XII JORNADAS DE INVESTIGACIÓN Revista Investigación Científica, Vol. 4, No. 2, Nueva época. Mayo - Agosto 2008 ISSN 1870-8196 Transformación genética de Solanum cardiophyllum mediada por Agrobacterium rhizogenes Ana María Reyes Contreras Leticia Almanza Sánchez José C. Sánchez Pérez Miguel Alvarado Rodríoguez Unidad Académica de Agronomía Universidad Autónoma de Zacatecas Saúl Fraire Velázquez Unidad Académica de Biología Experimental Universidad Autónoma de Zacatecas Resumen Para contribuir a al preservación y al mejoramiento genético de la papita de campo, se desarrolló una metodología de micropropagación y transformación genética vía Agrobacterium rhizogenes. Se utilizó el medio de cultivo MurashigeSkoog con diversas concentraciones de la auxina AIA (0-0.4 mg/l), de la citocinina BA (0-4.0 mg/l) y del ácido giberélico AG3 (0-1.0 mg/l) y un incremento del 10% en las sales de nitrógeno, para establecer el sistema de regeneración in vitro; las plántulas obtenidas se subcultivaron para establecer la tasa de multiplicación y evaluar el mejor balance hormonal para su micropropagación. Para la transformación genética se utilizó la cepa bacteriana A4 de Agrobacterium rhizogenes, que contiene el plásmido silvestre pRiA4 y además el vector binario pESC4. Se cocultivó a concentraciones de 107, 108 y 109 bacterias/ml con segmentos nodales de plántulas micropropagadas. Se realizaron de manera exitosa las pruebas histológica (GUS) y de Biología Molecular (PCR) para comprobar la incorporación de transgenes. En esta última prueba se identificaron un segmento de 780 pb del gen rol B del plásmido silvestre y un segmento de 517 pb del gen nptII del vector binario. Palabras claves: cardiophyllum, micropropagación, Agrobacterium 1 XII JORNADAS DE INVESTIGACIÓN Revista Investigación Científica, Vol. 4, No. 2, Nueva época. Mayo - Agosto 2008 ISSN 1870-8196 Introducción La transformación genética en plantas, es un proceso por el cual el ADN exógeno y de interés, es introducido al núcleo de las células vegetales que pueden ser parte de un explante en un cultivo morfogénico o protoplasto y una vez que el ADN es introducido mediante una serie de procedimientos, se regenera una planta completa transformada genéticamente, partiendo de dichas células transformadas (van der Salm et al., 1996). Existen varios métodos para incorporar genes exógenos al genoma de las células vegetales y uno de los más utilizados es mediante Agrobacterium rhizogenes (Tzfira, 2008). La técnica requiere el desarrollo previo de una metodología de regeneración in vitro de la especie vegetal que se desee transformar genéticamente (Pérez et.al., 1999). Entre las especies no cultivadas en peligro de extinción se encuentran las papas silvestres, consideradas entre las primeras plantas utilizadas como alimento por los antiguos pobladores de América (Ugent, 1987) aunque, actualmente el uso de implementos de labranza modernos, provocan abatimiento de las poblaciones de estas especies arvenses (Davis y Bye, 1982), siendo las más afectadas en el altiplano Potosino-Zacatecano Solanum cardiophyllum y S. ehrenbergii. Estas especies silvestres muestran cualidades que las distinguen de otras especies de papas, tales como la resistencia a condiciones de baja humedad y un alto valor nutrimental, pues contiene 3.2% de proteína, alta riqueza en carbohidratos y vitamina C, además de una gran resistencia a la agresividad de patógenos como Phytophtora infestans y Alternaria solani (Galindo, 1982). Las especies arvenses S. brachistotricum, S. cardiophyllum Lindley subesp. Ehrenbergii Bitter resisten el ataque a todos los virus que afectan a las variedades de S. tuberosum, por lo que son una fuente potencial de germoplasma para programas de fitomejoramiento de papa cultivada (Luna-Cabazos et al, 2007). 2 XII JORNADAS DE INVESTIGACIÓN Revista Investigación Científica, Vol. 4, No. 2, Nueva época. Mayo - Agosto 2008 ISSN 1870-8196 Objetivos Desarrollar una metodología para transformar genéticamente la papa de campo Solanum cardiophyllum vía Agrobacterium rhizogenes. Para lograr lo anterior, los objetivos particulares planteados son los siguientes: • Determinar un balance de reguladores del crecimiento vegetal para establecer, inducir brotación múltiple y enraizar in vitro la papa de campo. • Desarrollar una metodología para transferir genes exógenos al genoma de la papa de campo a través de Agrobacterium rhizogenes. • Realizar pruebas histoquímicas y de Biología Molecular para comprobar la transformación genética. Materiales y métodos La investigación se realizó entre marzo de 2006 y abril de 2008 en el laboratorio de Cultivo de Tejidos en la Unidad Académica de Agronomía y en el Departamento de Biología Molecular de Plantas de la Unidad Académica de Biología Experimental, ambos pertenecientes a la Universidad Autónoma de Zacatecas. Se utilizaron papitas de monte provenientes del municipio de Pinos, Zac, haciendo una selección previa de las que se encontraron en mejor estado físico, de color claro y superficie regular. Se empleó la bacteriana A4 de A. rhizogenes, la cual es del tipo agropina. Esta bacteria contiene el plásmido silvestre pRiA4 y el vector binario pESC4. Los tubérculos se lavaron en agua corriente con detergente y cepillo de fibras suaves. Se secaron, posteriormente se les dio un baño en una solución