inmovilización Una estrategia i metodológica d l i i interesante que se presenta como alternativa al empleo de células en suspensión es la inmovilización de células vegetales. vegetales e trabajo b jo reportado epo do een 1966 9 fue ue sob sobree la El pprimer especie Umbilicaria pustulata y se emplearon geles de poliacrilamida. Toda la tecnología de inmovilización de células viables i bl se ha h desarrollado d ll d sobre b la l base b d los de l conocimientos existentes de inmovilización de enzimas. enzimas El empleo de células enteras inmovilizadas presenta una serie de ventajas frente a las enzimas aisladas: •Se evita los procesos de aislamiento y purificación enzimática. enzimática •Las enzimas de interés se hallan en su ambiente celular natural t l con lo l que aumenta t su estabilidad t bilid d y consecuentemente t t la vida útil del sistema permitiendo la reutilización del material catalítico. •El ambiente celular provee a las enzimas de los cofactores, coenzimas y demás compuestos necesarios para asegurar una óptima actividad, además de brindar buenas condiciones de temperatura y pH. •Los sistemas celulares permiten el desarrollo de reacciones multienzimáticas. Inmovilización celular •Condiciones básicas que debe reunir un método • Sencillez de preparación • Baja toxicidad de la matriz y de los elementos de preparación • Bajo costo • Alta resistencia mecánica • Baja o nula interferencia en los procesos de purificación de productos • Posibilidad de alternar ciclos de crecimiento y ciclos de producción y/o biotransformación Inmovilización celular Por adsorción •Adsorción a soportes inertes Por entrampamiento •Inclusión en estructuras preformadas •Entrampamiento Entrampamiento en matrices poliméricas Inmovilización celular •Adsorción a soportes inertes •Bolillas de vidrio • Virutas de madera, etc •Inclusión en estructuras preformadas •Biorreactores de fibra hueca • Espumas de poliuretano •Membranas M b dde nylon l Inmovilización celular •Entrampamiento en matrices poliméricas • Matrices que polimerizan por reacciones de radicales libres (Geles de poliacrilamida) • Matrices M i que polimerizan li i por enfriamiento fi i (Agar) (A ) • Matrices que polimerizan por cross-linking (Alginato, Carragenanos, Celulosas, etc) Las matrices que polimerizan por enfriamiento como el agar pueden ser quebradas mecánicamente y colocadas en una fase líquida hidrófoba. El problema fundamental de los métodos que utilizan poliacrilamida es la toxicidad de los iniciadores y agentes de entrecruzamiento utilizados ili d en ell proceso de d polimerización li i i que en muchos casos han sido causantes de una b j viabilidad baja i bilid d celular. l l El κ-carragenano •Heteropolisacárido H t li á id no tóxico tó i aislado i l d de d algas l marinas. •Esta compuesto por sulfato de β-D-galactosa y 3,6anhidro-α-D-galactosa g •Gelifica por enfriamiento o en solución con algún agente inductor i d como K+, NH4+, Ca++, Cu++, Mg++ o Fe+++, aminas o solventes orgánicos miscibles con agua. agua Inmovilización celular: en esferas de celulosa-polidimetilpirrolidilamonio p p Sulfato de celulosa Cloruro de polidimetilpirrolidilamonio -O4SO O O O O O N + OSO4- n n -O4SO -O4SO -O4SO O O O O O O O OSO4- N N N N N O O O O OSO4- O O OSO4- OSO4- N N N N -O4SO O O O N N -O4SO O O N N N -O4SO O O O O O O O O OSO4- OSO4- Inmovilización celular: en esferas alginato Alginato (Acido manurónico β 1,4) OH + O O O O C Cl2 CaCl O O O OH n Ca Ca O- O- O O O O O O O O O O O O- O- Ca Ca O- O- O O O O O O O O O O O O O O O O- Ca O- Ca Inmovilización celular: Metodología de trabajo Mezcla de solución de alginato Y cultivo celular en medio libre De agentes complejantes de Ca++ Solución de Ca++ Ca La captación pasiva de los sustratos no polares limita la cinética de conversión La penetración al interior celular debe de ocurrir en la escala de tiempo de la bioconversión El transporte p no deben controlar la velocidad gglobal del p proceso si se quiere analizar reactividades de una serie de compuestos La degradación de los productos es más rápida cuando se forman en la etapa de crecimiento que en fase estacionaria Algunos ejemplos de metabolitos de interés comercial pproducidos en sistemas de células vegetales g inmovilizadas Especie Matriz Producto Comentarios Catharanthus roseus Agarosa Catelamina Suministro ajmalicina Catharanthus roseus Alginato Alcaloides indólicos Prolonga capacidad biosintética Catharanthus roseus Alginato Ajmalicina Prolonga estabilidad y capacidad biosintética (220 dias con cambio d medio) de di ) Catharanthus roseus Xantanos/po Serpentina liacrilamida Prolonga estabilidad y capacidad biosintética (180 dias con cambio de medio) de Algunos ejemplos de metabolitos de interés comercial pproducidos en sistemas de células vegetales g inmovilizadas Especie Matriz Producto Daucus carota Alginato g 5-β-hidroxidigiβ g toxigenina Daucus carota Alginato fenoles Comentarios Suministro de digitoxigenina No hay variaciones Algunos ejemplos de metabolitos