ARNt
× 10−2
(promedio
(IGS IGS e intrones)
πde
= 3,42
10−3(Figura
) y CDS
(promedio
2,00 × 10−3
), haciéndose
eco no
delcodificantes)
hallazgo de que
trnC–petN), con un promedio
2,90 ××10−3
6). Las
regionesπno= codificantes
(incluidas
las regiones
fueron más variables que las regiones codificantes (Figura 2). Cuatro π
IGS e intrones) mostraron un valor π promedio más alto (3,83 × 10−3) que el ARNt ( π promedio = picos de valor (π > 8,50
× 10−3 ), es decir, trnC–petN, trnL–rpl32, ndhD–ccsA y exón 3 de clpP,
3,42 × 10−3) y CDS (promedio
π = críticos
2,00 × 10−3)
, haciéndose
ecousarse
del hallazgo
de que los
fueron
como
puntos
divergentes
y podrían
como códigos
de no
barras
de reconocidos
ADN en diferentes
las regiones codificantes fueron
más variables
que dentro
las regiones
codificantes (Figura 2). Cuatro valores de π alcanzan niveles
máximos
taxonómicos
de Enantiophyllum.
(π > 8,50 × 10−3), es decir, trnC–petN, trnL–rpl32, ndhD–ccsA y el exón 3 de clpP, fueron reconocidos como puntos
críticos divergentes y podrían usarse como códigos de barras de ADN en diferentes niveles taxonómicos dentro de
Enantiophyllum . .
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10 de 17 9
de 16
En t. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341
Int. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341
Figura
6. Valores
de diversidad
de nucleótidos
(π) en
(60 regiones
codificadoras
de proteínas,
45 intergénicas
Figura
6. Valores
de diversidad
de nucleótidos
(π)120
en regiones
120 regiones
(60 regiones
codificantes
de proteínas,
45 intergénicas
espaciadores,
11
intrones
y
cuatro
ARNt)
extraídos
de
los
plastomas
alineados
de
cuatro
plastomas
completos
espaciadores,
11
intrones y cuatro ARNt) extraídos de los plastomas alineados de cuatro plastomas completos
haplotipos
(Haps I­IV)
dey Dioscorea
y otrosde
cinco
plastomas de Enantiophyllum . haplotipos (Haps I­IV)
de Dioscorea
alata
otros cincoalata
plastomas
Enantiophyllum.
Relaciones
filogenéticas
dentro
alata
y entremiembros
miembrosde
deEnantiophyllum
Enantiophyllum
2.6. 2.6.
Relaciones
filogenéticas
dentro
dede
D. D.
alata
y entre
topologías
deárboles
los árboles
de máxima
verosimilitud
y de bayesiana
inferencia (BI)
bayesiana
LasLas
topologías
de los
de máxima
verosimilitud
(ML) e (ML)
inferencia
basados(BI)
en
secuencias
de
plastoma
completo
y
79
regiones
codificadoras
de
proteínas
compartidas
fueron
totalmente
basado en secuencias de plastoma completo y 79 regiones codificadoras de proteínas compartidas eran totalmente
idénticas, con valores de arranque (BS) del 100% y probabilidades posteriores bayesianas (PP) de 1,0 en
idéntico, con valores de arranque (BS) del 100% y probabilidades posteriores bayesianas (PP) de 1,0 en
los siete nodos principales (Figura 7). Todas las topologías filogenéticas apoyaron idénticamente la
los siete nodos principales (Figura 7). Todas las topologías filogenéticas apoyaban de manera idéntica la
monofilia de D. alata, que era hermana de D. brevipetiolata – D. grupo glabra. Estas tres
monofilia
de un
D. alata,
quecomún
era hermana
D. brevipetiolata
– D. grupoD.glabra
. Estas tres especies compartían
además
ancestro
con D. de
cirrhosa
y su grupo hermano
japonica.
