Situación actual de las técnicas de reproducción asistida en pequeños rumiantes Aktualni status postupaka asistirane reprodukcije malih preživača Antonio Gonzalez-Bulnes, Claudia A. Letelier, Ignacio Contreras-Solís, Juraj Grizelj Departamento de Reproducción Animal, INIA. Avda. Puerta de Hierro s/n, 28040-Madrid, Spain. Sažetak Korištenje postupaka asistirane reprodukcije ključno je za poboljšanje produktivnosti malih preživača, bilo korištenjem umjetnog osjemenjivanja (U.O.) ili embriotransfera (ET), bilo kombiniranjem obaju tehnika; uz uvijek neophodnu prethodnu sinkronizaciju estrusa. Ovaj rad predstavlja skraćeni pregled spoznaja iz područja asistirane reprodukcije malih preživača. Abstract The use of assisted reproduction techniques is crucial for the improvement of productive yields in small ruminants, either applying artificial insemination or embryo transfer or combining both techniques; a previous oestrus synchronization is always necessary. Current work is a brief review of the state of the art in assisted reproduction in small ruminants. Introducción Ovino y caprino son especies tradicionalmente importantes en el área Mediterránea. Los pequeños rumiantes, desde un punto de vista social, favorecen la producción de productos de primera necesidad, a un coste menor que otras especies, y permiten el mantenimiento de las actividades agrarias en zonas desfavorecidas; desde un punto de vista medioambiental permiten la utilización de los recursos naturales mediante la explotación de los recursos pastables, facilitan la conservación del medio gracias al aprovechamiento de zonas de matorral, limpiando las zonas de explotación y evitando la propagación de incendios. En el esquema de producción actual, los pequeños rumiantes tienen un tercer papel, la elaboración de productos de calidad, de origen natural y con posibilidades de competir en el mercado frente a productos similares. Este sistema debe partir de razas susceptibles de aportar buenos rendimientos en las condiciones ambientales y de manejo de cada país, de cada región y de cada explotación. A partir de ello, la aplicación de programas de manejo reproductivo y de selección y mejora genética es básica para conseguir un aumento de las producciones. Las técnicas de manejo reproductivo y de reproducción asistida pueden ser dirigidas al macho, inseminación artificial, o a la hembra, producción y transferencia de embriones. Ambas técnicas permiten la optimización de la eficiencia reproductiva y, en el caso de los programas de selección y mejora genética, el testaje de los reproductores mediante pruebas de progenie, posibilitando con ello la disponibilidad de genealogías paternas y/o maternas, la difusión amplia y rápida de los caracteres mejorantes y la conexión entre los rebaños adscritos al sistema de selección. Ambas pueden ser combinadas, y ambas exigen previamente la inducción y sincronización del celo y la ovulación en las hembras. Sus procedimientos, rendimientos y la influencia de factores intrínsecos, principalmente genéticos, y extrínsecos, derivados de factores medioambientales y de manejo, son revisados en el presente manuscrito. Inducción y sincronización de celos y ovulaciones El control del momento de aparición del celo y la ovulación es esencial para un adecuado manejo de la reproducción tanto en ovejas como cabras. Esta acción permite inducir el periodo de partos en la época más adecuada para el ganadero, aumentando la eficiencia reproductiva del rebaño. Y lo que es más, la sincronización de celos es indispensable para ser aplicado previamente a la inseminación artificial y/o la transferencia de embriones. La sincronización de celos es comúnmente realizada mediante la administración de progesterona, o sus derivados, y eCG (gonadotropina coriónica equina). Los tratamientos progestativos disminuyen la pulsatilidad de LH a valores similares a una fase luteal, evitando la ovulación de los folículos de tamaño preovulatorio; la retirada del progestágeno, junto a la administración de eCG, induce la aparición de una fase folicular, del celo y la ovulación. La progesterona o los progestágenos pueden ser aplicados por vía oral, intramuscular, subcutánea e intravaginal. Sin embargo, su uso en la práctica está restringido a la aplicación vaginal, en esponjas de poliuretano impregnadas con un progestágeno (Robinson, 1967); los más comúnmente utilizado son el FGA (acetato de fluorogestona) y el MAP (acetato de medroxiprogesterona), con una eficacia similar (Steffan et al., 1982). La progesterona puede ser aplicada también en dispositivos intravaginales (CIDR, Rhodes et al., 1988). En ovejas, los dispositivos intravaginales son mantenidos entre 12 y 14 días (Robinson, 1965), para sobrepasar la vida activa de un posible cuerpo lúteo. En cabras, las esponjas pueden ser mantenidas por 16 días (tratamiento largo, Armstrong et al., 1982); pero una duración tan larga puede causar vaginitis y otros problemas y, así, el protocolo más utilizado es la combinación de un progestágeno por 11 días y una dosis de prostaglandina F 2α para lisar un posible cuerpo lúteo (Corteel et al., 1988). La eCG se inyecta en el momento de la retirada de la esponja, con el objetivo tanto de favorecer un mayor número de folículos preovulatorios como de inducir la ovulación. La dosis de eCG es también crucial; la dosis media en ovejas es 500 UI, pero varía desde 250 a 600 UI, dependiendo de la raza, edad, estación del año y estado fisiológico (Cognie et al., 1970; Evans y Robinson, 1980). Sin embargo, la sincronización de celos con progestágenos tiene varios inconvenientes. En primer lugar, las tasas de concepción son menores que en celo natural. Esta disminución en la fertilidad se ha relacionado, en la oveja, con anomalías en el transporte espermático y su supervivencia en el tracto reproductivo femenino (Hawk y Conley, 1971), alteraciones en los patrones de secreción de LH (Scaramuzzi et al., 1988) y calidad de las ovulaciones (Killian et al., 1985). Las posibles causas parecen estar relacionadas con deficiencias en la secreción de esteroides durante el desarrollo folicular preovulatorio (Gonzalez-Bulnes et al., 2005a). En cabras, el uso de eCG también contribuye a los fallos en fertilidad debido a que induce la producción de anticuerpos, lo que disminuye la fertilidad de sucesivos tratamientos. Finalmente, el aumento de la regulación internacional en material de residuos químicos, que ha causado la prohibición de su uso en Estados Unidos o una fuerte restricción en los límites máximos de residuos permitidos en la Unión Europea. La sincronización de celos en pequeños rumiantes puede ser obtenida, en razas no estacionales o durante la época reproductiva en animales estacionales, mediante la inducción de luteolisis controlada por la administración de dos dosis de prostaglandina F2a, o sus análogos, separados 9–11 días (Nuti et al., 1992). Este tratamiento es efectivo para sincronizar celos en estación sexual, con más del 90% de las hembras mostrando sintomatología de celo (Greyling, 1996), pero la fertilidad es menor que con progestágenos (67% vs 80%) (Kusina et al., 2000). Las posibles causas de esta disminución no son bien conocidas. Estudios en ovejas (Boland et al., 1978), indican posibles alteraciones en la dinámica de crecimiento de los folículos preovulatorios y/o el momento de ovulación (Barret et al., 2002). Estudios en cabras indican que el momento de la fase luteal afecta la respuesta de las cabras a la inducción de celos con prostaglandinas. Los