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Biorremediación 1 El problema de la contaminación Hay una presencia creciente de sustancias tóxicas, tales como como los compuestos alifáticos halogenados, hidrocarburos aromáticos, bifenilos policlorados y otros compuestos orgánicos e inorgánicos que contaminan agua, aire y suelo Algunas sustancias llegan al ambiente en bajas concentraciones, pero son sujetas a bioacumulación o biomagnificación durante su paso por la cadena alimentaria 2 Que hacer? • Identificar el problema • Establecer la naturaleza y el grado del riesgo • Decidir la mejor acción de remediación Ventajas de la biorremediación • Menor costo que otras alternativa Costo de incineración para todos los sitios en EEUU: $1.7.1012 • Se trata en general de una solución permanente Muchas veces se logra mineralización en lugar de transferencia entre fases 3 Procesos celulares sustrato transformación Compuesto químico (contaminante) CELULA aceptor de electrones • Oxígeno • Nitrato • Sulfato • otros Compuesto modificado pero no completamente eliminado Sistemas enzimáticos mineralización nutrientes • Nitrógeno • fósforo • metales (trazas) Contaminante destruído formación de CO2 + H2O 4 Reacciones catalizadas por microorganismos • Deshalogenación: un átomo de cloro es remplazado por un átomo de hidrógeno Cl2C = CHCl + H+ ClHC = CHCl + Cl• Hidrólisis: ruptura de una molécula orgánica con adición de agua RCOOR’ + H2O RCOOH + R’OH • Clivaje: División de una cadena orgánica en dos segmentos RCOOH RH + CO2 • Oxidación: Reacción con formas nucleofílicas de oxígeno (H2O, OH-) CH3CHCl2 + H2O CH3CCl2OH + 2H+ + 2e- • Reducción: Reacción con formas electrofílicas de hidrógeno (H+) CCl4 + H+ + 2e- • Deshidrohalogenación CCl3CH3 CHCl3 + ClCCl2CH2 + HCl 5 Vías catabólicas Diversidad en la biodegradación de tolueno 6 Vías catabólicas http://umbbd.msi.umn.edu/index.html Microbial biocatalytic reactions and biodegradation pathways • 188 pathways • 1293 reacciones • 1199 compuestos • 833 enzimas • 467 microorganismos • 50 grupos funcionales orgánicos 7 Análisis previos Un requisito previo en cualquier estrategia de remediación es la caracterización del sitio, respecto a los factores que puedan afectar el proceso La biorremediación es un procedimiento con rigor científico, que debe ser ajustado específicamente para cada condición particular, para minimizar las limitaciones cinéticas y ambientales. Por lo tanto, los costos iniciales para caracterización del sitio, evaluación de factibilidad pueden ser mayores a los costos dasociados con tecnologías más convencionales 8 Caracterización de aceptores de electrones En acuíferos, suelos y sedimentos predominan condiciones anóxicas 9 Caracterización de otros componentes abióticos 1. Disolución y precipitación de CaCO3, que cambia la alcalinidad y afecta la concentración de Ca2+ 2. Conversión de FeS en pirita (FeS2), que lleva a la pérdida de H2S 3. Disolución reductiva de Fe(III) por oxidación de S2-, que consume H2S produciendo Fe2+ soluble y SO42- o S0 10 Maurer and Rittmann, 2004 Biodegradation 15: 419–434 Caracterización de las comunidades microbianas autóctonas • Como parte de la caracterización del sitio para determinar la estrategia de remediación apropiada • Como parte del monitoreo del progreso y la efectividad del proceso de remediación 11 Ecología de la degradación 12 Diagrama de biorremediación Bioremediation in situ Engineered Biostimulation Adding Oxygen -Bioventing -Biosparging Adding Oxygen and Nutrients ex situ Intrinisic Landfarming Bioreactor Bioaugmentation Adding Oxygen, Nutrients and Bacteria 13 Biorremediación in situ: 1. Bioestimulación 14 Ranking de accidentes de barcos petroleros 35 Exxon Valdez 1989 Costa de Alaska 49 000 15 Jernelov, A. The Threats from Oil Spills: Now, Then, and in the Future, AMBIO (2010) 39:353–366 Cuál fue el mayor derrame de petróleo de la historia? 