Facultad de Ingeniería – Programa de Bioingeniería. Guía Práctica de laboratorio de Biología General: Biomoléculas I Elaborado por: Profesor Biól. Esp. MSc. Liliana Figueroa Del Castillo. lfigueroac@unbosque.edu.co Preparación antes de ir a las prácticas. El lugar de las prácticas de laboratorio será en el laboratorio de la sede Chía los días martes en el horario de 8:00am-10:00am, la práctica dará inicio a las 8:15am, momento en que la puerta será cerrada y ya no se podrá ingresar debido a motivos de bioseguridad. Favor revisar las recomendaciones y solicitud del material que deben llevar, se reitera el uso obligatorio de bata y tapabocas, tanto al ingreso y durante toda la práctica, y en algunos casos se tendrán en cuenta guantes. Continuando con la sesión de prácticas de laboratorio correspondientes al curso de Biología General, el día de hoy ustedes realizarán la primera de 2 prácticas de reconocimiento de biomoléculas con el fin de encontrar puntos en común y diferencias entre carbohidratos, lípidos y proteínas de consumo diario. Al final de la práctica se debe entregar el informe (uno por grupo de trabajo) que encontrarán al finalizar la presente guía, totalmente diligenciado e impreso por ambas caras. ¡Éxitos!!! Introducción. Los seres vivos están formados por materia altamente organizada y hasta las formas de vida más simples, como las bacterias, exhiben una diversidad de moléculas difícil de concebir por la mente humana. Se sabe que una bacteria puede tener más de 5000 moléculas diferentes que en conjunto constituyen a la bacteria y le permiten funcionar. Una célula vegetal, o animal, puede tener el doble. Estas moléculas son en su mayoría biomoléculas, literalmente las moléculas de los seres vivos. Ellas forman las estructuras y organelos celulares y desempeñan todas las funciones que permiten a una célula u organismo, nacer, crecer y finalmente reproducirse si fuera el caso. ¿Qué tienen en común todas ellas? Están constituidas principalmente por carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, fósforo y azufre (C, H, O, N, P y S). Otros elementos están presentes en la composición de las biomoléculas, pero en menor proporción como el zinc, el hierro, el manganeso. Presentan esqueletos carbonados. Los enlaces formados entre los átomos que conforman las biomoléculas son en su mayoría covalentes. Presentan grupos funcionales. ¿Cómo se clasifican las biomoléculas? Existen varios criterios para clasificar las biomoléculas, según los siguientes criterios de clasificación: Criterio No. 1. Según la naturaleza química de las biomoléculas se clasifican en: Biomoléculas inorgánicas: Son aquellas que están presentes en los seres vivos y desempeñan funciones importantes, pero no son producidas sólo por los seres vivos, sino que pueden formarse o existir por procesos ajenos a los seres vivos (inorgánicos). Estas sustancias deben su clasificación de biomoléculas a la importancia que tienen en los seres vivos, pero no a su origen y para ellas no se aplican las características anteriormente mencionadas. Ejemplo de éstas son: H 2O, CO2, O2, y las sales inorgánicas que proveen los aniones (HPO4-2, HCO3-1, Cl-1) y cationes (Na+1, K+1 y NH4+1) imprescindibles para la vida. Biomoléculas orgánicas: Estas son moléculas sintetizadas o producidas exclusivamente por los seres vivos y cumplen con todas las características mencionadas anteriormente. Se cuentan entre ellas a los carbohidratos, a los lípidos, a las proteínas, a los ácidos nucleicos y a los metabolitos. Criterio No. 2 Según el grado de complejidad estructural las biomoléculas se clasifican en: Precursoras: Son moléculas pequeñas, de bajo peso molecular, que son utilizadas como punto de partida para fabricar moléculas intermediarias del metabolismo. Ejemplo: Amoníaco (NH 3), dióxido de carbono (CO2) y agua (H2O). Intermediarios metabólicos: Son moléculas que posteriormente se transforman en otras. Ejemplo: oxalacetato, piruvato, citrato. En general estas moléculas se transforman para dar lugar a las unidades