DISTRIBUCIÓN,MADURACIÓN, PLEGAMIENTOYDEGRADACIÓNDE PROTEÍNAS BLOQUEV BIOSÍNTESISDEMACROMOLÉCULAS, GRADOBIOQUÍMICA FUENTE: BIOLOGÍAMOLECULAREINGENIERÍAGENÉTICA,ELSEVIER,2ªEDICIÓN2012 GENEESSENTIALSLEWIN2ªEDICIONPANAMERICANA2012 1 DISTRIBUCIÓN UnavezsinteGzadala proteínaporlosribosomas hadedistribuirsey localizarseenelespacio celularcorrespondiente 2 TRÁNSITOPROTEICO 3 PÉPTIDOSEÑAL(SECUENCIASEÑALOLIDER) PépGdoqueportainformaciónsobreeldesGnodela proteínasinteGzada:secretada,odemembrana(celular,RE oGolgi). Situadoenlaregiónaminoterminal: • UnoovariosaadecargaposGva(Lys,Arg) • 5-15aahidrofóbicos(Leu,Pro,Try,etc). • Variosaapequeñosdecadenalateralcorta(Gly,Ala) • ElpépGdoseñalsesinteGza porunribosoma citoplasmáGco. Riboforina • Elpé=doseñal(leader)es reconocidoporelcomplejo llamadoparFculade reconocimientodeseñal (SRP)queparalasíntesisy transportaelribosoma(con mensajeroypolipépGdo naciente)alamembranadel RE,dondeesrecibidoporel receptordeSRP. 5 Riboforina SRP-R • SRP • • LaproteínareceptoradeSRP interaccionaconlaproteína receptoradelribosomaoriboforina, queanclalasubunidadmayordel ribosomaycreauncanalparala entradadelpépGdonaciente. ElpépGdonacienteseintroduceal lumendelREporelcanalde translocación,mientrasseva sinteGzando. ElpépGdoseñalseeliminaunavezen ellumendelREporlas“proteasasde señal”. 6 Observaquelatranslocaciónsedadurantelatraducción. Lasanteriores gráficassetratade simplificaciones didácGcas,esta animación,sebasa endatosmásreales. Observacomola subunidadgrande delribosomase sitúaenla membranadelREy permiteelpasodel pépGdonacienteal lumendelRE. Elementosenla animación: • ARNm • ARNt,aa • Subunidadesribosoma • eEF1,eEF2 • Parcculadereconocimientodeseñal(SRP) • ReceptordeSRP • Riboforina. TRANSPORTENÚCLEO • Lasmoléculaspequeñasdifundenentreelnúcleoo elcitoplasma. • EltransportedecompuestosdeenGdad(moléculas >50KDa)serealizadeformaacGvaymuycontrolada atravésdelosporosnucleares. 9 Hayalrededorde2000poros enelnúcleocelular(media, dependedelGpocelularydel estadofisiológico). Aperturade120nm. Compuestospor30proteínas diferentes,enmúlGples copias. Ejercenunpapel fundamental,porejemplo, permiGendoquelosARNm madurospuedanviajaral citoplasmadondeson traducidos. 11 SEÑALDELOCALIZADORNUCLEAR Nuclearlocaliza=onsignal(NLS) • Señalparaexportarproteínasdelcitoplasma alnúcleo. • Presenteenelinteriordelacadena polipepcdica(noseescindencomolaseñal lider) • ConGene4-9aa(conGnenaabásicosLys,K). PKKKRKV(ej:SV40LargeT-anGgen). • SeunenaproteínasimporGna-RanGTPasas quemediansupasoporelporonuclearal núcleo. 12 • Impor=naseuneaRanGDP(rojo),yaumentasu afinidadporlamoléculaa transportar. • Eltransportesehacea travésdelporonuclear. • Enelnúcleo,GTPdeRan secambiaporGDPcon ayudadelaGuanine nucleoGdeexchangefactor (GEF)ylaimporGnapierde afinidadporlacargayla suelta. 13 SEÑALDEEXPORTACIÓNDELNUCLEO Nuclearexportsignal(NES) • Señalparaexportarproteínasdelnúcleoal citoplasma. • ConGene4-5aahidrófóbicos(Leu,L). LQLPPLERLTL(ej:revproteinofHIV-1). • SeunenaproteínasexporGna-RanGTPasas quemediansupasoporelporonuclearal citoplasma. 