tratamientos con prostaglandinas se inyectan con un intervalos de 9-11 días; así, la mayoría de los animales estarán en mitad de la fase luteal en el momento de la segunda inyección. Esto asegura que todos los animales ovularán de forma sincronizada. Sin embargo, este sería el peor momento para el tratamiento, considerando la dinámica folicular; el mejor momento sería temprano en la fase luteal. Así, hay un mayor número de hembras con síntomas de celo, una aparición más temprana de esta sintomatología y un mayor número de animales respondiendo con ovulaciones en cabras tratadas en fase luteal temprana (Gonzalez-Bulnes et al., 2005b). En cabras, como en otros rumiantes, la mayoría de los folículos en la primera onda de crecimiento están en estado creciente (ver la revisión de Rubianes y Menchaca, 2003). El número de ondas foliculares y el día de emergencia de los folículos es muy variable entre animales e impredecible (Ginther y Kot, 1994; de Castro et al., 1999; Gonzalez-Bulnes et al., 1999; Menchaca y Rubianes, 2002). Así, algunos de los folículos más grandes están en crecimiento en los días 11 y 16, pero otros están estáticos o en regresión (Gonzalez-Bulnes et al., 2005b). Esta alta variabilidad individual causa una pérdida total de sincronización de la segunda y sucesivas ondas foliculares; lo que interfiere con la fertilidad. Inseminación Artificial Actualmente, el uso de la inseminación artificial (IA) es ineludible en programas de selección genética, ya sea para leche, lana o carne. El uso de la IA se desarrolló fuertemente en Australia en la década de 1970, en ovejas de lana, de forma similar a como se realizaba en novillas lecheras, inseminando entre 15 y 17 horas después de la detección de celos (Lightfoot y Salamon, 1970). La aplicación de tratamientos progestativos, diseñados en el mismo país a finales de 1960 y principios de los 70 fue muy importante para el desarrollo de la IA, debido a la posibilidad de inseminar en tiempo prefijado sin detección de celos, 55-56 horas después de la retirada del progestágeno, con una fertilidad del 50% (Colas y Brice, 1970). En cabras, la inseminación debe ser aplicada antes, 46-47 horas después de la retirada de la esponja. El uso combinado de IA y progestágenos permite el uso de semen refrigerado a 15ºC, con dosis no menores de 400 x 106, con una fertilidad de aproximadamente el 50% (Fieni et al., 1992). En cabras, la estructura anatómica del cérvix permite una deposición del semen más profunda, incluso en el útero, en un 30-50% de las hembras, así, la fertilidad puede alcanzar el 70% (Amoah y Gelaye, 1997). Las tasas de fertilidad obtenidas estarán determinadas por la viabilidad de los espermatozoides (Hawk y Conley, 1971) y el intervalo entre la ovulación y la deposición del semen (Signoret y Cognie, 1975). El uso de semen congelado está dificultado en ovejas por la imposibilidad de traspasar el cérvix; en cabras, es posible alcanzar un 40% de fertilidad. El desarrollo de la IA mediante laparoscopía (IAL) por Killeen y Caffrey (1982), permitió depositar el semen en el interior del útero y, así, un significativo incremento en las tasas de fertilidad con semen congelado. El uso de IAL con semen refrigerado es también beneficioso, ya que aumenta la fertilidad usando dosis con menor número de espermatozoides. Desde un punto de vista técnico, en el uso de IAL, es importante asegurar la deposición del semen en el interior del útero y no en la pared uterina, evitar el uso de anestesia que puede interferir con la ovulación (Radford, 1966), y distribuir la mitad de cada dosis en cada cuerno uterino, evitando la exteriorización de los ovarios (McKelvey et al., 1985). Superovulación y transferencia de embriones Si la IA es la técnica de elección para