1.200.000 tn (Golfo Pérsico, 1991) 16 Derrame del Exxon Valdez (1989) Atlas & Hazen, Environ Sci Technol (2011) 45, 6709-6715 Bioremediación in situ Bioestimulación 18 Atlas & Bragg, Microbial Biotechnology (2009) 2, 213-221 Bioremediación in situ Exxon Valdez 19 Bioremediación in situ Exxon Valdez La bioremediación no aumenta la extensión de la degradación La bioremediación aumenta la cinética de degradación 20 Exxon Valdez 20 años después PAH no accesible La mayor parte de PAH fue eliminado No hay deficiencia de nutrientes No hay posibilidad de más bioremediacion 21 Atlas & Bragg, Microbial Biotechnology (2009) 2, 213–221 Procesos que afectan la disponibilidad de materia orgánica en suelos 22 Andreoni & Gianfreda, Appl Microbiol Biotechnol (2007) 76:287–30 Limitaciones de la bioremediación Prestige oil spill • recalcitrancia • viscosidad (difusión) • accesibilidad • co-metabolismo 23 Gallego et al, Org Geochem 37: 1869- 1884 Cometabolismo como estrategia de biorremediación degrada 300 compuestos 24 Biorremediación in situ: 2. Atenuación natural • Tecnología relativamente simple • Puede ser llevada a cabo con mínima disrupción del sitio • Suele requerir tiempos más prolongados que otros métodos • Requiere un programa de monitoreo de larga duración La duración afecta el costo • Si las velocidades de atenuación son muy lentas la pluma los contaminantes pueden migrar 25 Derrame de petróleo Golfo de México (2010) Actividad científica en las primeras etapas • Documentar las condiciones previas al impacto • Monitoreo del movimiento del petróleo • Monitoreo del daño en los recursos naturales • Decisiones técnicas para contener el derrame 26 Actividades de remediación en el golfo de México 27 Uso de dispersantes 636 millones litros de petróleo 5.000.000 litros dispersante! OD ? Corexit Solvente: 2-butoxiethanol (2-BE) o eter de petróleo Detergente: sulfonato orgánico Estabilizante: propylene glicol Otros componentes (anticongelantess, etc) Objetivo • Bajar la tensión superficial de la interfase agua-aceite • Formar microgotas que queden suspendidas para la biodegradación de las fracciones solubles liberadas 28 Compromiso en el uso de dispersantes OD ? Schmidt, CW 2010 Environmental Health Perspectives 118, A339-A344 Monitoreo de la densidad y actividad microbiana Aumento en densidad celular en la pluma Descenso en OD sugiere catabolización de HC 30 Hazen et al., 2010 Science 330. 204-208 Phylogenetic Oligonucleotide Arrays • PhyloChip > 106 sondas de ARNr 16S 16S rRNA gen como marcador Scaneado del PhyloChip. Se analiza la fluorescencia. Si da positivo para >90% de las sondas se considera presencia 16S rRNA gen es amplificado a partir del ADN metagenómico o las moléculas de 16S rRNA son usadas directamente PhyloChip teñido y lavado El pool de amlicones se fragmenta (200-500 bp) y se marca con biotina 16S hibrida con sus secuencias complementarias sobre la superficie del chip 31 Phylogenetic Oligonucleotide Arrays Concepto de sondas múltiples Lo microorganismos pueden ser detectados con múltiples sondas con niveles de especificidad idénticos y jerárquicos Se pueden hacer chips con distinto nivel de especificidad Ajustando la especificidad de las sondas (e.g. SRP-phylochip, RHCphylochip, Anaerochip, etc) 32 Cambios en la composición de las comunidades microbianas 16S rRNA phylochip Phospholipids fatty acids (PLFA) 33 Hazen et al., 2010 Science 330. 204-208 Composición de comunidades en la pluma de contaminación Bacterias psicrofílicas degradadoras de hidrocarburos y otros organismos no cultivados de ambientes fríos contaminados con hidrocarburos 34 Hazen et al., www.sciencexpress.org / 24 August 2010 / Page 1 / 10.1126/science.1195979 Functional Gene Arrays (FGA) 35 Functional Gene Arrays (Geochip) 24253 - 50mer > 57000 genes >150 grupos funcionales 36 Functional Gene Arrays (Geochip 3.0) 28000 - 50mer 57000 genes 292 grupos funcionales gyrB para análisis filogenético 37 Clasificación funcional de genes 4,000-5,000 genes funcionales detectados por muestra 1652 genes involucrados en la degradación de hidrocarburos 38 Hazen et al., www.sciencexpress.org / 24 August 2010 / Page 1 / 10.1126/science.1195979 Clasificación funcional de genes El petróleo es el factor dominante en la estructuración de la comunidad funcional microbiana 39 Lu et al., 2011 Microbial gene functions enriched in the Deepwater Horizon deep-sea oil plume The ISME Journal 5, 1 – 10 Genes para la