estructurales. Facultad de Ingeniería – Programa de Bioingeniería. Guía Práctica de laboratorio de Biología General: Biomoléculas I Elaborado por: Profesor Biól. Esp. MSc. Liliana Figueroa Del Castillo. lfigueroac@unbosque.edu.co Unidades estructurales: Estas moléculas son directamente los bloques de construcción de las macromoléculas. Ejemplo: los aminoácidos son las unidades estructurales de las proteínas, los monosacáridos son las unidades estructurales de los disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos; los nucleótidos son las unidades estructurales de los ácidos nucleicos (ADN y ARN) y finalmente el glicerol y los ácidos grasos son las unidades estructurales de la mayoría de los lípidos. Macromoléculas: Son las más típicas de las biomoléculas. Incluyen a carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Los carbohidratos y lípidos son macromoléculas con roles estructurales y energéticos; las proteínas y los ácidos nucleicos son moléculas informativas. Los ácidos nucleicos son depositarios de la información genética y las proteínas desempeñan una multitud de funciones que serán especificadas más adelante. A continuación, encontraran las características de los principales grupos de biomoléculas. I. Carbohidratos (glúcidos). Los carbohidratos son los compuestos orgánicos más comunes en la biósfera, conocidos también como hidratos de carbono dado que los primeros carbohidratos descubiertos respondían a la fórmula general Cn(H2O)n, como se puede apreciar es como si tuvieran una molécula de agua (hidrato) por cada carbono (carbo). ¿Qué tienen en común todos los carbohidratos? Desde el punto de vista químico son polihidroxialdehídos o polihidroxicetonas o son moléculas formadas por la unión de moléculas de polihidroxialdehído y/o moléculas de polihidroxicetona. Se le llama polihidroxialdehído a aquella molécula que tiene varios grupos hidroxilo (OH) y un grupo aldehído o carbonilo terminal ( ). Se le llama polihidroxicetona a las moléculas que tienen varios grupos hidroxilo (polihidroxi) pero el carbonilo lo tienen cetónico, es decir no terminal ( ). En la figura se pueden apreciar algunas diferencias estructurales: Figura 1 Estructura de Carbohidratos. a) Glucosa estructura abierta b) Glucosa estructura cerrada c) Fructosa abierta. d) Fructosa cerrada La glucosa es un polihidroxialdehído, obsérvense los grupos hidroxilo (OH) y el grupo carbonilo en el extremo (terminal). La fructosa es una polihidroxicetona, obsérvese el grupo carbonilo en el segundo carbono (no terminal). Fuente: Curtis, 2000 ¿Cómo se clasifican los carbohidratos? De acuerdo a la complejidad estructural se clasifican en: Monosacárido (figura 2): Es una unidad o una molécula de polihidroxialdehído (aldosa) o de polihidroxicetona (cetosa). Estas moléculas tienen entre 3 y 6 carbonos y son solubles en agua. Todos los de 6 carbonos son dulces y por eso se conocen como azúcares. Figura 2 Estructura de un Monosacáridos Figura 3 Estructura de un Disacárido – Oligosacárido Fuente: Curtis, 2020 Oligosacáridos: Tienen entre 2 y 10 unidades de monosacáridos unidas por enlace covalente (figura 3). Cuando el oligosacárido consta de dos monosacáridos unidos se les llama disacáridos y también se clasifican como azúcares. Estos merecen especial mención por ser de gran importancia en la dieta animal. Facultad de Ingeniería – Programa de Bioingeniería. Guía Práctica de laboratorio de Biología General: Biomoléculas I Elaborado por: Profesor Biól. Esp. MSc. Liliana Figueroa Del Castillo. lfigueroac@unbosque.edu.co Polisacáridos: Son polímeros que constan de muchas unidades o monómeros (figura 4). Pueden tener cientos de unidades. Figura 4 Estructura de un Polisacárido Fuente: Curtis, 2020 ¿Cuáles funciones desempeñan los carbohidratos? Los carbohidratos desempeñan tres clases de funciones: una de ellas como fuente energética, algunos conforman estructuras importantes y unos pocos intervienen en el reconocimiento y comunicación celular. a. Carbohidratos como fuente energética: La principal fuente energética de los