maximizar el progreso genético a partir del macho, la tecnología de embriones es la técnica para realizarlo usando la hembra. En esencia, la superovulación consiste en la administración de altas dosis de productos comerciales de FSH para estimular el crecimiento de un alto número de folículos preovulatorios y, así, un alto número de oocitos para la producción in vitro de embriones o un alto número de ovulaciones para la producción in vivo. Actualmente, los protocolos para producción de embriones in vivo aplicados en nuestro grupo en ganado caprino consisten en la sincronización de celos con la aplicación de 45mg de FGA durante 16 días, combinada con una dosis única de 0.4ml de cloprostenol en la primera inyección de FSH; el tratamiento superovulatorio consiste en 8 dosis de 1.25ml de FSH ovina (OvagenTM, ICP, NZ), a intervalos de 12h. El uso de este protocolo permite una media de 14.3 cuerpos lúteos, 11.3 embriones recuperados y 6.8 embriones viables por cabra superovulada. En ovejas, el protocolo es similar, excepto que las dosis son decrecientes (1.5mLx3; 1.25mLx2; 1mlx3); el número medio de cuerpos lúteos es 15.9, con una media de 13.5 embriones recuperados y 7.0 embriones viables por hembra (Gonzalez-Bulnes et al., 2004). Sin embargo, los rendimientos están limitados por una alta variabilidad en la respuesta ovárica a los tratamientos superovulatorios necesarios para incrementar el número de embriones, por alteraciones en los procesos de fertilización y en la viabilidad de los embriones durante los estadios tempranos de desarrollo. Uvod Ovce i koze su tradicionalno važne vrste u području Sredozemnog bazena. Mali preživači, sa socijalnog gledišta, omogućuju proizvodnju primarnih proizvoda uz manji trošak nego ostale vrste te omogućuju poljoprivrednu aktivnost u područjima s nepovoljnim uvjetima. S gledišta okoliša, mali preživači omogućuju iskorištavanje prirodnih dobara putem korištenja pašnjaka, oni olakšavaju očuvanje okoliša zahvaljujući iskorištavanju šipražja, krčeći takova područja te na taj način ujedno smanjuju i mogućnost pojave požara. U smislu suvremene proizvodnje, mali preživači imaju novu ulogu, a to je produkcija kvalitetnih proizvoda, prirodnog podrijetla, spremnih za tržišnu utrku sa sličnim proizvodima. Takav sustav kreće od odgovarajućeg pasminskog odabira koji može ostvariti dobre prinose u datim prirodnim okolnostima i načinima uzgoja u svakoj pojedinoj zemlji ili području te napose tipu iskorištavanja. Krenuvši od toga, primjena reproduktivnih i selekcijskih programa te genetskog unaprijeđenja predstavlja temelj ostvarenja veće proizvodnje. Tehnologija upravljanja reprodukcijom i postupci asistirane reprodukcije, mogu biti orijentirani prema mužjaku (umjetno osjemenjivanje) ili prema ženki (proizvodnja i transfer zametaka). Obje tehnike omogućuju optimizaciju reproduktivne učinkovitosti te, u slučaju selekcijskih programa i genetskog unaprijeđenja, testiranje takovih rasplodnih potencijala putem progenih testova, omogućujući tako poznavanje podrijetla matera i očeva, široku i brzu difuziju poželjnih osobina i vezu između stada uključenih u sustav selekcije. Obje tehnike mogu biti kombinirane, a svaka zahtijeva predhodnu indukciju estrusa te sinkronizaciju estrusa i ovulacije u ženki. Njihovi postupci, rezultati i utjecaj unutarnjih čimbenika (primarno genetskih) te vanjskih (proizašli iz okoliša i uzgoja), tema su ovog rada. Indukcija i sinkronizacija estrusa i ovulacije Kontrola trenutka pojave estrusa i ovulacije temelj je adekvatnog upravljanja reprodukcijom u ovaca i koza. Ovaj postupak omogućuje poticanje razdoblja janjenja i jarenja u razdoblju kada je to stočaru najpoželjnije, povećavajući tako reproduktivnu učinkovitost stada. I ne samo to, sinkronizacija