14 • Expor=naseuneaRanGTP(rojo)yaumentasu afinidadporlamoléculaa transportar(alcontrario imporGna). • Eltransportesehacea travésdelporonuclear. • Enelcitoplasma,GTPde Ransehidrolizaporla GTPase-acGvaGngprotein (GAP)ylaExporGnapierde afinidadporlacargayla suelta. 15 GTPase-acGvaGngprotein(GAP) Localizadacasiexclusivamente enelcitoplasma GuaninenucleoGdeexchangefactor(GEF) Localizadapredominantemente enelnúcleo 16 ExporGnasy RAN-GTPasas también controlanel transportede ARNsal citoplasma. Recuerdala biogénesisde losmicroARNs. 17 TRANSPORTESAOTRASESTRUCTURAS CELULARES Ademásdelasestudiadasexistenotrasseñales polipepcdicasqueconGeneninformaciónparatraslocara lasproteínasalcomparGmientocelulardondedesarrollan sufunción. TRANSPORTESAOTRAS ESTRUCTURASCELULARES Conceptualmenteleprocesoes similar: lasproteínasqueportanlaseñal sonreconocidasporproteínas auxiliareseinteraccionancon transloconesquelasinternalizan deformaespecífica. MADURACIÓNDELASPROTEÍNAS Conjuntodealteracionespost-traduccionalesque modificanlaestructura/funcióndelaproteína: I) MODIFICACIÓNDEAA. II) ESCISIÓNPROTEOLÍTICA. III) SPLICINGOAYUSTEDEProteínas. 20 MADURACIÓNDELASPROTEÍNAS I) MODIFICACIÓNDEAA: Ø Adicciónpequeñosgruposquímicos: • AceGlación(-CO-CH3) • Carboxilación(-COOH) • Fosforilación(PO43−) • Hidroxilación(-OH) • MeGlación-(CH3) • Llevadaacaboporenzimasespecíficas. • Modificanfuncionalidadoestabilidaddelaproteína. 21 Ø Glicosilación: • Unióncovalentedeoligosacáridos(oglicanos)ala cadenalateraldelosaa. • Frecuenteenproteínasdemembranaoalas secretadas. • SellevaacaboenellumendelREydelcomplejode Golgimedianteglicosiltransferasasespecíficas. • Lasreaccionesdeglicosilaciónmáscomunescrean: • O-glicoproteínas. • N-glicoproteínas. 22 O-glicoproteínas:OlisacáridosunidosporOxígenodelas cadenaslateralesdeSeroThr. NaceGlGalactosamina 23 N-glicoproteínas:Oligosacáridosunidospornitrógenoa lacadenalateraldelaaAsparragina(Asp). NaceGlGlucosamina Manosa 24 Laglicosilacióncontribuyea: • Establecerlaconformacióndelaproteína. • Aumentarlaestabilidaddelasproteínasfrenteal calentamientoodigesGónenzimáGca. • Aumentarlahidrófilicidadysolubilidad. • ActúancomodeterminantesanGgénicosdel sistemainmune. 25 LandsteinerwasawardedtheNobelPrizeinPhysiologyorMedicinein1930the discovermentoftheAB=bloodanGgen. 26 Ø Formaciónpuentesdisulfuro: • Entrecruzamientocovalentesentregrupos Gol(SH)deCys. • Llevadaacaboenunareacciónredoxllevadaa caboporladisulfuroisomerasa. • Puedenserintraointercatenarios. • EstabilizanlaestructuranaGvaproteica • Másfrecuentesenproteínassecretadas, protegiéndoladeladesnaturalización. Ejemplo:Insulina 27 Ø Addicióngrupoprosté=co:elcomponenteno aminoacídicoqueformapartedelaestructuradelas heteroproteínasoproteínasconjugadas. GrupoHemo:Implicadoen reaccionesredox. Ejemplo:citocromoc BioGna:Implicadaenla carboxilación Ejemplo:AceGlCoAcarboxilasa 28 MADURACIÓNDELASPROTEÍNAS II)ESCISIÓNPROTEOLÍTICA: RupturaespecíficadeproteínasinacGvaspara acGvarlas. 