seres vivos es la glucosa, pero hay otros monosacáridos importantes que se pueden convertir en glucosa como son la fructosa (azúcar predominante en las frutas) y la galactosa. Entre los disacáridos energéticos está en primer lugar la sacarosa (azúcar de mesa) que está formada por una unidad de glucosa unida a una de fructosa y la lactosa que es el azúcar de la leche (figura 5). Figura 5. Estructura de los polisacáridos Fuente: Curtis, 2000 Figura 6 Estructura del Glucógeno Fuente: Curtis, 2000 De los polisacáridos son reserva energética, el glucógeno en animales, que está formado por decenas de moléculas de glucosa correspondiente a cada punto como se observa en la figura 6, y se almacena en el hígado y el almidón, en las plantas, que al igual que el glucógeno, está formado por muchas moléculas de glucosa y tiene una estructura ramificada. El almidón es el carbohidrato que ingerimos cuando comemos tubérculos como la papa, la yuca, o harinas como la de maíz, trigo o arroz. Este polisacárido representa entre el 70 y 80 0% de las calorías en la dieta humana. b. Carbohidratos estructurales: Decíamos que los carbohidratos también pueden tener función estructural. Los carbohidratos estructurales son todos polisacáridos. Así, por ejemplo, la celulosa, es el polisacárido que forma las paredes celulares de las plantas, aportándoles rigidez y sostén. La quitina es un polisacárido estructural que hace lo mismo que la celulosa, pero en las paredes celulares de hongos. En bacterias la pared celular está formada por peptidoglicano, otro polisacárido. c. Carbohidratos con función de reconocimiento y comunicación celular: El reconocimiento celular es el proceso por el que las moléculas de carbohidrato ubicadas en la membrana citoplasmática constituyen la base química para el reconocimiento mutuo entre las células. De esos azúcares se valen lo mismo las bacterias para identificar su célula hospedadora, que las células del sistema inmunitario para distinguir el tejido enfermo. Los carbohidratos también dirigen la organización del embrión. Ejemplo de estas moléculas son las glucoproteínas de membrana. II. Lípidos: Son una clase de biomoléculas, específicamente macromoléculas, compuestas fundamentalmente por carbono, hidrógeno y oxígeno, pero éste último en menor proporción que en los carbohidratos. También pueden contener fósforo, azufre y nitrógeno. Facultad de Ingeniería – Programa de Bioingeniería. Guía Práctica de laboratorio de Biología General: Biomoléculas I Elaborado por: Profesor Biól. Esp. MSc. Liliana Figueroa Del Castillo. lfigueroac@unbosque.edu.co Dentro de los lípidos se encuentran todas aquellas sustancias que comúnmente conocemos como aceites (lípidos líquidos) y grasas (lípidos sólidos). La característica común a todos los lípidos es su carácter hidrofóbico, o sea, su no solubilidad en agua o a polaridad. ¿Cómo se clasifican los lípidos de acuerdo a su función? Los lípidos se clasifican de acuerdo a que presenten, o no, ácidos grasos en su estructura. Los lípidos que presentan ácidos grasos en su estructura, y que son los más abundantes en los seres vivos, se conocen como lípidos saponificables y los que no están formados por ácidos grasos se conocen como lípidos no saponificables. Lípidos Saponificables: Acilglicéridos (grasas y aceites): Son moléculas formadas por la unión de 1, 2 o 3 ácidos grasos a una molécula de glicerina y de acuerdo a esto se clasifican en mono, di y triglicéridos respectivamente (figura 7). Estos lípidos son los que se almacenan en el tejido adiposo y son utilizados como reserva energética por los seres vivos. Cuando se oxidan producen mucho más ATP que los carbohidratos y las proteínas. Un gramo de lípido produce 9,4 kilocalorías al oxidarse contra las 4.1 kilocalorías que produce 1 g de proteína o de carbohidrato. Figura 7. Estructura de un Triglicérido. Fuente: www.boche.arrakis.es Céridos (ceras): Son sólidas a temperatura ambiente y altamente insolubles en agua. Ejemplos de estas son las ceras de abejas, las ceras que recubren hojas y tallos en