estrusa neophodna je za provođenje umjetnog osjemenjivanja i embriotransfera. Sinkronizacija estrusa uobičajeno se provodi aplikacijom progesterona ili njegovih derivata i eCG-a (konjski korionski gonadotropin). Progestagenski postupak smanjuje pulsatorno izlučivanje LH na vrijednosti slične onima u lutealnoj fazi ciklusa, spriječavajući tako ovulaciju preovulatornih folikula. Vađenje progestagena, uz istodobnu aplikaciju eCG-a inducira pojavu folikularne faze ciklusa, estrus i ovulaciju. Progesteron ili progestageni mogu se aplicirati peroralno, intramuskularno, subkutano te intravaginalno. Ipak, njegovo korištenje je u praksi ograničeno na vaginalnu aplikaciju, u vidu poliuretanskih spužvica impregniranih nekim progestagenom (Robinson, 1967). Najčešće se koriste FGA (fluorogeston acetat) i MAP (medroksiprogesteron acetat) sa sličnom učinkovitošću (Steffan i sur., 1982). Progesteron može biti korišten i u vidu intravaginalnih spirala (CIDR, Rhodes i sur., 1988). U ovaca se takovi intravaginalni umetci postavljaju na razdoblje od 12 do 14 dana (Robinson, 1965) kako bi vremenski nadmašili razdoblje aktivnosti žutog tijela koje se možda u tom trenutku nalazi na jajniku. U koza se pak spužvice mogu držati i 16 dana (dugi tretman; Armstrong i sur., 1982); ali u tom slučaju moguća je pojava vaginitisa i drugih problema pa se zato koristi protokol koji kombinira aplikaciju progestagena kroz 11 dana i jednokratnu aplikaciju prostaglandina F2α koji će dovesti do lize eventualno prisutnog žutog tijela (Corteel i sur., 1988). Injekcija konjskog korionskog gonadotropina (eCG) se aplicira paralelno sa vađenjem spužvice, s ciljem kako nastanka većeg broja preovulatornih folikula, tako i indukcije ovulacije. Doziranje eCG-a je od odlučujuće važnosti; prosječna doza u ovaca je 500 i.j., ali varira od 250 do 600 i.j., ovisno o pasmini, dobi životinje, razdoblju godine i fiziološkom statusu (Cognie i sur., 1970; Evans y Robinson, 1980). Ipak, sinkronizacija estrusa progestagenskim preparatima ima i svoje nedostatke. Na prvom mjestu svakako je niža stopa koncepcije, nego što je slučaj u spontanom, prirodno nastalom estrusu. Navedeno smanjenje plodnosti povezuje se u ovaca, sa anomalijama u transportu spermija i njihovom preživljavanju u reproduktivnom traktu (Hawk i Conley, 1971), promijenjenim modelom sekrecije LH (Scaramuzzi i sur., 1988) i kvalitetom ovulacije (Killian et al., 1985). Mogući uzroci čini se da su povezani sa manjkavostima u sekreciji steroida tijekom razvoja preovulatornih folikula (Gonzalez-Bulnes i sur., 2005a). U koza pak, korištenje eCG-a također doprinosi smanjenoj plodnosti zbog indukcije nastanka antitijela koji umanjuju učinkovitost sljedećih tretmana. Konačno, pooštrena je međunarodna legislativa vezano uz kemijske rezidue, što je dovelo do njegove zabrane korištenja u SAD-u te do jake restrikcije maksimalno dozvoljenih granica rezidua u Europskoj Uniji. Sinkronizacija estrusa se u malih preživača može ostvariti kod nesezonalnih pasmina ili tijekom trajanja sezone spolne aktivnosti u sezonalnih životinja, inukcijom luteolize aplikacijom dvaju doza prostaglandina F2α ili njihovog analoga, u razmaku od 9-11 dana (Nuti i sur., 1992). Ovaj je postupak učinkovit u sinkroniziranju estrusa tijekom trajanja sezone spolne aktivnosti, sa više od 90% ženki koje pokazuju znakove estrusa (Greyling, 1996), ali je plodnost niža u odnosu na postupke koji uključuju progestagene (67% nasuprot 80%) (Kusina i sur., 2000). Mogući uzroci ovoga smanjenja nisu posvema poznati. Istraživanja u ovaca (Boland i sur., 1978) ukazuju na moguće promjene u dinamici rasta preovulatornih folikula i trenutak pojave ovulacije (Barret i sur., 2002). Studije na kozama su pokazale da odgovor koza na indukciju estrusa prostaglandinima