Además,
la especie Las
compartió
un ancestro
con
D. cirrhosa
y su en
grupo
hermano
D. japonica.
D. polistaquia.
52 accesiones
de común
D. alata
podrían
dividirse
cuatro
clados
D. polistaquia.
52 accesiones
D.accesiones
alata podrían
dividirse
en cuatro clados (clados I­V), correspondientes
a los cuatroLas
haplotipos.
Clado de
I (25
chinas
y todas
8 accesiones
africanas) y Clade
II (CDa017
de la Clado
provincia
Hainan)
eran,y juntos,
(clados
I – V), correspondientes
a los cuatro
haplotipos.
I (25de
accesos
chinos
todos alhermanos
clado III (16
accesos chinos),
mientras
que IIel(CDa017
clado IV (CDa020
de la provincia
deeran,
Hunan
y
8 accesiones
africanas)
y el Clado
de la provincia
de Hainan)
juntos,
CDa044 hermano de la
provincia
de
Zhejiang)
ocuparon
una
posición
temprana
divergente
('basal')
dentro
del y D. alata (Figura 7).
al clado III (16 accesiones chinas), mientras que al clado IV (CDa020 de la provincia de Hunan
CDa044 de la provincia de Zhejiang) ocupó una posición temprana divergente ('basal') dentro de D. alata
(Figura 7).
Machine Translated by Google
En t.J.J.Mol.
Mol.Ciencia.
Ciencia., 24,
20232023
3341 Int.
3341 , 24,
11 de 17 10 de 16
Figura
7. Relaciones
filogenéticas
dentro
de Dioscorea
y entre
miembros
de Enantiophyllum inferidas a partir de
Figura
7. Relaciones
filogenéticas
dentro
de Dioscorea
alataalata
y entre
miembros
de Enantiophyllum
análisis
de máxima
verosimilitud
(ML) een
inferencia
bayesiana
(BI)­plastoma
basados en análisis de máxima verosimilitud (ML) e
inferencia
bayesiana
(BI) basados
imágenes
completas.
secuencias
de tomos.
de probabilidades
posteriores
de BI.Los
Losnúmeros
númerosen
enlos
losnodos
nodosrepresentan
representanvalores
valoresde
dearranque
arranquede
deML
ML(BS)
(BS)yysecuencias
probabilidades
posteriores de BI (PP).
lazoscompartidas
(PP). Las topologías filogenéticas resultantes de dos conjuntos de datos (secuencias de plastoma completo y 79
79 regiones codificadoras de proteínas compartidas) son idénticas. Todas las muestras de D. alata podrían dividirse en
cuatro regiones codificantes de proteínas) son idénticas. Todas las accesiones de D. alata podrían dividirse en cuatro clados
clados (clados I – V), correspondientes a los cuatro haplotipos (Haps I – IV). (clados I
– V), correspondientes a los cuatro haplotipos (Haps I – IV).
3. Discusión
3.
Discusión
3.1. Evolución
del plastoma
en D.en
alata
y susyespecies
estrechamente
relacionadas
3.1. Evolución
del plastoma
D. alata
sus especies
estrechamente
relacionadas
Estudios
anteriores
han informado
que los
dentro
de una
estánestán
altamente
conservados
Estudios
anteriores
han informado
queplastomas
los plastomas
dentro
de especie
una especie
altamente
conservados en
en términos de estructura genómica, contenido de GC , contenido de genes y sintenia del orden de los genes [26,28],
[26,28],
y D. alata
no es
una excepción
a este respecto.
El panplastoma
excepción
a este
respecto.