plantas y la cera que recubre la piel en humanos. Las ceras impiden la deshidratación y protegen de los elementos ambientales. Fosfolípidos: Estos son los lípidos más abundantes en las membranas por tanto tienen función estructural. Tienen una cabeza polar, por tanto, soluble en agua, y dos colas apolares como indica la figura (8). Figura 8. Estructura de un fosfolípido. Fuente: www.boche.arrakis.es Glucolípidos: Están en las membranas celulares y de los organelos y su principal función es el reconocimiento celular Lípidos No Saponificables: o Terpenos: Son las conocidas resinas producidas principalmente por las plantas coníferas. o Esteroides: Entre este tipo de lípidos se encuentran hormonas como las sexuales que regulan el desarrollo y funcionamiento sexual y lípidos estructurales como el colesterol. o Prostaglandinas: Son lípidos que actúan como hormonas e intervienen en la vasodilatación, en la regulación de la temperatura y en la contracción del músculo liso. ¿Cómo se identifican los carbohidratos y los lípidos? Químicamente un carbohidrato es diferente de un lípido y de una proteína. Cada una de estas biomoléculas tiene sus propiedades distintivas que permiten diferenciar a una de otra. Por ejemplo, los carbohidratos tienen muchos grupos hidroxilo y carbonilo, los lípidos son altamente hidrofóbicos y las proteínas tienen en su constitución enlaces peptídicos que están ausentes en las otras clases de biomoléculas. Facultad de Ingeniería – Programa de Bioingeniería. Guía Práctica de laboratorio de Biología General: Biomoléculas I Elaborado por: Profesor Biól. Esp. MSc. Liliana Figueroa Del Castillo. lfigueroac@unbosque.edu.co En esta práctica se aplicarán los métodos específicos que permiten reconocer biomoléculas. A continuación, se expone el fundamento de los métodos que se aplicarán. 1.Método de Benedict para identificar Azúcares Reductores: Entre todos los carbohidratos, los azúcares reductores son los monosacáridos polihidroxialdehídos y aquellos disacáridos que tengan un carbonilo terminal, que pueda oxidarse, y reducir así al catión cobre (Cu+2). De color azul celeste presente en el reactivo de Benedict. Este catión se reduce (gana 1 e-) y pasa a Cu+1 que es de color rojo ladrillo. De modo que si una sustancia cambia el color azul del reactivo de Benedict a rojo ladrillo se considera que es positiva y por tanto se trata de azúcar reductor, es decir un carbohidrato que presenta un carbonilo terminal libre. Cuando la concentración del azúcar reductor es alta se obtiene el rojo ladrillo mencionado, pero si es baja se obtienen diferentes tonos de verde. La reacción que tiene lugar es la siguiente: R-CHO + Cu+2 RCOOH + Cu+1 Azúcar catión azul Azúcar oxidado rojo ladrillo 2.Prueba de Lugol. El lugol es una solución que contiene yoduro de potasio (KI) y yodo (I 2). Esta mezcla es un líquido amarillo que al reaccionar con polisacáridos adopta coloración azul negruzca o café. Esta coloración se debe a que los iones yoduro (I1) se insertan en los puntos de ramificación de los polisacáridos (Figura 6). 3.Método de Molisch: Esta es una prueba cualitativa para detectar la presencia de carbohidratos. Se basa en la capacidad que tiene el ácido sulfúrico (H2SO4) para romper los enlaces entre las unidades que forman los oligo y polisacáridos y posteriormente deshidratar a los monosacáridos resultantes. Al deshidratarse, los monosacáridos dan compuestos sulfúricos que reaccionan con el reactivo de Molisch produciendo una sustancia púrpura violeta. 