8. Bioremediación_2.pdf
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Biorremediación-­‐II Leonardo Erijman Conceptos y Técnicas de Biotecnología 2do cuatrimestre 2012 1 Diagrama de biorremediación Bioremediation in situ Engineered Biostimulation Adding Oxygen -Bioventing -Biosparging Adding Oxygen and Nutrients ex situ Intrinisic Landfarming Bioreactor Bioaugmentation Adding Oxygen, Nutrients and Bacteria 2 Procesos celulares sustrato transformación Compuesto químico (contaminante) CELULA aceptor de electrones • Oxígeno • Nitrato • Sulfato • hierro (III) • otros Sistemas enzimáticos Compuesto modificado pero no completamente eliminado mineralización nutrientes • Nitrógeno • fósforo • metales (trazas) Contaminante destruído formación de CO2 + H2O 3 Reacciones catalizadas por microorganismos • Deshalogenación: un átomo de cloro es remplazad por un átomo de hidrógeno Cl2C = CHCl + H+ ClHC = CHCl + Cl• Hidrólisis: ruptura de una molécula orgánica con adición de agua RCOOR’ + H2O RCOOH + R’OH • Clivaje: División de una cadena orgánica en dos segmentos RCOOH RH + CO2 • Oxidación: Reacción con formas nucleofílicas de oxígeno (H2O, OH-) CH3CHCl2 + H2O CH3CCl2OH + 2H+ + 2e• Reducción: Reacción con formas electrofílicas de hidrógeno (H+) CCl4 + H+ + 2eCHCl3 + Cl• Deshidrohalogenación CCl3CH3 CCl2CH2 + HCl 4 Vías catabólicas http://umbbd.msi.umn.edu/index.html Microbial biocatalytic reactions and biodegradation pathways • 188 pathways • 1293 reacciones • 1199 compuestos • 833 enzimas • 467 microorganismos • 50 grupos funcionales orgánicos 5 MúlLples vías catabólicas Diversidad en la biodegradación de tolueno 6 Factores que afectan el transporte de agua y nutrientes en la subsuperficie grava arena arcilla Permeabilidad CanLdad de espacio libre (poro) por volumen de material Indica el volumen de reserva en función del tamaño y textura Facilidad con que los fluídos se mueven a través del material. Es función (inversa) del tamaño 7 de poro Procesos que afectan la disponibilidad de materia orgánica en suelos 8 Andreoni & Gianfreda, Appl Microbiol Biotechnol (2007) 76:287–30 Distribución del contaminante 1. Solubilidad 2. Adsorción 3. VolaLlidad 4. NAPL Mob HV 2002. Advances in Environmental Research 6, 577–593 9 Caracterización de otros componentes abióLcos Ejemplo: modelado de reacciones (abió8cas) que afectan la biodegradación de BTEX 1. Disolución y precipitación de CaCO3, que cambia la alcalinidad y afecta la concentración de Ca2+ 2. Conversión de FeS en pirita (FeS2), que lleva a la pérdida de H2S 3. Disolución reducLva de Fe(III) por oxidación de S2-­‐, que consume H2S produciendo Fe2+ soluble y SO42-­‐ o S0 10 Maurer and Ri8mann, 2004 Biodegrada>on 15: 419–434 Caracterización de los aceptores de electrones En acuíferos, suelos y sedimentos predominan condiciones anóxicas 11 Caracterización de las comunidades microbianas autóctonas • Como parte de la caracterización del siLo para determinar la estrategia de remediación apropiada 12 Microautoradiograia (MAR) • Se incuba con un sustrato radioactivo • Se expone la emulsión a la radioactividad y se revela • Las células que degradan el sustrato aparecen como puntos negros, que pueden ser contados • El número de células totales se determina con DAPI o NA Ito et al., Appl. Environ. Microbiol., 68, 356-364, 2002 13 Microautoradiograia-­‐ FISH MAR-­‐FISH 14 Incubación con 14C-­‐fenantreno najaleno: 2.4-­‐4.5% del total de bacterias (Betaproteob, Gammaproteob y AcLnob) fenantreno: 0.8-­‐1.0% (Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria) 15 Rogers et al., 2007 Soil Sci. Soc. Am. J. 71: 620-­‐631 Limitaciones de MAR-­‐FISH • No se pueden detectar varios elementos simultáneamente • No