El panplastoma
de D. alata
construido de D. alata con D. alata no es una
estructurado
aquí
indicó que
las 52 muestraspb)
(153,114–153,161
pb) geográficas
de diferentes áreas geográficas aquí indicó
que las 52
muestras
(153,114–153,161
de diferentes áreas
Las estructura
áreas gráficas
cuatripartita
poseían típica
la estructura
de los plastomas
cuatripartita
detípica
plantas
de terrestres,
los plastomas
con de
un plantas
par de IR.
terrestres, con poseían la
regiones
(25.464
pb) que
la LSC
(83.351–83.415
pb)yyellaSSC
SSC
(18.815–18.836 pb)
un par
de regiones
IR (25.464
pb) separan
que separan
el LSC
(83.351–83.415 pb)
(18.815–
18,836
mismos
pb) regiones,
113 genes
y codificaron
únicos, incluidos
los mismos
79 PCG,
11330
genes
tRNA
únicos,
y
incluidos 79 PCG, 30 tRNA, y codificaron los
4 ARNr
(Figura
1, Tabla
S1).
Todos
estos
plastomas
secuenciados
también
compartían
mismo
aspecto de
general.
y 4 ARNr
(Figura
1, Tabla
S1).
Todos
estos
plastomas
secuenciados
también
compartieron
el el
mismo
contenido
GC (37,0%),
el de las
regiones
(34,8%)
y SSC
(31,0%),
contenido
generalmayor
de GCque
(37,0%),
mayor
que elLSC
de las
regiones
LSC
(34,8%)pero
y SSC (31,0%), menor que el de las
IR en
(43,0%),
probablemente
debido
al alto contenido
de de GC (55,3%) de los cuatro
peroregiones
menor que
las regiones
IR (43,0%),
probablemente
debidodealGC
alto(55,3%)
contenido
ARNr.ARNr.
Además,
tampoco
se detectaron
detectaron disposiciones
disposiciones genéticas
genéticas ni
dentro
dede
D.D.
alata.
los cuatro
Además,
no se
dentro
alata ni en comparación con
sus especiescon
estrechamente
(esrelacionadas
decir, D. brevipetiolata,
D.brevipetiolata,
cirrhosa, D. glabra,
en comparación
sus especiesrelacionadas
estrechamente
(es decir, D.
D. cirrhosa, D. glabra, D.
D. japonica
y D. polystachya)
2). Estostambién
hallazgos
también
enconsistentes
gran medida
con
japonica
y D. polystachya)
(Figura 2).(Figura
Estos hallazgos
fueron
en granfueron
medida
conconsistentes
las
características
de
los
plastomas
de
Dioscorea
publicados
previamente,
que
mostraron
que
el
las características de los plastomas de Dioscorea publicados anteriormente, que mostraron que los plastomas de
este génerodeestaban
bien conservados
Los plastomas
este género
estaban bien[29­31].
conservados [29­31].
Expansiones
y contracciones
específicas
delos
linaje
deIR/SC,
los límites
que
Las expansiones
y contracciones
específicas
del linaje de
límites
que sonIR/SC,
comunes
en son
las comunes
angiospermas,
a
menudo
provocan
la
ganancia
o
pérdida
de
un
pequeño
número
de
genes
y
longitud.
comunes en las angiospermas, a menudo provocan la ganancia o pérdida de un pequeño número
de genes
y variaciones
de los plastomas
En este
estudio, las
de los límites IR/SC
variaciones
de longitud
de los plastomas
[32­34]. En[32­34].
este estudio,
las ubicaciones
deubicaciones
los IR/SC
Machine Translated by Google
11 de 16
En t. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341
eran totalmente idénticos, no sólo en los cuatro haplotipos de plastoma completo de D. alata, sino
también entre D. alata y sus cuatro especies estrechamente relacionadas, es decir, D. brevipetiolata, D.
cirrhosa, D. glabra y D. japonica ( Figura 3). Dado que la diferencia en el límite IRA/SSC entre D.
polystachya y los otros plastomas es muy trivial (Figura 3), estos resultados proporcionaron una prueba
más de la naturaleza conservada de los plastomas de Enantiophyllum. Además, a diferencia de la
mayoría de las monocotiledóneas, con sus IR expandiéndose y abarcando el grupo de genes rps19­
trnH (p. ej., Arecales, Dasypogonaceae, Poales, Zingiberales, Asparagales y Commelinales) [28,32],
todos los límites LSC/IRA de Los plastomas de Enantiophyllum se ubicaron dentro del gen rps19 (Figura
3).