de interés comercial pproducidos en sistemas de células vegetales g inmovilizadas Especie Matriz Producto Comentarios Digitalis lanata Alginato β βmetildigoxina Suministro de β β-metildimetildi gitoxina Di it li lanata Digitalis l t Al i t Alginato di digoxina i Suministro S i it digitoxina d de Algunos ejemplos de metabolitos de interés comercial pproducidos en sistemas de células vegetales g inmovilizadas Especie Matriz Producto Beta vulgaris Nylon Capsicum frutescen Espuma de Capsaicina poliuretano Betacianina Comentarios Incrementa acumulación Incrementa rendimiento Algunos ejemplos de metabolitos de interés comercial pproducidos en sistemas de células vegetales g inmovilizadas Solanum Especie Matriz Producto Comentarios Morinda citrifolia Alginato Antraquinonas Incrementa acumulación intracelular Talictrum minus Alginato Berberina Incrementa liberación S l Solanum surretense t Alginato Solasodina Incrementa liberación Lithospermun erithrorhysum Fibra hueca fenoles Incrementa rendimiento. Métodos para inmovilizar por entrampamiento Parámetros a controlar en un sistema inmovilizado: viabilidad crecimiento celular capacidad biosintética Métodos para evaluar la viabilidad de un cultivo inmerso en una matriz inerte •Colorimétricos: C l i ét i azull de d Evans E y diacetato di t t de d fluoresceína •Medición de parámetros de crecimiento como consumo de O2 y producción p de CO2 con electrodos selectivos en cultivos no continuos. •Métodos é d no destructivos d i (Parr ( et al.) l ) que permite i determinar y expresar de manera porcentual el volumen ocupado por células viables en una matriz de inmovilización. Se basa en la determinación de la dilución diferencial de dos moléculas marcadas radioactivamente. Una de ellas debe ser excluida del plasmalema y la otra debe difundir libremente La primera es manitol u otro polialcohol no metabolizable marcado con 14C y la otra es agua marcada con 3H. El método determina el "volumen viable" expresado como el espacio porcentual que excluye manitol pero no agua expresado de otra manera las células viables se sacan de la relación entre el 3H y el 14C puesto que excluyen al manitol y utilizan el g agua. También ppueden monitorearse ppor RMN la cantidad de metabolitos fosforilados como índice de actividad metabólica este es un método no invasivo que se basa en cuantificar tifi l cantidad la tid d de d ATP o ell uptake t k de d fosfatos por medio de 31P-RMN. Capacidad biosintética: Debe ser evaluada específicamente de acuerdo con el propósito del sistema en particular ya sea en su capacidad de producir un metabolito determinado por síntesis de novo, o a partir de precursores sistemas o bien en su actividad enzimática específica para producir d i reacciones i d bioconversión. de bi ió El empleo de células inmovilizadas ofrece una serie de ventajas vinculadas al estado fisiológico g y al diseño y modo de operación p del proceso fermentativo. •El entrampamiento en matrices inertes permite un gran contacto intercelular y la generación de gradientes físicos y químicos que conducen a un mayor grado de diferenciación. •Al estar minimizada la tasa de reproducción celular la inestabilidad génica se disminuye notablemente. •Se alcanzan fases estacionarias prolongadas lo cual es muy importante cuando d la l producción d ió esta t asociada i d a la l idiofase idi f o all final fi l de d la l etapa t exponencial •Estos sistemas permiten desacoplar las fases de crecimiento y pproducción facilitando el empleo p de estrategias g como la elicitación biótica y abiótica o la permeabilización para incrementar la producción • Es posible realizar ciclos alternantes de rejuvenecimiento/crecimiento para mantener la viabilidad y capacidad biosintética. •las células inmovilizadas permiten operar en sistemas continuos a altas velocidades de disolución sin riesgo de lavado de los cultivos •Es posible controlar el tamaño de los agregados celulares en caso de ser importante esa variable para la acumulación y/o producción de metabolitos. •Con la biomasa entrampada es más sencillo trabajar con procesos en dos fases,, lo más común es realizar una de crecimiento pprevio a la inmovilización y la segunda de producción inmovilizando cuando el cultivo ha llegado a su etapa estacionaria. •En cultivos inmovilizados se facilita la remoción de inhibidores metabólicos •se protege a las paredes celulares de las fuerzas de corte Con inmovilización es posible lograr: sistemas de producción de metabolitos t b lit de d una vida id útil prolongada l d puesto t que se puede d reutilizar la biomasa y realizar una recuperación continua de los productos. Es posible inducir la liberación al medio extracelular los metabolitos de interés que naturalmente no son excretados mediante el empleo de agentes permeantes, especialmente DMSO El empleo de estos sistemas se encuentra limitado a la producción de compuestos secundarios y la realización de procesos de bioconversión dónde los productos de interés se liberen al medio de cultivo.