ofrece buena resolución celular en agregados densos • Requiere el uso de isótopos radioacLvos • Algunos elementos no posees isótopos con vidas medias apropiadas (e.g. O y N) • Puede requerir Lempos largos (consumo secundario) • Las células fijadas y cubiertas por emulsión no se pueden manipular para hacer genómica de células individuales 16 Espectroscopía Raman Microscopía Raman confocal Imagen 100X Espectro típico de una célula individual 18 Huang et al., Raman Microscopic Analysis of Single Microbial Cells Anal. Chem. 2004, 76, 4452-4458 Espectroscopía Raman Diagrama de Jablonski A mayor masa, mayor energía del desplazamiento de Stokes fenilalanina 19 Wagner, M. Anal. Rev. Microbiol 2009, 63, 411-429 El corrimiento al rojo provocado por el 13C se puede calibrar 20 Huang et al., Raman Microscopic Analysis of Single Microbial Cells Anal. Chem. 2004, 76, 4452-4458 Las diferencias espectrales se deben al porcentaje de 13C-­‐glucosa en el medio 13C 21 Huang et al., Raman Microscopic Analysis of Single Microbial Cells Anal. Chem. 2004, 76, 4452-4458 Degradación de najaleno en un acuífero Control estéril 13C-naftaleno Formación de salicilato 12C-naftaleno 22 Huang et al., 2009 Appl Environ Microbiol, 75, 234–241 Degradación de najaleno en un acuífero analizado por SIP-­‐DGGE Acidovorax : alta afinidad revelado en SIP-DGGE P. fluorescence: baja afinidad obtenida por cultivo 23 Huang et al., 2009 Appl Environ Microbiol, 75, 234–241 RT-­‐PCR de expresión de mRNA de najaleno dioxigenasa 24 Huang et al., 2009 Appl Environ Microbiol, 75, 234–241 Degradación de najaleno en un acuífero analizado por SIP-­‐Raman bacteria total Pseudomonas sp Acidovorax sp FISH 25 Huang et al., 2009 Appl Environ Microbiol, 75, 234–241 Secondary Ion Mass Spectrometry (SIMS) 26 Wagner, M. Anal. Rev. Microbiol 2009, 63, 411-429 Microscopía SIP-­‐SIMS Suelo + 12C-­‐fenol Suelo + 13C-­‐fenol Comunidad microbiana degradadora de fenol en suelo 27 DeRito,C. M. Appl. Environ. Microbiol 2005, 71, 7858-7865 SIMSISH usando NanoSIMS El reactivo fluorescente usado en FISH es reemplazado por una molécula conteniendo isótopos estables o elementos raramente presentes en la biomasa, e.g. halógenos E. coli culLvadas en un medio con 99% de 13C mezcladas con B. sub>lis con abundancia isotópica natural. E. coli se pre-­‐hibridó con la sonda I6-­‐Eub338-­‐Cy3 Imagen secundaria 12C Imagen secundaria 13C Imagen secundaria 127I Imagen secundaria 32S Biomasa cont proteína Li et al., Environ. Microbiol 2008, 10, 580-588 Biosparging Proceso de airear suelos para esLmular acLvidad biológica in situ y promover biorremediación en la 29 zona saturada BiovenLng Proceso de airear suelos para esLmular acLvidad biológica in situ y promover biorremediación en la zona no saturada 30 BiovenLng 31 La permeabilidad del suelo es críLca 32 Bioremediación ex situ: 1. Landfarming hbp://www.opds.gba.gov.ar/index.php/leyes/ver/148 Bioremediación ex situ: 1. Landfarming hbp://www.epa.gov/oust/cat/LANDFARM.HTM 34 Bioremediación ex situ: 1. Landfarming 1. Impermeabilización 2. Excavado 3. Remoción de piedras 4. Aplicación (<1.5m) 5. FerLlización 6. Arado (oxigenación) 35 Bioremediación ex situ: 1. Landfarming Ventajas • Simple para diseñar y operar • Tiempos de tratamiento relaLvamente cortos (6-­‐24 m) Desventajas • Requerimiento de grandes áreas • Liberación de compuestos voláLles • Necesidad de impermeabilización • Vulnerabilidad a metales pesados • Degradación incompleta 36 Bioremediación ex situ: 1. Landfarming Bioremediación ex situ: 2. Soil piling Bioremediación ex situ: 2. Soil piling 39 Bioremediación ex situ: 2. Soil piling Ventajas • RelaLvamente simple para diseñar y operar • Tiempos de tratamiento