3.2. Marcadores derivados de plastomas para la delimitación de especies/cultivares en Enantiophyllum
Aunque los códigos de barras de ADN se han introducido en la taxonomía de Dioscorea y han
acelerado la identificación de especies y las relaciones en las diferentes secciones y/o clados principales
de este género, los loci comúnmente utilizados, es decir, genes de plastidios (p. ej., atpB, matK, rbcL),
suplementado con regiones IGS intermediamente variables (p. ej., trnL­trnF y psbA­trnH) y/o
espaciadores transcritos internos (ITS) de genes de ADN ribosomal nuclear, siempre mostraron un bajo
poder discriminatorio en niveles taxonómicos bajos, incluso dentro del Enantiophyllum [35­39 ]. En
consecuencia, se deben desarrollar regiones hipervariables adicionales para el análisis taxonómico y
filogenético de una sección específica/clado principal de Dioscorea. En este estudio, el análisis de
diversidad de nucleótidos de 120 regiones (60 CDS, 45 IGS, 11 intrones y cuatro regiones de ARNt)
extraídas de los nueve plastomas de Enantiophyllum (es decir, cuatro haplotipos de plastoma completo
de D. alata y un plastoma de cada uno para D. brevipetiolata, D. cirrhosa, D. glabra, D. japonica y D.
polystachya, respectivamente), revelaron que las regiones IGS trnC–petN, trnL–rpl32, ndhD–ccsA y el
exón 3 de clpP, con alto contenido de nucleótidos Los valores de diversidad (π > 8,50 × 10−3 ) (Figura
6) podrían servir como códigos de barras de ADN candidatos para la identificación de especies/
cultivares en Enantiophyllum. La disponibilidad de estos puntos críticos altamente divergentes también
proporciona información genética valiosa para futuros estudios filogenéticos, poblacionales, genéticos y filogeográ
3.3. Relaciones filogenéticas dentro de D. alata y entre especies de la sección Enantiophyllum China
es un centro de domesticación importante y posiblemente aislado de D. alata [12]. En este estudio,
se detectaron un total de cuatro haplotipos de plastoma completo en las 44 muestras de ocho provincias
de China continental y la isla de Taiwán (Tabla 1). La distribución de estos cuatro haplotipos fue
aleatoria, lo que respalda el hallazgo anterior de que no hubo una diferenciación geográfica significativa
dentro de D. alata en China [12]. Tales variaciones genéticas entre estos cultivares serían útiles para
guiar la elección de padres adecuados para el mejoramiento por hibridación y la posterior utilización de
esta especie económicamente importante [6]. Entre los cuatro haplotipos, Hap I predominó en la
mayoría de las regiones de China y representa el 56,8% de las muestras chinas. Las accesiones de
Hap I pueden haberse establecido a partir de aquellas que tienen Hap II (por ejemplo, CDa017 de la
provincia de Hainan) mediante una sustitución de una sola base en la región codificante de ndhD, que
discriminó Hap I de Hap II (Tabla 1, Figura 7 ) . El análisis filogenético sugirió que dos accesiones que
portaban Hap IV (CDa020 de la provincia de Hunan y CDa044 de la provincia de Zhejiang) formaron un
clado basal con respecto al clado completo de las accesiones restantes (Figura 7). Esto puede reflejar
que Hap IV tuvo un origen relativamente antiguo y una historia evolutiva a largo plazo, lo que permitió
su adaptación a diferentes condiciones climáticas y, por lo tanto, jugó un papel importante en los
programas de reproducción de D. alata. Sin embargo, dado que un árbol basado en plastoma representa
efectivamente la historia de un solo locus [40,41], se necesita un examen más riguroso con múltiples
genes nucleares de copia única o secuencias del genoma completo.
