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Crecimiento y Cultivo Vegetal
CÉLULAS INMOVILIZADAS
Una estrategia metodológica interesante que se presenta como alternativa al empleo de
células en suspensión es la inmovilización de células vegetales. El primer trabajo reportado en
1966 fue sobre la especie Umbilicaria pustulata y se emplearon geles de poliacrilamida. Toda
la tecnología de inmovilización de células viables se ha desarrollado sobre la base de los
conocimientos existentes de inmovilización de enzimas.
El empleo de células enteras inmovilizadas presenta una serie de ventajas frente a las
enzimas aisladas:
•
Se evita los procesos de aislamiento y purificación enzimática.
•
Las enzimas de interés se hallan en su ambiente celular natural con lo que aumenta su
estabilidad y consecuentemente la vida útil del sistema permitiendo la reutilización del
material catalítico.
•
El ambiente celular provee a las enzimas de los cofactores, coenzimas y demás compuestos
necesarios para asegurar una óptima actividad, además de brindar buenas condiciones de
temperatura y pH.
•
Los sistemas celulares permiten el desarrollo de reacciones multienzimáticas.
Las técnicas de inmovilización pueden clasificarse de acuerdo a las características de la
fase inerte utilizada:
1- Tipo1:
Inmovilización
en
matrices
tridimensionales
inertes.
Implica
el
entrampamiento de las células en geles poliméricos como alginato, agar, agarosa,
carragenanos, poliacrilamida, colágeno o en matrices como redes de nylon y
espuma de poliuretano.
2- Tipo 2: Inmovilización por adsorción inespecífica a soportes inertes como bolillas
de vidrio.
3- Tipo 3: Inmovilización por unión covalente
a soportes inertes como
carboximetilcelulosa.
4- Tipo 4: Inmovilización por confinamiento en biorreactores de fibra hueca.
Dentro de las categorías mencionadas, para células indiferenciadas , las posibilidades de
aplicación de algún sistema se reducen casi específicamente al tipo 1, pues solo un apropiado
Células inmovilizadas
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entrampamiento permite conservar características como viabilidad y capacidad biosintética
que son fundamentales para desarrollar un sistema productivo.
Dentro de esta categoría podemos subdividir a las técnicas de entrampamiento en:
•
Inmovilización en matrices que polimerizan por cross-linking como es el caso mas
ampliamente difundido del alginato de calcio.
•
Inmovilización en matrices que polimerizan por enfriamiento como el agar.
•
Inmovilización en matrices que polimerizan por reacciones de radicales libres como
las de poliacrilamida.
•
Inmovilización en matrices preformadas por entrampamiento pasivo como en
espuma de poliuretano.
Las condiciones básicas que debe reunir un método para ser de elección
en
inmovilización son:
•
Sencillez de preparación
•
Baja toxicidad de la matriz y de los elementos de preparación.
•
Bajo costo.
•
Alta resistencia mecánica.
•
Baja o nula interferencia de la matriz en el proceso down-stream.
El método más difundido es la formación de perlas de alginato. El alginato es un
polisacárido que forma geles muy estables en presencia de cationes polivalentes como Ca++.
Las perlas se forman sencillamente haciendo gotear una solución que contenga alginato de
sodio y las células a inmovilizar sobre una solución de CaCl. El método es reversible y vasta
adicionar un agente quelante de calcio como EDTA que solubiliza el gel por sustracción del
catión. La desventaja es que se deben reformular los medios de cultivos de tal manera de
suprimir el uso de agentes específicos quelantes de calcio como EDTA y además tener en
cuenta que en cultivos prolongados los fosfatos pueden ocasionar la licuación de los geles.
Células inmovilizadas
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Estructura química del alginato de calcio
El κ-carragenano es un heteropolisacárido no tóxico aislado de algas marinas. Esta
compuesto por sulfato de β-D-galactosa y 3,6-anhidro-α-D-galactosa, gelifica por
enfriamiento o en solución con algún agente inductor como K+, NH4+, Ca++, Cu++, Mg++ o
Fe+++, aminas o solventes orgánicos miscibles con agua. Otro método utilizable es la formación
de esferas mediante interacciones iónicas entre sulfato de celulosa y cloruro de
polidimetilalilamonio. La suspensión celular se mezcla con la solución de celulosa y se hace
gotear sobre un baño con cloruro de polidimetilalilamonio dónde tiene lugar la interacción
iónica y la formación de las esferas que entrampan las células.