29 Pre-pro-proteína:pepGdolider+proteínainacGva. Pro-proteína:proteínainacGva(escindidoelpepGdo liderenellumendelRE),seleañaden3puentes disulfuros. Proteínaac=va:formadaenelGolgiyvesículasde secrección,proteasaspro-hormonaconvertasasreGran unpépGdocentral(C)ylascadenasrestantes permanecenunidasporpuentesdisulfuros. MADURACIÓNDELASPROTEÍNAS III)SPLICINGOAYUSTEDEPROTEíNAS: 31 SPLICINGOAYUSTEDEPROTEÍNAS Procesosemejanteconceptualmentealsplicing deARN. Inteína:intrón Exteína:exón Tambiénpresentaseñalesaminoacídicasde empalme: 32 PLEGAMIENTODEPROTEÍNAS • Lahidrofobicidaddelosdiferentesaasonlos principalesresponsablesdelaestructuranaGva delasproteínas:lasmoléculasbuscanla estructuramásestable. • LospolipépGdospequeñospuedenplegarse correctamentedeformaespontánea. • LospolipépGdosgrandesnopuedenhacerlo correctamente.Necesitandeayudade proteínaschaperonasocarabinas. 33 PLEGAMIENTODEPROTEÍNAS PROTEÍNASCHAPERONAS/CARABINAS: • Llamadasdechoquetérmico(HeatShockProtein,HSP), porquesesobre-expresabancuandosesomecaala célulaaunaumentodetemperatura,que desnaturalizabaparcialmenteaproteínasquehabíaque replegar. • ActúanuniéndoseapépGdosnacientesdelribosoma evitandoqueseagreguenmedianteinteracciones hidrofóbicasintermoleculares. • SuacGvidadrequieredegastoenergéGco,que frecuentementeseporporlahidrólisisdelATP. 35 CARABINASHSP70yHSP40: LascarabinasHSP70estabilizanalascadenaspolipepcdicasnacientesprotegiéndolas delaagregaciónyproporcionandounestadoadecuadoparasuplegamiento,perono contribuyenadefiniraestequedependedelassecuenciadesusaa. Algunasproteínasnecesitanlaaccióndevariosgruposdecarabinasporlosque pasansecuencialmenteparaplegarse. Porejemplo:lacarabinaHsp70:ADPpuedecederelpoli-pépGdoqueprotegeaotro grupodecarabinas,lasHsp90,conGnúanpararealizarelcorrectoplegamientodel pépGdo. CARABINASHSP60yHSP10: • HSP60yHSP10consGtuyenunaproteínascarabinaspresentesenmitocondriasy cloroplastosdeeucariotas. • Tienenhómologosenbacterias(GroELyGro-ESrespecGvamente),yenel citoplasmaeucariota. • PresentanunaestructuracaracterísGcaaformadecaja(14subunidadesHsp60)y tapa(7subunidadesdeHsp10). CARABINASHSP60yHSP10: DEGRADACIÓNDEPROTEÍNAS: LasproteínasGenenunavidamediavariable: Ø Vidamedia:2días. Ø Aunquepuedenirdesdelosextremos: • Muylarga:hemoglobina(meses,casitodala vidadeleritrocito). • MuyCorta:segundos(proteínasplieganmal). . 40 DETERMINANTESDELAVIDAMEDIADE LASPROTEÍNAS Lasecuenciadeaaportaciertainformaciónsobrela vidamediadelasproteínas. Ø Extremoaminoterminal: DeunaformagenerallosaaN-terminaldeterminanla vidamediadeunaproteína. GI:Aabásicos Arg,Lys,His VidaProlongada GII:Hidrófobosvolum:Leu,Ile,Trp,Phe,Trp, VidaProlongada GIII:Neutros,Gly,Ala,Val,Ser,Thr,Cys,Met,Pro, VidaCorta 41 DETERMINANTESDELAVIDAMEDIADE LASPROTEÍNAS Ø SecuenciasPEST: • • • • RicasenP,E,S,T:Prolina,Glutámico,Serina,Treonina Determinanunavidacortaalasproteínas. Secuencias12-60aa,nomuydefinidas. Situadasencualquierpartedelaproteína. 42 KFEPTLAYSDDEDDTPELPSPTR 16.4 Table I, PEST sequences known to function as proteolytic signals The sequences of several PEST re- The distribution of PEST sequences gions proteolytic signals Proteinlmown to be Sequence score It can be claimed, onlyPES~FIND half jokingly, are presented in Table I. Clearly, they that PEST sequences are found in all GCN4 KTVLPIPELDDAWESFFSSSTDSTPMFEYENLEDNSK can v a ~ considerably in sequence and interesting cellular proteins. 