Además, también cabe destacar que, aunque nuestro análisis filogenético basado en secuencias
completas de plastomas proporcionó una resolución filogenética mucho mayor que aquellos con
marcadores moleculares tradicionales, como los polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados
(AFLP), y varios plastidios (p. ej., atpB, matK, rbcL , y trnL – trnF) y loci nucleares (Xdh) [1,37–39,42],
este estudio se realizó basándose en un muestreo insuficiente de taxones de la sección Enantiophyllum.
Por lo tanto, se necesitan más estudios filogenómicos con muestreo exhaustivo de taxones para
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establezca una imagen completa de las relaciones filogenéticas dentro de esta sección e identifique a los
parientes más cercanos de D. alata.
4. Materiales y Métodos 4.1.
Muestras de plantas, extracción de ADN y adquisición de datos genómicos
Según nuestra observación de campo y estudios previos basados en fenotipos y SSR [12,16], se
obtuvieron un total de 44 muestras (Tabla 1) que representan los principales cultivares de D. alata en
China. seleccionados para la secuenciación del genoma completo. Estas accesiones, con alta diversidad
fenotípica, cubrieron la principal área de distribución de esta especie en China, desde el oeste (Lijiang,
provincia de Yunnan, coordenadas geográficas (gc): 26◦43 N, 100◦15 E) hasta el este (Taizhou, provincia
de Zhejiang). , gc: 28◦38 N, 121◦27 E), y desde el sur (Sanya, provincia de Hainan, gc: 18◦24 N, 109◦45
E) hacia el norte (Xuzhou, provincia de Jiangsu, gc: 34◦39 N, 116◦35 E). Además, también seleccionamos
específicamente muestras que han contribuido en gran medida al mejoramiento y la investigación de esta
especie y muestras altamente resistentes al estrés abiótico y biótico. El ADN genómico de cada accesión
se extrajo de hojas frescas o secas con gel de sílice utilizando un kit de plantas DNAsecure (Tiangen
Biotech, Beijing, China), de acuerdo con el protocolo del fabricante. La concentración y la integridad del
ADN se midieron en un BioAnalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE. UU.), junto
con electroforesis en gel de agarosa. Se construyeron bibliotecas de extremos emparejados con un
tamaño de inserción de 350 pb y luego se secuenciaron en la plataforma BGISEQ­500 para generar
secuencias sin procesar con una longitud de lectura de 150 pb. La construcción y secuenciación de la
biblioteca se llevaron a cabo en Wuhan Benagen Tech Solutions Company Limited, Wuhan, China.
Además, se descargaron conjuntos de datos de secuenciación del genoma completo que abarcan
ocho accesiones africanas de D. alata (Tabla 1) de la base de datos del Archivo de lectura de secuencias
(SRA) del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y se convirtieron al formato FASTQ
utilizando el método fastq­ utilidad de volcado del SRA Toolkit v.2.9.6 [43].
4.2. Montaje y anotación de Plastoma
Las lecturas sin procesar en formato FASTQ se recortaron para eliminar los adaptadores y las
secuencias de baja calidad utilizando Trimmomatic v.0.36 [44], con los parámetros predeterminados. Las
lecturas limpias restantes se utilizaron para el ensamblaje de novo de secuencias completas de plastoma
utilizando GetOrganelle v.1.7.6 [45], con los siguientes parámetros: ­R 15­k 21,45,65,85,105­F
embplant_pt. Posteriormente, la conexión y circularidad de los gráficos de ensamblaje de GetOrganelle
se verificaron visualmente en Bandage v.0.9.0 [46]. Las anotaciones de plastoma se realizaron utilizando
Geneious Prime 2022.0.1 (https://www.geneious.com, consultado el 16 de noviembre de 2021) alineando
cada plastoma recién ensamblado con plastomas publicados previamente de D. alata (MG267382) y D.
japonica (MT920319), como referencias, y transfiriendo las anotaciones de referencia a estos nuevos
plastomas. Las anotaciones resultantes se verificaron y ajustaron manualmente para determinar la
precisión de los codones de inicio y parada y los límites exón/intrón.