relaLvamente cortos (6-­‐24 m) • La biodegradación es efecLva para un amplio rango de contaminantes Desventajas • Requerimiento de grandes áreas (menos que landfarming) • Vulnerabilidad a metales pesados • Los suelos con baja permeabilidad son dificiles de airear 40 Bioremediación ex situ: 3. Compostaje Agregado de mat. voluminoso 30% Agregado de nutrientes Agregado de materia orgánica Temp: 55 oC Ancho: 3-­‐4 m Altura : 1-­‐1.5 m (minimo) Grande para retener el calor Límite para obtener buena oxigenación Aireación : mezcla (1/d -­‐ 1/mes) Humedad: 40-­‐60% Buena acLvidad vs buena oxigenación 41 Bioremediación ex situ: 3. Compostaje • Fase latente (Temp ambiente) colonización y aclimatación) • Fase crecimiento (20°C-­‐40°C) altas tasas de respiración, aumento de temperatura • Fase termoMlica (40°C-­‐60°C) se alcanza el pico de temperatura • Fase mesoMlica (40°C-­‐temp amb) Segunda fase mesoilica (más lenta). Transformación de materia orgánica en compuestos húmicos, nitrificación Bioremediación ex situ: 3. Compostaje • Necesita tratamiento de lixiviado • Sujeto a regulación ambiental • Vulnerable a metales pesados • Producción de olores posible • RelaLvamente grandes necesidades de espacio • Operación y monitoreo conLnuo 43 COMPOCHIP Danon et al. 2008 FEMS Microbiology Ecology 65, 133–144 44 Bioremediación ex situ: 4. Bioreactor (slurry phase) Vapor Suelo contaminado Agitador Líquido contaminado Control de temperatura Nutrientes Salida de líquido Suelo a secar Entrada de aire 45 Bioremediación ex situ: 4. Bioreactor (slurry phase) Ventajas • RelaLvamente rápido (semanas a 6 meses) • Técnicamente simple y efecLvo • Mayor control de variables operaLvas (pH, temperatura, oxígeno, nutrientes, etc) Desventajas • Vulnerabilidad a metales pesados • La deshidratación del sólido tratado puede ser dificil • Se debe disponer el agua no reciclada • Alto costo 46 Aplicaciones industriales de compuestos orgánicos halogenados • Solventes • Agentes desengrasantes • PesLcidas • Productos farmacéuLcos • PlasLficantes • Fluídos hidráulicos y de transferencia térmica • Intermediarios de síntesis químicas, 47 Declorinación reducLva anaeróbica PCE, TCE, DCE y VC actúan como aceptores de electrones TCE Reductase tetracloroeteno tricloroeteno cis-­‐dicloroeteno VC reductase cloruro de vinilo eteno Dehalobacter Desulfuromonas Se requiere carbono y una fuente de energía (dador de electrones) La fermentaLon de compuestos orgánicos produce H2, que actua como dador de electrones 48 Declorinación a eteno vs presencia de Dehalococcoides ausente ausente ausente 49 Hendrickson et al., 2002 Appl Environ Microbiol 68, 485–495 Secuencias similares, pero no idénLcas 50 Hendrickson et al., 2002 Appl Environ Microbiol 68, 485–495 Liberación lenta de hidrógeno 51 Degradación de TCE en microcosmos metanol lactato TCE cDCE cDCE TCE KB-­‐1 TCE KB-­‐1 VC eteno VC eteno 52 Major et al., Environ Sci Technol 2002, 36:5106-­‐5116 Esquema de biorremediación en escala piloto 53 Major et al., Environ Sci Technol 2002, 36:5106-­‐5116 Biorremediación de TCE TCE cDCE eteno d=-­‐1 d=+1 VC d=+73 Las secuencias de Dehalococcoides aumentan progresivamente en abundancia y se desplazan dentro del área de tratamiento 54 Major et al., Environ Sci Technol 2002, 36:5106-­‐5116 Tiempos de biorremediación • La remediación in situ depende de la extensión, profundidad y concentración de la contaminación. Varía entre 1-6 años • La remediación ex situ utilizada para contaminantes fácilmente biodegradables o cuando se usan bioreactores puede llevar sólo 1-7 meses 55 Temas importantes en biorremediación • Aspectos regulatorios y reportes independientes de estudios controlados • Bioremediación de compuestos recalcitrantes en ambientes complejos • Predicciones basadas en modelos cinéticos tradicionales no funcionan • Cómo saber que está funcionando? • Cuán limpio es limpio? 