5.3 They are KEWTSLFDNDIPVTTDDVSLADK 1.7 in length. Secondary structure algo- present in key metabolic enzymes, KAIESTEEVSLVPSNLEVSTTSFLPTPVLEDAK 3.5 tranrithms do not produce a consistent patscription factors, protein kinases, proIKBc~ RIQQQLGQLTLENLQMLPESEDEESYDTESEFTEFTEDEL5.9 tern for PEST regions. For example, the tein phosphatases and cyclins. They PYDDCVFGGQR sequences from GCN4, ornithine decar- are also abundant among proteins that Fos KVEQLSPEEEEK 10.1 boxylase (ODC) KIPDDLGFPEEMSVASLDLTGGLPEVATPESEEAFTand IKBe~ shown in give rise to immunogenic peptides pre5.7 Table I are predictedLPLLNDPEPK to be e~-helical; by sented on MHC I molecules ~ealini, C. GSSSNEPSSDSLSSPTLLAL 4,6 contrast, PEST sequences from CLN2, et al., unpublished). Schimke has Ornithine KEQPGSDDEDESNEQTFMYYVNDGVYGSFNCILYDH 3.7 rapid CLN3 and NIMA score largely as [3-turns. shown that proteins exhibiting decarboxylase HGFPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDR 5.2 The X-ray structures of several PEST- changes in concentration must be positive proteins are available. short-lived 8. The presence of a7,7PEST reCactus KEFAVPNETSDSGFISGPQSSQIFSEEIVPDSEEQDK 10.4 Unfortunately, the KEQPVVLDSGIIDEEEDQEEQEK PEST regions are not gion surely meets this biological reRGAETVTPPDSDYDSSDIEDLDDTK 17.9 resolved, presumably because of their quirement for rapid degradation. Some CLN2 KLTISTPSCSFENSNSTSIPSPASSSQSH conformational flexibility even in the proteins contain multiple PEST7.0regions, crystal state. It seems quite likely the which can be distributed anywhere CLN3 KDSISPPFAFTPTSSSSSPSPFNSPYK 8.2 KTSSSMTTPDSASH 10.6 PEST sequences are solvent-exposed along the polypeptide chain (see Fig. 1). loops based on their They are, however, often present as NIMA or extensions, HSSQMSSSNSEDSDFPSSTDISQLSLESPTNK 12.6 hydrophilic nature.KFEPTLAYSDDEDDTPELPSPTR carboxy-terminal extensions, 16.4 and their GCN4sequences I 1of several 91 I The PEST reThe distribution of PEST sequences gions lmown to be proteolytic signals It can be claimed, only half jokingly, IEB(~ areFos presented in Table I I. Clearly, they that PEST sequences are found in all can v a ~ considerably in sequence and interesting cellular proteins. They are in ODC length. Secondary structure algo-I I present inI I key metabolic enzymes, tranCactus I I a consistent pat- scription factors, I I protein kinases, prorithms do not produce ternCLN2 for PEST regions. For example, the tein 1 phosphatases and t cyclins. They sequences among CLN3 from GCN4, ornithine decar- are also abundant 9 9 I proteins that boxylase (ODC) and IKBe~ shown in give rise to immunogenic peptides preNIMA Table I are predicted I to be e~-helical; by] sented I on MHC I I9 molecules ~ealini, I I I C. contrast, PEST sequences from CLN2, et al., unpublished). Schimke 1O0 200 300 400 500 600 700has CLN3 and NIMA score largely as [3-turns. shown