4.Identificación de lípidos por medio del método de Sudán III, una de las características más notorias de los lípidos es su hidrofobicidad. Dado que lo semejante disuelve a lo semejante, los lípidos tenderán a interactuar con sustancias que sean hidrofóbicas también. El Sudán III es un colorante de naturaleza hidrofóbica de modo que, si lo ponemos en contacto con los lípidos, el colorante se asociará a los lípidos y los teñirá de un rojo-Anaranjado brillante característico. Objetivos de la práctica de laboratorio. Reconocer mediante pruebas cualitativas la presencia de carbohidratos y lípidos en diferentes tipos de muestras. Verificar la solubilidad de los lípidos en solventes orgánicos. Metodología a utilizar Antes de la práctica: Por grupos de trabajo Tubo 1: 1ml de miel con 2 ml de agua y mezcle deben llevar los siguientes materiales: hasta disolver Marcador para vidrio y colores (anaranjado, Tubo 2: 2ml de leche azul, morado, rojo, negro, blanco), 20 ml de Tubo 3: Trozos pequeños de papa con 2 ml de Aceite de cocina, Cinta de enmascarar, agua. Guantes (1 par por estudiante), Bisturí por 2. Después de tener listas las muestras en grupo, 3 dulces halls, 1 Paquete de sparkys, Un cada tubo añada 3 gotas del reactivo de paquete pequeño de miel de abejas, 20 ml de Molisch y agite completamente. pony malta, 20 ml de leche, 15 g de Harina, 15 3. Posteriormente agregue a cada tubo 0.5 ml g de Arroz, 1 papa pequeña, Papel absorbente de ácido sulfúrico concentrado (2 toallitas). Por último, cada grupo debe llevar asegurándose que el ácido caiga por las impreso el informe de laboratorio, por ambas paredes del tubo de ensayo, para ello caras, para trabajarlo y ser entregado al final incline el tubo. No agite. La aparición de un de la práctica. anillo púrpura en la interface se considera positiva. Determinación de Carbohidratos 4. Control negativo: Tome un tubo de ensayo 1. Coloque en cada tubo de ensayo las y adicione 2ml agua y realice el mismo siguientes muestras: procedimiento anterior. Facultad de Ingeniería – Programa de Bioingeniería. Guía Práctica de laboratorio de Biología General: Biomoléculas I Elaborado por: Profesor Biól. Esp. MSc. Liliana Figueroa Del Castillo. lfigueroac@unbosque.edu.co Determinación de Monosacáridos y disacáridos 1. Con un mortero macerar una porción de dulces de halls hasta observar una consistencia polvorosa. 2. Luego adicionar una cantidad del macerado en un tubo de ensayo y enseguida agregar aproximadamente de 2ml de agua. 3. Añadir 4 gotas del reactivo de Benedict y mezcle. 4. Conecte una plancha de calentamiento (+ o – 150 oC). Ponga a calentar un beaker con 200 ml de agua aproximadamente. 5. Colocar el tubo de ensayo en el beaker una vez el agua esté hirviendo. Observar el cambio de color. 6. Considerar positivas aquellas muestras donde se obtenga un color anaranjado ó color ladrillo. 7. Volver a realizar el mismo procedimiento, pero con los sparkys. Para ello lave el mortero de modo que no queden residuos de la muestra anterior y utilizar otro tubo. 8. En otro tubo de ensayo adicionar una pequeña cantidad de miel y disolverla con 2 ml de agua, adicionar de nuevo 4 gotas de reactivo de Benedict y posteriormente colocar el tubo en el beaker junto con los otros tubos. 9. En otro tubo de ensayo adicionar una pequeña cantidad de pony malta adicionar de nuevo 4 gotas de reactivo de Benedict y posteriormente colocar el tubo en el beaker junto con los otros tubos. 10. En otro tubo de ensayo adicionar una pequeña cantidad de leche adicionar de nuevo 4 gotas de reactivo de Benedict y posteriormente colocar el tubo en el beaker junto con los otros tubos. 11. Control negativo: Tomar un tubo de ensayo y adicionar 2ml agua. Luego agregar 4 gotas del reactivo de Benedict y colocarlo a calentar de igual forma que los anteriores tubos. Anotar sus resultados. 12. Considerar positivas aquellas muestras donde se obtenga un color anaranjado ó color ladrillo. Determinación de polisacáridos. 1. En un tubo de ensayo colocar una pequeña cantidad de harina de trigo y agua. 2. Mezclar hasta obtener una consistencia homogénea. Posteriormente adicionar 5 gotas de lugol y evidenciar el cambio de color. Anotar sus resultados. 3. En un mortero colocar una pequeña cantidad de arroz y tritúrelos hasta obtener residuos de polvo, luego adicionarlos a un tubo de ensayo y agregar 2ml de agua. Posteriormente adicionar 5 gotas de lugol. Anotar sus resultados 4. Cortar pequeños trozos de papa y adicionar una porción en un tubo de ensayo junto con 2 ml de agua. Adicionar 5 gotas de lugol. Anotar sus resultados. 