Células inmovilizadas
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Estructura química del sistema sulfato de celulosa-PDMDAAC
Las matrices que polimerizan por enfriamiento como el agar pueden ser quebradas
mecánicamente y colocadas en una fase líquida hidrófoba. El problema fundamental de los
métodos que utilizan poliacrilamida es la toxicidad de los iniciadores y agentes de
entrecruzamiento utilizados en el proceso de polimerización que en muchos casos han sido
causantes de una baja viabilidad celular.
El entrampamiento en estructuras preformadas consiste en mallas abiertas por
las que se drena el medio de cultivo y las células o los agregados celulares quedan retenidos.
El siguiente esquema simplifica un procedimiento para inmovilizar células o agregados
celulares en perlas de alginato.
Células inmovilizadas
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Inmovilización de células vegetales en biorreactor desde una planta intacta
A continuación
se listan algunos ejemplos de metabolitos de interés comercial
producidos en sistemas de células vegetales inmovilizadas.
Especie
Matriz
Producto
Comentarios
Catharanthus roseus
Agarosa
Catelamina
Suministro de ajmalicina
Catharanthus roseus
Alginato
Alcaloides
Prolonga capacidad
indólicos
biosintética
Ajmalicina
Prolonga
Catharanthus roseus
Alginato
estabilidad
y
capacidad biosintética (220
dias con cambio de medio)
Catharanthus roseus
Xantanos/poliac Serpentina
Prolonga
estabilidad
y
rilamida
capacidad biosintética (180
dias con cambio de medio)
Daucus carota
Alginato
5-β-hidroxidigi-
Suministro de digitoxige-
toxigenina
nina
Daucus carota
Alginato
fenoles
No hay variaciones
Digitalis lanata
Alginato
β-metildigoxina
Suministro de β-metildigitoxina
Digitalis lanata
Alginato
digoxina
Suministro de digitoxina
Mentha sp.
Poliacrilamida
Neomentol
Suministro de mentona
Mentha sp.
Poliacrilamida
isomentona
Suninistro de pulegona
Células inmovilizadas
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Mucuna pruriens
Alginato
L-DOPA
Suministro de L-Tyr
Nicotiana sylvestris
Poliacrilamida
Alcoholes
Suministro de geraniol
monoterpénicos
Nicotiana sp.
Alginato
Putrecina
Prolonga la biosíntesis
Papaver somniferum
Alginato
Codeína
Suministro de codeinona
Amaranthus tricolor
Chitosan
oxalato
Incrementa liberación.
Asclepias syriaca
Chitosan
proteasas
Incrementa liberación.
Beta vulgaris
Nylon
Betacianina
Incrementa acumulación
Capsicum frutescen
Espuma de
Capsaicina
Incrementa rendimiento
poliuretano
Coffea arabiga
Alginato
Metilxantinas
Incrementa la producción
Glycyrrihiza echinata
Alginato
Equinatina
Incrementa producción
Lavandula vera
Alginato
pigmentos
Prolonga capacidad
productiva
Morinda citrifolia
Alginato
Antraquinonas
Incrementa acumulación
intracelular
Talictrum minus
Alginato
Berberina
Incrementa liberación
Solanum surretense
Alginato
Solasodina
Incrementa liberación
fenoles
Incrementa rendimiento.
Lithospermun erithrorhysum Fibra hueca
Tanto la viabilidad, el crecimiento celular y la capacidad biosintética son parámetros a
controlar para asegurar el éxito de un sistema inmovilizado.