that proteins exhibiting rapid The X-ray structures of several PESTin concentration must be Rgurechanges 1 the photoconverted Pfr730 is degraded with a tl/2 of one hour. Light causes cis-trans isomerization in a linear tetraenrichment at this position is both inpyrrole anchored at significant. Cys321. TheA terestingmoiety and statistically only PEST region the protein 1000-residue few proteins, suchin as phosphytochrome is located phatase inhibitor I and between the yeastamino tranacids 323 and 361. Based on this scriptional regulator GCN4, contain reexmarkable proximity, tensive PEST regions.we have proposed that light absorption exposes the adjacent PEST region, thereby initiating PEST sequences are often conditional degradation 9. Cyclic-AMP-dependent kiproteolytic signals nase provides another possible Some PEST sequences appear examto be ple of conditional PEST signals, regions. for Both constitutive proteolytic exregulatory (R) and catalytic (C) subample, the carboxyl terminus of mouse units cAMP kinase PEST seODC. ofHowever, many contain PEST sequences quences. The half-life of the are conditional signals, and thereR2C are2 tetramer about whereas a numberis of waystentohours, activate them the dissociated R and C subunits are (see Table II). As discussed in a previdegraded a half-life about one ous reviewwith 9, one of the of most striking hour% It seems reasonable to assume examples is provided by the photothat PEST regions are masked In in its thedark asperiod protein, phytochrome. sembled holoenzyme andhas exposed uponof form, Pfr67 o, the protein a half-life cAMP-mediated dissociation. Similar conabout 100 hours; upon light absorption formational unmaskingPfr730 of a isPEST motif the photoconverted degraded might explain the rapid downregulation with a tl/2 of one hour. Light causes of proteinisomerization kinase C uponin phorbol cis-trans a linear ester tetrabinding 9. There are several examples pyrrole moiety anchored at Cys321. The in which the only PESTphosphorylation region in the controls 1000-residue metabolic stability of a protein, it phytochrome is located between and amino seems likely that phosphate addition to acids 323 and 361. Based on this reserines andproximity, threonineswewill prove to be markable have proposed athat widespread mechanism for activating light absorption exposes the adjaacent latentPEST PESTregion, signal. thereby This is discussed initiating further under pathways responsible degradation 9. Cyclic-AMP-dependent for kidegrading PEST another proteins. possible examnase provides ple of conditional PEST regions. Both Support for the regulatory (R)PEST andhypothesis catalytic (C) subThree kinds of evidence can PEST be preunits of cAMP kinase contain sesented in favor of the PEST hypothesis: quences. The half-life of the R2C2 Ejemplo: Elfactordetranscripción GCN4de281aa, presentasecuenciasPEST enelmedio. LavidamediadeGCN4 esde5minutos. Siseeliminalasecuencia PESTlavidamediase incrementadiezveces más. DEGRADACIÓNDEPROTEÍNAS: Ladegradacióncontraladaenlacélulaseda principalmentemediante: I)Degradaciónlisosómica. II)Degradacióncitosólica. 