4.3. Análisis del polimorfismo del plastoma
Las 52 secuencias del plastoma se alinearon utilizando el complemento MAFFT v.7 [47] tal como se
implementó en Geneious Prime 2022.0.1. Luego, la alineación de la secuencia del plastoma completo en el formato
NEXUS se importó a DnaSP v.6.12.03 [48] para calcular el número de sitios polimórficos (E), el número de haplotipos
(H), la diversidad de haplotipos (Hd), la diversidad de nucleótidos. (π) y D de Tajima. Se identificaron un total de
cuatro haplotipos de plastoma completo (ver Resultados) y se depositaron en GenBank (números de acceso:
OP787123 – OP787126). Los mapas de plasmo circulares de D. alata se dibujaron con el software basado en web
OrganellarGenomeDRAW (OGDRAW) v.1.3.1 [49].
4.4. Genómica comparativa de plastomas dentro de D. alata y entre especies estrechamente relacionadas
Para evaluar la similitud genómica de los plastomas completos dentro de D. alata y entre los
miembros de la sección Enantiophyllum, se identificaron los cuatro haplotipos de plastoma completo
(Haps I­IV) de las 52 accesiones de D. alata, junto con otros cinco publicados previamente.
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Plastomas de Enantiophyllum [es decir, D. brevipetiolata (OL638495), D. cirrhosa (ON584759), D.
glabra (OL638497), D. japonica (MT920319) y D. polystachya (KY996494): un individuo por especie],
descargados del Se compararon la base de datos NCBI. Estas nueve secuencias completas de
plastomas se alinearon utilizando el programa de alineación global Shuffle­LAGAN [50] y se
visualizaron utilizando el navegador mVISTA [51], con el Hap I de D. alata como referencia. Las
cuatro uniones entre las dos regiones de repetición invertida (IR) y de copia única grande/pequeña
(LSC/SSC), denominadas JLA, JSA , JSB y JLB, se inspeccionaron más a fondo y se compararon
con el complemento Buscador de repeticiones en Geneious Prime 2022.0.1. (https://
www.geneious.com/plugins/repeat finder/, consultado el 4 de agosto de 2019).
4.5. Caracterización de repeticiones dispersas y SSR El
programa en línea REPuter [52] se utilizó para determinar el número y el tamaño de las repeticiones dispersas
en D. alata y sus especies estrechamente relacionadas, incluidas las repeticiones directas (directas), inversas,
complementarias y palindrómicas. Las restricciones para todas las secuencias repetidas se establecieron de la
siguiente manera: (i) una distancia de Hamming de 3 y (ii) un tamaño de repetición mínimo de 30 pb (es decir, 90%
o más de identidad de secuencia). Además, se utilizó la aplicación web MISA [53] para detectar los SSR en D. alata
y otras cinco especies de Enantiophyllum, con umbrales (números mínimos) de 10, 5, 4, 3, 3 y 3 unidades de
repetición, respectivamente. , para los SSR de mono, di, tri, tetra, penta y hexanucleótidos.
4.6. Identificación de puntos críticos divergentes
Para explorar las regiones altamente divergentes para los códigos de barras de ADN y los estudios basados
en poblaciones de D. alata, así como de otras especies de Enantiophyllum, se utilizaron cuatro secuencias de
haplotipos de plastoma completo (Haps I­IV) de D. alata y una secuencia de plastoma de cada una de otras cinco
Las especies de Enantio phyllum (es decir, D. brevipetiolata, D. cirrhosa, D. glabra, D. japonica y D. polystachya) se
alinearon con el complemento MAFFT v.7 [47] en Geneious Prime 2022.0.1 con la configuración predeterminada.