ovisi o razdoblju lutealne faze u kojoj je tretman obavljen. Tretman prostaglandinima odvija se dvostrukom aplikacijom istih, u razmaku od 9-11 dana; na taj način većina životinja će biti u sredini lutealne faze u trenutku aplikacije druge injekcije. To će osigurati da sve životinje ovuliraju u isto vrijeme. Ipak, to je najgori trenutak za tretman s gledišta folikularne dinamike. Najbolji bi trenutak bio tijekom rane lutealne faze što bi dovelo do većeg broja koza sa simptomima estrusa, ranije pojave estrusa i većeg broja životinja koje će ovulirati (Gonzalez-Bulnes i sur., 2005b). U koza, kao i u ostalih preživača, većina folikula u prvom valu folikularnog rasta nalazi se u fazi rasta (Rubianes y Menchaca, 2003). Broj folikularnih valova i dan pojave folikula veoma varira između životinja i nepredvidiv je (Ginther i Kot, 1994; de Castro i sur., 1999; Gonzalez-Bulnes i sur., 1999; Menchaca i Rubianes, 2002). Na taj način, samo su neki od najvećih folikula 11. i 16. dana ciklusa u rastu, dok su ostali statični ili u regresiji (Gonzalez-Bulnes i sur., 2005b). Ta visoka individualna varijabilnost svih folikularnih valova, osim prvog, uzrok je potpunog gubitka sinkronizacije drugog i svih sljedećih folikularnih valova spolnog ciklusa, što utječe na smanjenje plodnosti. Umjetno osjemenjivanje Korištenje umjetnog osjemenjivanja (U.O.) neizbježno je u programima genetske selekcije, bilo u smislu produkcije mlijeka, vune ili mesa. Uporaba UO-a snažno se razvila u Australiji 70-tih godina 20. stoljeća u ovaca za proizvodnju vune na sličan način kako se realizira u krava muzara, osjemenjujući ih između 15 i 17 sati nakon detekcije estrusa (Lightfoot i Salamon, 1970). Primjena progestagenskih postupaka, osmišljenih u istoj zemlji koncem 60-tih i početkom 70-tih godina prošlog stoljeća, odigrala je vrlo važnu ulogu u razvoju U.O.-a, zahvaljujući mogućnosti osjemenjivanja u unaprijed određeno vrijeme, bez detekcije estrusa, 55-56 sati nakon vađenja spužvica te sa plodnošću od 50% (Colas i Brice, 1970). U koza osjemenjivanje mora biti izvršeno nešto ranije, 46-47 sati nakon izvlačenja spužvice. Kombiniranje U.O.-a i progestagena omogućuje uporabu sjemena ohlađenog na 15ºC, u dozi ne manjoj od 400x106 te plodnosću od približno 50% (Fieni i sur., 1992). U koza anatomska građa cerviksa omogućuje dublje polaganje sjemena, uključujući čak i uterus u 30-50% ženki; na taj način plodnost može dosegnuti i 70% (Amoah i Gelaye, 1997). Stope ostvarene plodnosti određene su vitalnošću spermija (Hawk i Conley, 1971) te razmakom između ovulacije i polaganja sjemena (Signoret y Cognie, 1975). Uporaba smrznutog sjemana otežana je u ovaca zbog nemogućnosti prolaza kroz cerviks. U koza pak moguće je dosegnuti 40% plodnosti. Razvoj laparoskopskog umjetnog osjemenjivanja (L.U.O.) kojeg su uveli Killeen i Caffrey (1982), je omogućio polaganje sjemena u maternicu i na taj način značajan porast stope plodnosti pri korištenju smrznutog sjemena. Korištenje L.U.O.-a s ohlađenim sjemenom je također koristno jer povećava plodnost korištenjem doza s manjim brojem spermija. S tehničkog gledišta, prilikom L.U.O. važno je ostvariti polaganje sjemena u unutrašnjost maternice, a ne greškom u samu materničnu stijenku. Nadalje, treba izbjeći korištenje anestezije jer može interferirati sa ovulacijom (Radford, 1966) te je potrebno raspodijeliti polovicu korištene doze u svaki od materničnih rogova, izbjegavajući prilikom manipulacija eksteriorizaciju jajnika (McKelvey i sur., 1985). Superovulacija i trensfer zametaka Ako je U.O. tehnika izbora kojom maksimiziramo genetski napredak koji polazi od mužjaka, onda je tehnologija sa zametcima tehnika koja se temelji na ženkama. Sažeto rečeno, superovulacija se sastoji od aplikacije visokih