degradación aeróbica de PAH nah: naftaleno 1,2 dioxigenasa Los genes que codifican para la degradación de PAH son más abundantes en la pluma, y algunos son únicos 40 Lu et al., 2011 Microbial gene functions enriched in the Deepwater Horizon deep-sea oil plume The ISME Journal 5, 1 – 10 Genes para la degradación anaeróbica de PAH Aunque hay oxígeno presente, también hay enriquecimiento en genes que codifican para la degradación anaeróbica gen bbs: β-oxidation de benzylsuccinato para la degradación anaeróbica de tolueno 41 Lu et al., 2011 Microbial gene functions enriched in the Deepwater Horizon deep-sea oil plume The ISME Journal 5, 1 – 10 Conclusiones de los análisis moleculares • Existe una gran diversidad de poblaciones que degradan HC en la pluma a altas profundidades del ambiente marino • Las comunidades microbianas están sujetas a una rápida adaptación en respuesta a la contaminación • Existe el potencial para la bioremediación intrínseca de la contaminación de petróleo 42 Hazen et al., www.sciencexpress.org / 24 August 2010 / Page 1 / 10.1126/science.1195979 2010: Derrame en el golfo de México 43 Nature, Vol 466, 12 Aug 2010, p. 802 Whole-Community RNA Amplification (WCRA) random hexam Promotor de T7 RNA polimerasa Gao et al., Appl Environ Microbiol 53, 563–571 (2007) Bioventing Proceso de airear suelos para estimular actividad biológica in situ y promover biorremediación. 45 Sistema típico de biorremediación de un acuífero Pozo de inyección Nutrientes/ Oxígeno Agua a tratar Pozo de recuperación pluma contaminada 46 Biorremediación in situ: 3. Bioaumentación Frecuentemente fertilizantes (caros) para microorganismos ya existentes. Pocas veces se analiza el resultado de la adición separada de nutrientes (cf bioestimulación) The reservoir contains up to a 30-day supply of Bacta-Pur® beneficial biotechnologies and nutrients. The nutrients have been specially developed to allow rapid growth and to optimize nitrifier production. A dosing pump transfers precise quantities of bacterial/nutrient mixture to the bioreactor. 47 Bioremediación: por qué los resultados de laboratorio tienen poco uso práctico? ? 48 Limitaciones a la funcionalidad de un inoculante • Baja concentración del contaminante Incluye problemas de baja solubilidad o baja biodisponibilidad • Presencia de compuestos inhibitorios • Depredación Reducción de poblaciones activas • Preferencia por otras fuentes de carbono • Incapacidad de dispersión El microoganismo no llega al contaminante 49 Limitaciones fisiológicas y regulatorias a la biorremediación • Falta de inducción del operón catabólico Falta de reconocimiento del efector regulatorio • Falta de reconocimiento del sustrato Enzimas catabólicas en la bacteria • Stress celular Por el mismo contaminante o el ambiente • Caos metabólico por múltiples contaminantes Generación de intermediarios tóxicos o vías muertas • Balance termodinámico del proceso de degradación Potencial redox y disponibilidad de aceptor de electrones 50 Desafíos en la construcción de GMB para uso en bioremediación Problema Solución E coli no es suficientemente robusta Usar bacterias ambientales Resistencia a antibióticos como marcador de selección Marcadores no antibióticos y resistencia extraíble Funciones codificadas en plásmidos Integración estable en cromosoma Expresión dependiente de inductores químicos Expresión dependiente en input ambiental Fuerte selección contra los genes/circuitos implantados Ortogonalización de la función 51 Inhibición metabólica en co-cultivo Reducción de quitina por PAO1 Aeromonas hydrophila Pseudomonas aeruginosa Aeromonas hydrophila Pseudomonas aeruginosa ReducciónReducción de quitinade porquitina AH-1N 52 Jagmann et al. Environmental Microbiology (2010) 12, 1787–1802 Inhibición metabólica en co-cultivo Producción de acetato Cultivos puros AH-1N Cultivos mixtos Producción de piocianina 53 Jagmann et al. Environmental Microbiology (2010) 12, 1787–1802 El cuello Diseñodedebotella cepasen degradadoras la biodegradación de no está necesariamente clorotolueno en la enzimología Cl CH3 Cl CH2OH TOD dioxigenasa (de Pseudomonas putida F1) todC1C2BA Cl CH2OH xylB Cl CHO Cl COOH TOL (pWW0 de