COPEG PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE CÉLULAS DE RIÑÓN DE CORDEROTÉCNICA DE CULTIVO PRIMARIO 1.0 OBJETIVO: Describir los procedimientos necesarios para aplicar la Técnica de Cultivo Primario de Riñón de Cordero. 2.0 ALCANCE: El cultivo primario de células de riñón ovino ha sido tradicionalmente considerado el sistema de cultivo de células de elección para aislamiento del virus de la Fiebre Aftosa de las muestras de campo. 3.0 PROCEDIMIENTO: Paso Descripción 3.1 Encender el gabinete de bioseguridad por lo menos media hora antes de comenzar a trabajar en él. 3.2 Desinfectar el gabinete de bioseguridad y acomodar dentro, todo el material estéril que se va a utilizar. 3.3 Añadir 50 ml de PBS conteniendo solución alta de antibióticos (HAS) a cada uno de los cinco vasos de precipitado de 100ml (Esta serie de vasos serán usados para lavar el riñón) 3.4 Sumergir el órgano entero en un vaso de precipitado, luego transferir al 2do vaso usando pinzas estériles limpias y finalmente al 3er vaso. Personal de la Sección de Cultivo Celular 3.5 Abrir un paquete de gasa estéril y colocar el riñón en un plato Petri en forma aséptica. Usando un nuevo juego de instrumentos. Usando un nuevo juego de instrumentos, remueva todo tejido, conectivo y graso del riñón y deposítelos sobre una gasa estéril. Lavar los riñones hasta que estos estén libres de tejidos extraños primero en el 4to vaso y luego en el 5to vaso usando pinza estéril para hacer la transferencia. Personal de la Sección de Cultivo Celular Utilizando nuevos instrumentos y platos Petri estériles remover la corteza del riñón. Personal de la Sección de Cultivo Celular 3.6 3.7 Código: PO-LAD -04 Revisión: 01 Responsable Personal de la Sección de Cultivo Celular Personal de la Sección de Cultivo Celular Personal de la Sección de Cultivo Celular Personal de la Sección de Cultivo Celular Aprobado por: Directores de Operaciones de Campo Página 1 de 3 Documento vigente de INTERNET Propiedad de COPEG, cualquier versión impresa es una copia no controlada COPEG PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE CÉLULAS DE RIÑÓN DE CORDEROTÉCNICA DE CULTIVO PRIMARIO Paso Descripción Responsable 3.8 Transferir la corteza al vaso de 100 ml o plato Petri pequeño para fraccionarlos en forma de cubos de uno a dos milímetros, usando tijeras afiladas con dos puntas. Transferir la corteza fraccionada al frasco tripsinizador, añadiendo un poco de PBS para enjuagar. Personal de la Sección de Cultivo Celular 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 Código: Dos lavados son aceptables para remover cualquier grasa o glóbulos rojos de los tejidos. El fluido del lavado es descartado. Para el primer lavado, añadir 200 ml de PBS más 1 % de la solución alta de antibiótico al frasco tripsinizador. Para el segundo lavado usar 200 ml de tripsina 1X (0.25 %). Para cada tripsinización usar agitador magnético incubando a 37° C durante 5 minutos. Permitir asentarse el tejido y luego descartar el fluido sobrenadante. Si es necesario, fraccionar el tejido con tijeras entre lavados. Añadir 200 ml de tripsina 1X (0.25 %). Incubar a 37° C mientras está agitándose. Dejar asentarse el tejido y luego filtrar la suspensión celular en una coladera de metal especial y depositar en un tubo de centrífuga cónico de 125 ml, conteniendo 10 ml de suero fetal bovino. Refrigerar los tubos de centrífuga entre las tripsinizaciones. Fraccionar los tejidos con tijeras entre las tripsinizaciones. 3.14 Completar de 4 a 5 tripsinizaciones hasta que la masa de tejido esté escasa de células. 3.15 Centrifugar la suspensión celular cerca de 200 xg o una velocidad de 1.200 a 1.400 r.p.m, por 12 a 15 minutos. 3.16 Tomar el paquete de células producido, descartar el sobrenadante y sembrar en una relación de 1 ml del paquete celular en 200 a 400 ml de E-MEM conteniendo 10 % de suero fetal bovino. Resuspender las células en un volumen apropiado de medio. PO-LAD -04 Revisión: 01 Personal de la Sección de Cultivo Celular Personal de la Sección de Cultivo Celular Personal de la Sección de Cultivo Celular Personal de la Sección de Cultivo Celular Personal de la Sección de Cultivo Celular Personal de la Sección de Cultivo Celular Personal de la Sección de Cultivo Celular Personal de la Sección de Cultivo Celular Aprobado por: Directores de Operaciones de Campo Página 2 de 3 Documento vigente de INTERNET Propiedad de COPEG, cualquier versión impresa es una copia no controlada COPEG PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE CÉLULAS DE RIÑÓN DE CORDEROTÉCNICA DE CULTIVO PRIMARIO Paso Descripción Responsable 3.17 Sembrar la suspensión celular en botellas TC-175 cm2, depositando 50 ml por botella e incubando a 37° C. 3.18 En 2 a 4 días cambiar el medio de cultivo. 3.19 Congelar cuando la monocapa esté completa. Personal de la Sección de Cultivo Celular Personal de la Sección de Cultivo Celular Personal de la Sección de Cultivo Celular 4.0 DOCUMENTOS DE REFERENCIA 5.0 HISTORIAL DE MODIFICACIONES FECHA 11/06/07 Código: PO-LAD -04 MODIFICACIONES Se modificaron los siguientes pasos: 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.8, 3.9, 3.10, 3.11, 3.12, 3.15, 3.16, 3.17, 3.18. La abreviatura correcta de mililitro es ml sin punto. Se corrigió la redacción del procedimiento. Se reemplazó “gx” por “xg” en el 3.15.Se reemplazó TC-150 por TC-175.(Paso 3.17). Revisión: 01 Aprobado por: Directores de Operaciones de Campo Página 3 de 3 Documento vigente de INTERNET Propiedad de COPEG, cualquier versión impresa es una copia no controlada