doza komercijalnih produkata FSH kako bi se izazvala stimulacija rasta velikog broja preovulatornih folikula i na taj način velik broj oocita za in vitro produkciju zametaka ili velik broj ovulacija za proizvodnju zametaka in vivo. Protokoli za proizvodnju zametaka in vivo u koza koji se trenutačno koriste u našem istraživačkom timu se sastoje od sinkronizacije estrusa aplikacijom spužvica 45mg FGA tijekom 16 dana u kombinaciji sa jednom dozom 0,4mL cloprostenola paralelno sa prvom injekcijom FSH. Superovulacijski tretman sastoji se od 8 doza od 1,25mL ovčjeg FSH (OvagenTM, ICP, Novi Zeland) u razmacima od 12 sati. Korištenje ovog protokola ostvaruje u prosjeku 14,3 žutih tijela; 11,3 zametaka nakon ispiranja maternice i 6,8 vitalnih zametaka po svakoj superovuliranoj kozi. U ovaca je protokol sličan, osim što su doze hormona u padajućem nizu (1,5mLx3; 1,25x2; 1mLx3). Prosječan broj žutih tijela je 15,9; prosjek dobivenih zametaka nakon ispiranja maternice 13,5 te 7 vitalnih zametaka po svakoj ženki (Gonzalez-Bulnes i sur., 2004). Ipak, učinkovitost tehnike ograničena je visokom varijabilnošću jajničkog odgovora na superovulatorne tretmane neophodne za povećanje broja zametaka te promjenama u procesu oplodnje i vitalnosti zametaka tijekom ranog razvojnog razdoblja. Referencias bibliográficas 1. Amoah EA, Gelaye S.. Biotechnological advances in goat reproduction. J Anim Sci 1997; 75: 578-585. 2. Armstrong DT, Pfitzner AP, Porter KJ, Warnes GM, Janson PO, Seamark RF.. Ovarian responses of anoestrous goats to stimulation with pregnant mare serum gonadotrophin. Anim. Reprod. Sci. 1982; 5: 15-23. 3. Baril G, Vallet JC. Time of ovulation in dairy goats induced to superovulate with porcine follicle stimulating hormone and out of the breeding season. Theriogenology 1990; 34: 303-311. 4. Barret DW, Bartlewski PM, Cook SJ, Rawlings NC. Ultrasound and endocrine evaluation of the ovarian response to PGF2α given at different stages of the luteal phase in ewes. Theriogenology 2002; 58: 1409–1424. 5. Boland MP, Gordon IR, Kellcher DL. The effect of treatment by prostaglandin analogue (ICI-80996) or progestagen (SC-9880) on ovulation and fertilization in cyclic ewes. J Agric Sci Cambr 1978; 91: 727–730. 6. Cognie Y, Mariana JC, Thimonier J. Etude du moment d’ovulation chez la brebis normale ou traitee par un progestagen associe ou non a une injection de PMSG. Ann Biol Anim Bioch Biophys 1970; 10: 15-24. 7. Colas G, Brice G. Fertility of fluorogestona acetate treated ewes inseminated with frozen sperm. Ann Zootech 1970; 19: 353 8. Corteel JM, Leboeuf B, Baril G. Artificial breeding of adults goats and kids induced with hormones to ovulate outside the breeding season. Small Rumin Res 1988; 1: 19-35. 9. de Castro T, Rubianes E, Menchaca A, Rivero A. Ovarian dynamics, serum estradiol and progesterone concentrations during the interovulatory interval in goats. Theriogenology 1999; 52: 399–411. 10. Evans G, Robinson TJ. The control of fertility in sheep: endocrine and ovarian responses to progestagen-PMSG treatment in the breeding season and in anoestrous. J Agric Sci Camb 1980; 94: 69-88. 11. Fieni F, Roques JM, Tainturier D, Bruyas JF. Utilisation du contrôle endoscopique pour l’insémination intrautérine chez les petits ruminants. Rec. Méd. Vét. 1992 ; 168: 295-302. 12. Ginther OJ, Kot K. Follicular dynamics during the ovulatory season in goats. Theriogenology 1994; 42: 987– 1001. 13. Gonzalez de Bulnes A, Osoro K, Lopez Sebastian, A. Factores condicionantes de la respuesta del ganado caprino a la sincronización de celos mediante progestágenos y PMSG. Archivos de Zootecnia, 1999; 48: 231234. 