Las secuencias codificantes de proteínas (CDS), las regiones espaciadoras intergénicas (IGS) y los intrones y ARNt
con una longitud alineada de más de 200 pb y al menos una mutación se sometieron a un análisis de diversidad de
nucleótidos (π) utilizando DnaSP v.6.12.03 [48 ].
4.7. Análisis filogenéticos Las
relaciones filogenéticas dentro y entre D. alata y sus especies estrechamente relacionadas se llevaron a cabo
utilizando dos conjuntos de datos: secuencias de plastoma completo y 79 regiones codificadoras de proteínas
compartidas de las 52 muestras de D. alata (Tabla 1), y una muestra de cada una. para otras cinco especies de
Enan tiophyllum (es decir, D. brevipetiolata, D. cirrhosa, D. glabra, D. japonica y D. polystachya), con D. schimperiana
(MG805614) y D. sansibarensis (MG805614) como grupos externos [39, 54]. Tanto las secuencias del plastoma
completo como las secuencias codificantes de proteínas se alinearon utilizando el complemento MAFFT v.7 [47] en
Geneious Prime 2022.0.1. El mejor modelo de sustitución, GTR + I + G, para cada conjunto de datos, determinado
por el Criterio de información de Akaike (AIC) en jModelTest v.2.1.4 [55], se utilizó tanto para la máxima verosimilitud
(ML) como para la inferencia bayesiana (BI). análisis. Los análisis de ML se realizaron utilizando RAxML v.8.2.12,
[56] disponible en CIPRES Science Gateway v.3.3 (http://www.phylo.org/portal2/, consultado el 14 de noviembre de
2010), con 1000 replicaciones de arranque. Los análisis de BI se realizaron utilizando el programa MrBayes v.3.2.7
[57], que consta de dos ejecuciones independientes de 1 × 106 generaciones, con cuatro cadenas independientes
de Markov Monte Carlo (MCMC) cada una (es decir, una fría y tres calentadas). ) y una frecuencia de muestreo de
1000 árboles. Los primeros 1000 árboles se descartaron como "quemados" y los árboles restantes se utilizaron para
construir un árbol de consenso de regla mayoritaria y estimar las probabilidades posteriores (PP).
Materiales complementarios: la siguiente información de respaldo se puede descargar en: https: //www.mdpi.com/article/10.3390/ijms24043341/
s1.
Contribuciones de los autores: Conceptualización, Y.­MZ; metodología, R.­SL; software, R.­SL, KH y F.­
JZ; validación, X.­QS y MC; curación de datos, R.­SL; redacción: preparación del borrador original, R.­
SL; redacción: revisión y edición, Y.­MZ; adquisición de financiación, R.­SL e Y.­MZ Todos los autores
han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.
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Financiamiento: Esta investigación fue financiada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32172089, 32200192), el Programa
de Talento Empresarial e Innovador de Jiangsu (JSSCBS20211311), el Laboratorio Clave de Jiangsu para la Investigación y Utilización de
Recursos Vegetales (JSPKLB202206, JSPKLB202207), el Proyecto de investigación independiente del Instituto de Investigación de Bienestar
Público Provincial de Jiangsu (BM2018021­2) y el Fondo de Talento del Instituto de Botánica de Jiangsu (JIBTF202102).
Declaración de la Junta de Revisión Institucional: No aplicable.
Declaración de Consentimiento Informado: No aplicable.
Declaración de disponibilidad de datos: Los datos del plastoma presentados en este estudio se pueden encontrar en
GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/, consultado el 16 de noviembre de 2021) con el número de acceso
OP787123–OP787126.
Agradecimientos: Los autores agradecen a Yao Xiao de la Universidad Agrícola de Jiangxi, Zhi­Ying Huang del Instituto de Investigación Agrícola
de Quanzhou, Shipeng Chen de la Academia de Ciencias Agrícolas de Sanming y Jie Tang del Instituto de Investigación de Cultivos de la
Academia de Ciencias Agrícolas de Jiangxi por su gran ayuda en la recolección. los materiales vegetales.
Conflictos de intereses: Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
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