P. putida mt-2) xylC vía orto cromosomal en el huésped Cl COOH Cl OH OH JB2 PA142 OH TCA OH • Velocidad Integraciónde estable flujos metabólicos • Producción Funcional endelavías conversión secundarias de 2-Cl improductivas tolueno en 2 Cl benzoato • No Control crecen fisiológico utilizando de 2-Cl vías tolueno degradativas 54 Haro & de Lorenzo 2001 Journal of Biotechnology 85, 103-113 Uso de microarrays para evaluar los patrones de expresión en P putida 55 Respuesta funcional de P. putida KT2440 a tolueno, o-xyleno y 3-MB 3 MB: 3-metil benzoato: sustrato o-xyleno: análogo no digerible 56 Domínguez-Cuevas P et al. J. Biol. Chem. 2006; 281:11981-11991 Los contaminantes son tomados como fuentes de stress, más que de nutrientes Consecuencia En ambientes heterogéneos los microorganismos migran hacia regiones con menores concentraciones de contaminantes La maquinaria transcripcional es reasignada a tolerar stress Sólo una pequeña fracción se redirige a la degradación del compuesto orgánico 57 Domínguez-Cuevas P et al. J. Biol. Chem. 2006; 281:11981-11991 Los compuestos orgánicos halogenados • Solventes • Agentes desengrasantes • Pesticidas • Productos farmacéuticos • Plastificantes • Fluídos hidráulicos y de transferencia térmica • Intermediarios de síntesis químicas, 58 Declorinación reductiva anaeróbica PCE, TCE, DCE y VC actúan como aceptores de electrones TCE Reductase tetracloroeteno tricloroeteno cis-dicloroeteno VC reductase cloruro de vinilo eteno Dehalobacter Desulfuromonas Se requiere carbono y una fuente de energía (dador de electrones) La fermentation de compuestos orgánicos produce H2, que actua como dador de electrones 59 Declorinación a eteno vs presencia de Dehalococcoides ausente ausente ausente 60 Hendrickson et al., 2002 Appl Environ Microbiol 68, 485–495 Secuencias similares, pero no idénticas 61 Hendrickson et al., 2002 Appl Environ Microbiol 68, 485–495 Degradación de TCE en microcosmos metanol lactato TCE cDCE TCE KB-1 TCE cDCE VC KB-1 eteno VC eteno 62 Major et al., Environ Sci Technol 2002, 36:5106-5116 Degradación de TCE en microcosmos TCE cDCE eteno d=-1 d=+1 VC d=+73 Las secuencias de Dehalococcoides aumentan progresivamente en abundancia y se desplazan dentro del área de tratamiento 63 Major et al., Environ Sci Technol 2002, 36:5106-5116 Liberación lenta de hidrógeno 64 Biorremediación in situ: 4. Fitoremediación El uso de plantas para extraer, secuestrar o detoxificar contaminantes Elementales Orgánicos Metales pesados, radionucleidos PAH, halogenados, nitroaromáticos i) Extracción y traslocación a tejidos vegetales ii) Secuestro en raíces iii) Conversión en especies menos tóxicas 65 Limitaciones de la fitoremediación i) El tiempo necesario para obtener efectos aceptables ii) La profundidad limitada de las raíces iii) El crecimiento lento de las plantas iv) La sensibilidad a algunos contaminantes v) El problema de ser parte de la cadena alimentaria vi) La dependencia del cambio en las condiciones climáticas 66 Rizoremediación: Contribución de microorganismos en la rizosfera a la degradación de contaminantes Criterios de selección 1.Capacidad de crecer rápidamente en un medio simple 2.Capacidad estable de degradar naftaleno 3.Capacidad de colonizar eficientemente la raíz 67 Kuiper et al.2001 MPMI 14, 1197-1205 La rizosfera controla la degradación de los contaminantes orgánicos 68 Cuál es el efecto de los exudados sobre la actividad? Pseudomonas fluorescens HK44 fusión nahG-lux El extracto de raíz inhibe la expresión de nahG 69 Kamath et al., 2004 Environ Sci Technol 38, 1740-1745 Cuál es el efecto de los exudados sobre la actividad? Bioluminiscencia total Degradación de naftaleno Crecimiento de biomasa La proliferación de genotipos competentes compensa la interferencia en la expresión de nahG Bioluminiscencia específica 70 Kamath et al., 2004 Environ Sci Technol 38, 1740-1745 Cuál es el efecto de los exudados sobre la diversidad? % desap (12d) 68 68 71 Cebron et al., 2011 Environmental Microbiology 13, 722–736 Cuál es el efecto de los exudados sobre la diversidad? El agregado de exudado favorece el aumento la diversidad de la población de degradadoras y el aumento del número de bacterias conteniendo genes de la dioxigenasa PAH-RHD Los exudados modifican las poblaciones de bacterias degradadoras de naftaleno. Dos ensambles diferentes pueden tener eficiencias de degradación similares. 