•
Viabilidad y crecimiento celular: se pueden emplear diferentes métodos para controlar
la viabilidad de un cultivo inmerso en una matriz inerte que van desde los colorimétricos con
azul de Evans y diacetato de fluoresceína descriptos para suspensiones hasta la medición de
parámetros de crecimiento como consumo de O2 y producción de CO2 con electrodos
selectivos en cultivos no continuos. Existen sofisticados métodos no destructivos como el de
Parr y colaboradores que permite determinar y expresar de manera porcentual el volumen
ocupado por células viables en una matriz de inmovilización. Se basa en la determinación de la
dilución diferencial de dos moléculas marcadas radioactivamente. Una de ellas debe ser
excluida del plasmalema y la otra debe difundir libremente La primera es manitol un
polialcohol no metabolizable marcado con 14C y la otra es agua marcada con 3H. El método
Células inmovilizadas
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determina el "volumen viable" expresado como el espacio porcentual que excluye manitol pero
no agua expresado de otra manera las células viables se sacan de la relación entre el 3H y el
14
C puesto que excluyen al manitol y utilizan el agua. Pueden utilizarse los tradicionales
métodos de peso húmedo y seco puesto que el peso seco correspondiente a la matriz debe de
ser constante. También pueden monitorearse por RMN la cantidad de metabolitos fosforilados
como índice de actividad metabólica, este es un método no invasivo que se basa en cuantificar
la cantidad de ATP o el uptake de fosfatos por medio de 31P-RMN.
De todas formas estos parámetros deben ser interpretados criteriosamente y analizar cada
caso en particular. Por ejemplo Brodelius demostró que Catharanthus roseus y Glycine max
respiran y crecen aproximadamente a la misma velocidad que las células en suspensión cuando
se encuentran inmovilizadas en agarosa o agar pero cuando están confinadas en matrices de
alginato su índice de crecimiento es menor si bien no se afecta la viabilidad. Esto se debe a que
estos tipos de geles afectan en cierta medida la difusión.
•
Capacidad biosintética: Debe ser evaluada específicamente de acuerdo con el propósito
del sistema en particular, ya sea en su capacidad de producir un metabolito determinado por
síntesis de novo, o a partir de precursores sistemas o bien en su actividad enzimática específica
para producir reacciones de bioconversión.
El empleo de células inmovilizadas ofrece una serie de ventajas vinculadas al estado
fisiológico y al diseño y modo de operación del proceso fermentativo.
Relacionado con el primer factor mencionado
hay que considerar
que tanto la
producción como la acumulación de metabolitos secundarios esta están estrechamente
relacionadas con el grado de diferenciación y la organización celular. El entrampamiento en
matrices inertes permite un gran contacto intercelular y la generación de gradientes físicos y
químicos que conducen a un mayor grado de diferenciación. Al estar minimizada la tasa de
reproducción celular la inestabilidad génica que es uno de los principales problemas de los
cultivos dediferenciados se disminuye notablemente. Además la inmovilización permite
alcanzar fases estacionarias prolongadas lo cual es muy importante porque como sabemos la
producción esta asociada a la idiofase o al final de la etapa exponencial. Estos sistemas no
solo permiten desacoplar las fases de crecimiento y producción facilitando el empleo de
estrategias como la elicitación biótica y abiótica o la permeabilización para incrementar la
Células inmovilizadas
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producción
sino
que
también
es
posible
realizar
ciclos
alternantes
de
rejuvenecimiento/crecimiento para mantener la viabilidad y capacidad biosintética.
Con respecto al diseño y manejo del proceso fermentativo podemos puntualizar
que las células inmovilizadas permiten operar en sistemas continuos a altas velocidades de
disolución sin riesgo de lavado de los cultivos. Que es posible controlar el tamaño de los
agregados celulares en caso de ser importante esa variable para la acumulación y/o
producción de metabolitos. Con la biomasa entrampada es más sencillo trabajar con procesos
en dos fases, lo más común es realizar una de crecimiento previo a la inmovilización y la
segunda de producción inmovilizando cuando el cultivo ha llegado a su etapa estacionaria.
En cultivos inmovilizados se facilita la remoción de inhibidores metabólicos y se protege a las
paredes celulares de las fuerzas de corte. Como consecuencia de todas las características
mencionadas es posible lograr sistemas de producción de metabolitos de una vida útil
prolongada puesto que se puede reutilizar la biomasa y realizar una recuperación continua de
los productos.
Si bien es posible en sistemas inmovilizados inducir la liberación al medio extracelular
los metabolitos de interés que naturalmente no son excretados mediante el empleo de agentes
permeantes, especialmente DMSO, generalmente el empleo de estos sistemas se encuentra
limitados a la producción de
compuestos secundarios y la realización de procesos de
bioconversión dónde los productos de interés se liberen al medio de cultivo.
Células inmovilizadas