5. En un tubo de ensayo colocar aproximadamente 2 ml de leche. Luego adicionar 5 gotas de lugol y anotar el cambio de color. 6. Control negativo: Tomar un tubo de ensayo, adicionar 1ml de agua y agregar 5 gotas de Lugol. Anotar sus resultados. 7. A tener en cuenta: Considere positivas aquellas muestras donde se obtenga un color azul negruzco o violeta o negruzco. Determinación de lípidos 1. En un tubo de ensayo colocar 2ml de aceite. 2. Agregar 4 gotas de solución alcohólica de Sudan III. Agitar y dejar reposar. 3. Observar el cambio de color generado a la luz y comparar el color obtenido con el control negativo. 4. Considerar positivas aquellas muestras donde se obtenga el color naranja brillante. 5. Control negativo: A un tubo de ensayo adicionar 2 ml de agua y enseguida 4 gotas de Sudan III Bibliografía Curtis, H. (2000). Biología. Editorial Médica infraestructura académica. Área laboratorios. Panamericana. Buenos Aires. Práctica Biomoléculas. Universidad Manuela Mader, S. (2008). Biología. McGraw-Hill Beltrán. Bogotá. Interamericana. México, D.F Ville, C.A. (1981). Biología. Edit. U.M.B (2009). Macroprocesos de recursos e Interamericana. México, D.F. Facultad de Ingeniería – Programa de Bioingeniería. Guía Práctica de laboratorio de Biología General: Biomoléculas I Elaborado por: Profesor Biól. Esp. MSc. Liliana Figueroa Del Castillo. lfigueroac@unbosque.edu.co Informe de laboratorio (Se entrega al final de la práctica impreso) Nombres de los integrantes (con apellidos) Resultados Determinación de Carbohidratos Coloree los siguientes tubos de acuerdo a los resultados observados luego de adicionar el reactivo de Benedict Miel + agua Leche Papa + agua Agua Nombre ¿cuál o cuáles de los alimentos empleados para esta prueba fueron positivos con Molisch?_______________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________ Molisch permite distinguir una proteína de un lípido? Explique su respuesta _______________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________ Si una glucoproteína es sometida a la prueba de Molisch, ¿el resultado será negativo o positivo? Explique respuesta _______________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________ ¿Según los resultados obtenidos; ¿el reactivo de Molisch junto con el ácido sulfúrico, permitirá distinguir un polisacárido de un monosacárido o de un disacárido? Explique su respuesta _______________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ __________ Resultados Determinación de monosacáridos y disacáridos Coloree los siguientes tubos de acuerdo a los resultados observados luego de adicionar el reactivo de Benedict Leche Halls Sparkys Miel Pony Malta Agua Facultad de Ingeniería – Programa de Bioingeniería. Guía Práctica de laboratorio de Biología General: Biomoléculas I Elaborado por: Profesor Biól. Esp. MSc. Liliana Figueroa Del Castillo. lfigueroac@unbosque.edu.co De acuerdo a la complejidad estructural ¿qué tipo de monosacárido y disacárido se pudo identificar con Benedict? Argumente su respuesta ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ Resultados Determinación de polisacáridos Coloree los siguientes tubos de acuerdo a los resultados observados luego de adicionar el Lugol AGUA ¿De acuerdo a la complejidad estructural que tipo de carbohidrato se pudo identificar con el lugol? Argumente su respuesta ________________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________________ ¿La prueba de lugol da positiva para todos los carbohidratos? ___________________________________ ________________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________________ Resultados Determinación de lípidos Coloree los siguientes tubos de luego de adicionar el reactivo de Sudan III Aceite Agua Explique ¿por qué razón se evidencia el color observado? ________________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________________ Realicen 3 conclusiones globales de la práctica realizada. ________________________________________________________________________________________________________