72 Cebron et al., 2011 Environmental Microbiology 13, 722–736 Bioremediación ex situ: 1. Landfarming 1. Impermeabilización 2. Excavado 3. Remoción de piedras 4. Aplicación (<1.5m) 5. Fertilización 6. Arado (oxigenación) 73 Bioremediación ex situ: 1. Landfarming Ventajas • Simple para diseñar y operar • Tiempos de tratamiento relativamente cortos (6-24 meses) Desventajas • Requerimiento de grandes áreas • Liberación de compuestos volátiles • Necesidad de impermeabilización • Vulnerabilidad a metales pesados • Degradación incompleta 74 Bioremediación ex situ: 1. Landfarming http://www.opds.gba.gov.ar/index.php/leyes/ver/148 Bioremediación ex situ: 1. Landfarming Bioremediación ex situ: 2. Soil piling Bioremediación ex situ: 2. Soil piling 78 Bioremediación ex situ: 2. Biopilas Ventajas • Relativamente simple para diseñar y operar • Tiempos de tratamiento relativamente cortos (6-24 m) • La biodegradación es efectiva para un amplio rango de contaminantes Desventajas • Requerimiento de grandes áreas (menos que landfarming) • Liberación de compuestos volátiles • Vulnerabilidad a metales pesados • Los suelos con baja permeabilidad son dificiles de airear 79 Bioremediación ex situ: 3. Compostaje Agregado de mat. voluminoso 30% Agregado de nutrientes Agregado de materia orgánica Temp: 55 oC Ancho: 3-4 m Altura : 1-1.5 m (minimo) Grande para retener el calor Límite para obtener buena oxigenación Aireación : mezcla (1/d - 1/mes) Humedad: 40-60% Buena actividad vs buena oxigenación 80 Bioremediación ex situ: 3. Compostaje • Fase latente (Temp ambiente) colonización y aclimatación) • Fase crecimiento (20°C-40°C) altas tasas de respiración, aumento de temperatura • Fase termofílica (40°C-60°C) se alcanza el pico de temperatura • Fase mesofílica (40°C-temp amb) Segunda fase mesofílica (más lenta). Transformación de materia orgánica en compuestos húmicos, nitrificación Bioremediación ex situ: 3. Compostaje • Tratamiento de lixiviado • Sujeto a regulación ambiental • Presencia de metales pesados • Producción de olores • Relativamente grandes necesidades de espacio • Operación y monitoreo continuo 82 COMPOCHIP 83 Danon et al. 2008 FEMS Microbiology Ecology 65, 133–144 84 85 86 87 Bioremediación ex situ: 4. Bioreactor (slurry phase) Suelo contaminado Líquido contaminado Vapor Agitador Control de temperatura Nutrientes Salida de líquido Suelo a secar Entrada de aire 88 Bioremediación ex situ: 4. Bioslurry Ventajas • Relativamente rápido (semanas a 6 meses) • Técnicamente simple y efectivo • Mayor control de variables operativas (pH, temperatura, oxígeno, nutrientes, etc) Desventajas • Vulnerabilidad a metales pesados • La deshidratación del sólido tratado puede ser dificil • Se debe disponer el agua no reciclada • Mayor costo 89 Tiempos de biorremediación • La remediación in situ depende de la extensión, profundidad y concentración de la contaminación. Varía entre 1-6 años • La remediación ex situ utilizada para contaminantes fácilmente biodegradables o cuando se usan bioreactores puede llevar sólo 1-7 meses 90 Ventajas y desventajas de la biorremediación + • Menor costo que opciones alternativas • En muchos casos no produce residuos secundarios • Pozos de inyección se tapan • Problemas de “biodisponibilidad” • Difícil de implementar en matrices de baja permeabilidad • Requiere monitoreo y mantenimiento continuo 91 Temas importantes en biorremediación • Aspectos regulatorios y reportes independientes de estudios controlados • Bioremediación de compuestos recalcitrantes en ambientes complejos • Predicciones basadas en modelos cinéticos tradicionales no funcionan • Cómo saber que está funcionando? • Cuán limpio es limpio? 92 Cómo mejorar la bioremediación? 93 Ramos et al., Trends in Biotechnology (2011) doi:10.1016/j.tibtech.2011.06.007 Integración de microarrays en biorremediación Temas críticos • Especificidad • Sensibilidad • Cuantificación 94 Wagner et al., Microbial Ecology 53, 498–506 (2007)
