COPEG PROCEDIMIENTO PARA LA EXTRACCIÓN DEL ANTIGENO PARA MUESTRAS VESICULARES 1.0 OBJETIVO: Describir los procedimientos necesarios para la Extracción del Antigeno para Muestras Vesiculares. 2.0 ALCANCE: El alcance de este procedimiento incluye la especificación de los materiales a utilizar, además de los procedimientos para el Medio Esencial Mínimo Tagle con Solución de Earle’s y la Solución Alta de Antibióticos (SAA). 3.0 PROCEDIMIENTO: Paso 3.1 Descripción Materiales y Equipo abcdef- 3.2 Responsable Mortero y pilón estéril Tijeras y pinzas estéril Platos Petri estéril Arena estéril Tubos de centrífuga estériles (15 ml) Bandeja con 1000 ml de ácido acético al 3% o solución yodada al 2%. g- Centrífuga refrigerada h- Cámara de bioseguridad i- Balanza j- pH metro k- Medio de extracción Preparación del Medio de Extracción ( Medio E-MEM Solución Alta de Antibiótico). Medio Esencial Mínimo Eagle con Solución de Earle’s: Personal de LADIVES a- Disolver el contenido de un paquete del medio liofilizado en la cantidad de agua destilada que se indica en el sobre. b- Disolver completamente y medir el pH~ 7.3 c- Filtrar tres veces a través de papel whatman.. d- Filtrar en millipore de 0.2 un dentro de la cámara de bioseguridad. e- Guardar en botellas estériles de 250 ml. Código: PO-LAD-17 Revisión: 00 Aprobado por: Directores de Operaciones de Campo Página 1 de 4 Documento vigente de INTERNET Propiedad de COPEG, cualquier versión impresa es una copia no controlada COPEG PROCEDIMIENTO PARA LA EXTRACCIÓN DEL ANTIGENO PARA MUESTRAS VESICULARES Paso 3.3 Descripción Responsable Solución Alta de Antibióticos (SAA). Antibiótico Cantidad Necesaria Concentr. Stock de Antibiótico Stock Necesario (ml) Concentr. Final por ml Penicilina 2 000 000 unit 500 000 unit/ml 4 20 000 unit Gentamicin 3 000 mcg 50 mg/ml 6 3 000 mcg Amfotericin B 25 000 mcg 2 500 mcg/ml 10 250 mcg Kanamicina 5 ml 100 mcg Personal de LADIVES a- Esterilice por filtración y congele a – 20° C en alícuotas. b- Mezcle los cuatro antibióticos (25 ml. en total) con 975 ml. del medio E-MEM. c- Mida el pH ~ 7.3 +/- 0.2. Ajuste con NaOH estéril. d- Refrigere a 4° C. 3.4 Procesamiento de las Muestras a- Se introduce la caja que se trae del campo al área de seguridad, la cual debe abrirse dentro de la cámara de bioseguridad. Dentro de la caja deben venir las muestras con sus respectivas hojas de campo, indicando: procedencia, número de muestras provenientes del brote, localización geográfica, etc. b- A cada muestra con su respectiva hoja se le asignará un número de entrada, precedido de la letra “L” que indica LADIVES, luego el número y posterior el año en que nos encontramos. Si de un mismo brote vienen varias muestras se les dará un sub-número. Ejemplo Si vienen 2 muestras del mismo brote, el número de entrada que se le dará será L-50-99 (1) y L-50-99 (2). c- Se identifican los tubos centrífuga y los platos Petri con el respectivo número de cada muestra. Código: PO-LAD-17 Revisión: 00 Aprobado por: Directores de Operaciones de Campo Página 2 de 4 Documento vigente de INTERNET Propiedad de COPEG, cualquier versión impresa es una copia no controlada COPEG PROCEDIMIENTO PARA LA EXTRACCIÓN DEL ANTIGENO PARA MUESTRAS VESICULARES Paso Descripción d- Se coloca en la balanza el plato de Petri estéril previamente identificado y se pesa 1 gramo del epitelio. ( Si sobra epitelio este debe guardarse en un vial con un poco de medio de extracción y congelarse a –70° C) e- Previamente pesado el epitelio se enjuaga con un poco de medio para eliminar detritos. Luego se coloca en un mortero estéril con ayuda de las pinzas y se pica con las tijeras lo más fino que se pueda, se le agrega un poco de arena estéril y se macera completamente con el pilón. f- Se mide 9 ml. del medio de extracción y se le adiciona a el macerado, se mezcla bien con ayuda del pilón y se deposita en el tubo de centrífuga de 15 ml, que se debe tapar completamente. g- Se centrifuga a 3.000 r.p.m por 10 minutos a 4° C. h- Luego de centrifugado se separa 1 ml. del sobrenadante para la inoculación en células VERO y Riñón de Cordero, el resto se utiliza en la prueba de ELISA ( 3.0 ml.) y/o Fijación del Complemento (2ml). Si sobra sobrenadante se guarda a –70° C. 3.5 Código: Responsable Personal de LADIVES NOTAS: a- Los fluidos vesiculares se utilizan directamente para las inoculaciones y pruebas de diagnóstico. b- Para los cultivo celulares, estos deben congelarse y descongelarse tres veces, luego se colocan en tubos cónicos debidamente rotulados, se centrifugan a 3.000 r.p.m por 10 minutos a 4° C y se utiliza el sobrenadante para las pruebas de diagnóstico. c- Si el epitelio pesa menos de un gramo, se debe hacer la dilución manteniendo la proporción 1:10. Ejemplo Si se pesa 0.5 g del epitelio se le debe adicionar 4.5 ml del medio de extracción. d- Si el epitelio pesa 0.4 gr. o menos se debe mantener la proporción 1:10 para la dilución y se procederá a inocularlo en células VERO y Riñón de Cordero inmediatamente y se reportará que la muestra se encuentra en estudio. PO-LAD-17 Revisión: 00 Aprobado por: Directores de Operaciones de Campo Página 3 de 4 Documento vigente de INTERNET Propiedad de COPEG, cualquier versión impresa es una copia no controlada COPEG PROCEDIMIENTO PARA LA EXTRACCIÓN DEL ANTIGENO PARA MUESTRAS VESICULARES 4.0 DOCUMENTOS DE REFERENCIA 5.0 HISTORIAL DE MODIFICACIONES FECHA Código: PO-LAD-17 MODIFICACIONES Revisión: 00 Aprobado por: Directores de Operaciones de Campo Página 4 de 4 Documento vigente de INTERNET Propiedad de COPEG, cualquier versión impresa es una copia no controlada