44 I)DEGRADACIÓNLISOSÓMICA: • • Producidaenespaciolisosomal. Lisosomas:vesículasformadasporgemaciónaparGr delGolgi. • GrancanGdaddeenzimasdehidrolíGcas(>50) acGvasapH5(elpropiodelinteriordellisosoma). DeentrelasenzimasdeacGvidadproteasase destacanlascatepsinas. • 45 Puedeintervenir:degradaciónorgánulos,fagocitosis, autofagia,apoptosis,hidrólisisdenutrientes, destruccióndepatógenos,etc. 46 II)DEGRADACIÓNPROTEICA CITOSÓLICA: • Muyespecíficaycontrolada. • LlevadaporproteasasqueactúanapHneutro, destacanlasproteasas: • Calpaínas. • Proteosoma. 47 CALPAÍNAS: • Proteínasdependientesdecalcio. • DesencadenanunaproteólisisneutracitoplasmáGca (noconfundirconcatepsinas,lisosomalesque desencadenanunaproteólisisácida). • Específica,peronoreconocesecuenciasdeaa,sino quesuespecificidadsebasaenestructuraterciaria. 48 PROTEOSOMA Grancomplejodesubunidades proteolíGcasprincipal encargadodeladegradación controladadeproteínas marcadasmedianteUbiquita. 49 UBIQUITINA(=UBICUITINA): • Proteínade76aa,globularyestable. • Esubicuaymuyconservadaeneucariotas. • Seunecovalenteporelprocesode ubiquiGnuaciónaproteínasseñalándolaspara sudegradación. • EstedescubrimientoganóelpremioNobelen químicaen2004. 50 51 PROCESODEUBIQUITINACIÓN: 1) Ac=vacióndelaubiqui=na:laubiquiGnaesacGvadaenunareacciónen elquerequiereellahidrólisisdeATPcomofuentedeenergía,yenlaque setransfieralaubiquiGnaaungrupoGoldeE1. 2)Transferenciadelaubiqui=nadelcentroac=vodelE1aunaenzimaE2de conjugacióndeubiquiGnaatravésdeunareaccióndetrans-Goesterificación. 3)Transferenciadelaubiqui=naalaproteínadiana: • Creaunenlacepepcdicoentreunalisinadelaproteínadianaylaglicina delcarbonoterminaldelaubiquiGna. • MediadaporlaenzimaE3(ubiquicn-ligasas)capacesdeinteraccionar tantoconelE2comoconelsustrato. • SesuelenunirvariasUbiquiGnasaunaproteína(cadenapoli-Ubi)para marcarlaparasudegradación. Procesoestámuyreguladoyescomplejo.Enhumanosexisten: • 2GposdeE1 • 60GposdeE2 • 600-800GposdeE3 52 LaubiquiGnizaciónesunprocesoenzimáGcodemodificaciónproteicaposttraduccional: 53 54 DEGRADACIÓNPROTEOSÓMICA Proteosoma26Socomplejoproteinasa mulGcatalíGco: ConGeneasociado2componentes: *ParFculacentral20S: Formadapor28subunidades(2x7alfa,2x7Beta). Carainteriorposee6núcleosdeacGvidadproteasa. *ParFculaReguladora19S: Uneaunooalos2extremosdelcilindro Formadaporunabaseenformadeanilloformada6 proteínasATPasa,yunatapa. Reconoceespecíficamenteconjugadosproteína-poliUby losintroduceenelcilindro,peroanteslesquitalasUb,que seránrecicladas. 55 EXAMEN Coordinado(fecha)porlaProfesoraAnaLinares. PreguntascorrespondienteamiparteseránGpotesto cortas. EjemplodelGpodepreguntas(aunqueestanoentraríaen nuestrotemario): Cualdeestasafirmacionessobrelaorganizacióndelgenomaescierta: • Elgenomabacterianoseencuentraancladoalamembrana. • ElgenomabacterianointeraccionaconhistonasparaformarlacromaGna. • ElgenomaeucariotaconGeneplásmidos,quecodificaninformación suplementaria. • Losintronesdelasbacteriassongeneralmente5-10vecesmáscortosalosde eucariotas. • Todaslasafirmacionessonfalsas.