56 Fitoremediación El uso de plantas para extraer, secuestrar o detoxificar contaminantes Orgánicos Elementales Metales pesados, radionucleidos PAH, halogenados, nitroaromáLcos i) Extracción y traslocación a tejidos vegetales iii) Secuestro en raíces iv) Conversión en especies menos tóxicas 57 Limitaciones de la fitoremediación i) El Lempo necesario para obtener efectos aceptables iii) La profundidad limitada de las raíces iv) El crecimiento lento de las plantas v) La sensibilidad a algunos contaminantes vi) El problema de ser parte de la cadena alimentaria vii) La dependencia del cambio en las condiciones climáLcas 58 La rizosfera controla la degradación de los contaminantes orgánicos 59 Rizoremediación: contribución de microorganismos en la rizosfera a la degradación de contaminantes Criterios de selección (degradación de naftaleno) 1. Capacidad de crecer rápidamente en un medio simple 2. Capacidad estable de degradar naftaleno 3. Capacidad de colonizar eficientemente la raíz Kuiper et al.2001 MPMI 14, 1197-­‐1205 60 Cuál es el efecto de los exudados sobre la acLvidad? Pseudomonas fluorescens HK44 fusión nahG-­‐lux El extracto de raíz inhibe la expresión de nahG Kamath et al., 2004 Environ Sci Technol 38, 1740-­‐1745 61 Cuál es el efecto de los exudados sobre la acLvidad? Bioluminiscencia total Degradación de najaleno La proliferación de genoLpos competentes compensa la interferencia en la expresión de nahG Crecimiento de biomasa Bioluminiscencia específica Kamath et al., 2004 Environ Sci Technol 38, 1740-­‐1745 62 Cuál es el efecto de los exudados sobre la acLvidad? % desap (12d) 68 68 63 Cebron et al., 2011 Environmental Microbiology 13, 722–736 Cuál es el efecto de los exudados sobre la acLvidad? El agregado de exudado favorece el aumento la diversidad de la población de degradadoras y el aumento del número de bacterias conteniendo genes de la dioxigenasa PAH-­‐RHD Los exudados modifican las poblaciones de bacterias degradadoras de najaleno. Dos ensambles diferentes pueden tener eficiencias de degradación similares. 64 Cebron et al., 2011 Environmental Microbiology 13, 722–736 Potencial de bioremediación Se degrada el contaminante en el laboratorio? SI EsLmación de la tasa de eliminación ( o inmovilización) NO No es posible la degradación Aislamiento en culLvo 65 Potencial de bioremediación Alguna bacteria presente Lene los genes necesarios? (probes para DNA) FGA, Real Lme PCR SI NO Se expresan los genes catabólicos? (probes para mRNA) FGA, Real Lme PCR Búsqueda de nuevas acLvidades CulLvo, Metagenómica SI NO Están acLvas las enzimas? (probes de acLvidad enzimáLca) SI degradación NO No hay degradación No hay degradación Manipulaciones iterativas 66 Monitoreo de bioremediación Estudio de tratabilidad: toma de decisiones Estrategia de tratamiento: atenuación natural, bioesLmulación, bioaumentación BIOREMEDIACION Monitoreo Estructura y dinámica de la comunidad FingerprinLng, POAs, CGAs, Real Lme PCR Función de la comunidad Metatranscriptomics Metaproteomics Metabolomics Concentración del contaminante y/o transformación? Biosensores SI 67 Literatura adicional • Paliwal et al., 2012. Integrated PerspecLve for EffecLve BioremediaLon Appl Biochem Biotechnol 166: 903–924 • Wagner, M. 2009. Single-­‐Cell Ecophysiology of Microbes as Revealed by Raman Microspectroscopy or Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging. Annu Rev Microbiol. 63: 411–429 • Juwarkar et al., 2010. A comprehensive overview of elements in bioremediaLon Rev Environ Sci Biotechnol 9: 215–288