14. Gonzalez-Bulnes A, Baird DT, Campbell BK, Cocero MJ, Garcia-Garcia RM, Inskeep EK, Lopez-Sebastian A, McNeilly AS, Santiago-Moreno J, Souza CJ, Veiga-Lopez A. Multiple factors affecting the efficiency of multiple ovulation and embryo transfer in sheep and goats. Reprod Fertil Dev 2004; 16: 421-435 15. Gonzalez-Bulnes A, Veiga-Lopez A, Garcia P, Garcia-Garcia RM, Ariznavarreta C, Sanchez MA, Tresguerres JAF, Cocero MJ, Flores JM. Effects of progestagens and prostaglandin analogues on ovarian function and embryo viability in sheep. Theriogenology. 2005a; 63: 2523-2534. 16. Gonzalez-Bulnes A, Diaz-Delfa C, Garcia-Garcia RM, Urrutia B, Carrizosa JA, Lopez-Sebastian A. Origin and fate of preovulatory follicles after induced luteolysis at different stages of the luteal phase in goats. Anim Reprod Sci 2005b 6: 237-245. 17. Greyling JPC. The effect of dose of prostaglandin in the synchronization of oestrus in the Boer goat doe. In: Proceedings of the Sixth International Conference in Goats, Beijing, China, 1996, p. 826 (abstract). 18. Hawk HW, Conley HH. Sperm transport in ewes administred synthetic progestagen. J Anim Sci 1971; 24: 233. 19. Killeen ID, Cafrey GJ. Uterine insemination of ewes with the aid of a laparoscope. Aust Vet J 1982; 59: 95. 20. Killian DB, Kiesling DO, Warren JR. Lifespan of corpora lutea induced in estrous-synchronized cycling and anoestrous ewes. J Anim Sci 1985; 61: 210. 21. Kusina NT, Tarwirei H, Hamudikuwanda H, Agumba G, Mukwena J.. A comparison of the effects of progesterone sponges and ear implants, PGF2α, and their combination on efficacy of estrus synchronization and fertility of Mashona goat does. Theriogenology 2000; 53: 1567–1580. 22. Lightfoot RJ, Salamon S. Fertility of ram spermatozoa frozen by the pellet method. J Reprod Fertil 1970; 22: 385-398. 23. McKelvey WAC, Robinson JJ, Aitken RP. The evaluation of a laparoscopic insemination technique in ewes. Theriogenology, 1985; 24: 519-535. 24. Menchaca A, Rubianes E. Relation between progesterone concentrations during the early luteal phase and follicular dynamic in goats. Theriogenology 2002; 57: 1411–1419. 25. Nuti LC, Minhas BS, Baker WC, Capehart JS, Marrack P. Superovulation and recovery of zygotes from Nubian and alpine dairy goats. Theriogenology 1987; 28: 481-488. 26. Radford HM.. Pharmacological blockade of ovulation in the ewe. J Endocrinol 1966; 34: 135-136. 27. Rhodes L, Nathanielsz PW. Comparison of a controlled internal drug release device containing progesterone with intravaginal medroxiprogesterone sponges for estrus synchronization in ewes. Theriogenology 1988; 4: 831. 28. Robinson TJ, Moore NW, Holst PJ, Smith JF.. The evaluation of several progestogens administered in intravaginal sponges for the synchronization of oestrus in the entire cyclic Merino ewe. In: T.J. Robinson (ed.). Control of the ovarian cycle in the sheep. White and Bull PTY Ltd., Sydney, 1967: 76-91. 29. Robinson TJ. Use of progestagen impregnated sponges inserted intravaginally or subcutaneously for the control of the oestrous cycle in the sheep. Nature, 1965; 206: 39-41. 30. Robinson TJ. The control of the ovarian cycle in the sheep. Sydney University Press, Sydney, Australia, 1967; pp: 237-244. 31. Rubianes E, Menchaca A. The pattern and manipulation of ovarian follicular growth in goats. Anim Reprod Sci 2003; 78: 271–287. 32. Scaramuzzi RJ, Downing JA, Campbell BK, Cognie Y. Control of fertility and fecundity of sheep by means of hormonal manipulation. Austr J Biol Sci 1988; 41: 37-45. 33. Signoret JP, Cognie Y. Determination of the moment of ovulation in ewe and sow. Influence of environment and hormonal treatment. Ann Biol Anim Bioch Biophys 1975; 15: 205-214. 34. Steffan J, Poissonet P, Thibier M. Control of oestrus in ewe lambs and yearling ewes with medroxiprogesterone acetate and fluorogestone acetate. Anim Reprod Sci 1982; 5: 191-198.