de NitrasanD al 2% y con 300 mg/l de AG3 durante una hora y se secaron al medio ambiente. Luego se colocaron en frascos cerrados y se mantuvieron a 4°C hasta que se 3 XII JORNADAS DE INVESTIGACIÓN Revista Investigación Científica, Vol. 4, No. 2, Nueva época. Mayo - Agosto 2008 ISSN 1870-8196 observó la aparición de yemas en los tubérculos, aproximadamente a las dos semanas. Los tubérculos se colocaron en una solución de Nitrasan-D al 1%, en agitación continua durante 1 h, luego se enjuagaron con agua destilada estéril. Posteriormente se repitió el mismo procedimiento pero en una solución de kanamicina al 0.2 %. Durante este proceso, cada 5 min se dio un pulso de 1 min de vacío. Se aislaron las yemas y a continuación se lavaron con detergente y agua corriente, utilizando un cepillo de cerdas suaves. Posteriormente se llevaron a condiciones de asepsia, bajo campana de flujo laminar, para esterilizar externamente las yemas en una solución de alcohol etílico al 70% durante un minuto, enjuagándolas tres veces con agua destilada estéril, a continuación se colocaron en una solución acuosa de hipoclorito de sodio comercial al 10% (V/V) durante 30 minutos, y finalmente se enjuagaron 4 veces con agua destilada estéril. Se eliminaron las partes dañadas por los agentes desinfectantes, obteniéndose yemas de aproximadamente 4 mm, las que se inocularon en frascos tipo gerber con el medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) sin reguladores del crecimiento vegetal, con 30 g/l de sacarosa y gelificado con 7.5 gr/l de Agar, los que previamente se esterilizaron en autoclave a 121ºC durante 15 min. Se colocó un explante por frasco con 30 ml de medio de cultivo. A las seis semanas, las yemas que tuvieron una respuesta favorable se subcultivaron en el medio MS suplementado con las combinaciones de BA y AIB a concentraciones de 0-4 mg/l y 0-0.4 mg/l respectivamente, con el fin de inducir brotación múltiple en los explantes. Con el propósito de obtener brotes más vigorosos para llevar a cabo el enraizamiento de plántulas y el proceso de transformación genética, se sembraron segmentos nodales de los multiplicados en el paso anterior, en el medio de cultivo MS, suplementado con diversas concentraciones de 0 y 100 mg/l de glutamina, y de 0 y 1 mg/l de AG3 y 10% más de las sales de nitrógeno del medio MS. A las seis semanas se realizó la evaluación. 4 XII JORNADAS DE INVESTIGACIÓN Revista Investigación Científica, Vol. 4, No. 2, Nueva época. Mayo - Agosto 2008 ISSN 1870-8196 Para el cocultivo (papita-bacteria) se seleccionaron brotes de aproximadamente 4 cm de longitud. La bacteria se sembró en el medio YMA (sólido), se cultivó durante 48 h a 28ºC, para multiplicarla. Luego ésta sembró en el medio YMB (líquido), el que se mantuvo en agitación a 120 rpm, a una temperatura de 28°C durante 48-56 h. hasta que alcanzó una concentración igual o ligeramente mayor de 1x109 bacterias/ml. La concentración se determinó a partir de la absorbancia del cultivo bacteriano a una longitud de onda de 620 nm en un espectrofotómetro (Jofre-Garfias et al, 1997). Se realizaron diluciones para obtener concentraciones de 1x108 y 1x107 bacterias/ml. Los brotes se colocaron durante 5 minutos en el medio líquido bacteriano con las tres diferentes concentraciones, realizando tres perforaciones con una aguja de jeringa a cada explante. A las 72 h se enjuagaron los explantes en agua destilada estéril, se secaron en papel filtro estéril y, se colocaron en el medio de cultivo MS suplementado con 300, 500 y 1,000 mg/l del antibiótico cefotaxima, para eliminar las bacterianas. En este medio los explantes permanecieron durante 72 h, posteriormente éstos se transfirieron al medio de cultivo MS sin antibióticos y sin reguladores del crecimiento, donde permanecieron 4 semanas a una temperatura de 24ºC y un fotoperiodo de 16 h de luz por 8 de oscuridad. La transformación genética de las plántulas inoculadas, se determinó mediante tres formas: Fenotipo.- Se comparó el fenotipo de los explantes inoculados con A. rhizogenes y los explantes usados como control negativo Prueba de GUS (Prueba histoquímica). El vector binario transfiere la región GUS (gen uid A), que es un gen reportero, que sintetiza la enzima ß-Glucoronidasa, por lo que se tomó una muestra de raíces axénicas de cada una de las plántulas. Se pusieron en contacto con el reactivo X-Gluc, el cual contiene el sustrato de la mencionada enzima. Se incubaron segmentos de las raíces adventicias a 37°C durante 48 h de cada una de las plántulas. 5 XII JORNADAS DE INVESTIGACIÓN Revista Investigación Científica, Vol. 4, No. 2, Nueva época. Mayo - Agosto 2008 ISSN 1870-8196 Análisis molecular Se realizó la extracción del ADN de las raíces pilosas obtenidas en el cocultivo, empleando el método llamado CTAB (Doyle and Doyle, 1987). Para realizar esta prueba se adicionó a cada muestra de ADN a amplificar: Agua desionizada estéril Buffer TAE Desoxinucleótido 15.75 μl 2.50 μl 2.00 μl Primers up 1.25 μl para rolB y 1.25 μl para nptII Primers low 1.25 μl para rolB y 1.25 μl para nptII Templado ADN 1.00 μl Taq ADN polimerasa 2.50 μl Para la amplificación se programaron 30 ciclos bajo las siguientes condiciones: • Desnaturalización del templado a 94 °C 1 minuto • Alineamiento de primers a 55 °C por 2 minutos • Extensión de la cadena a 72°C por 3 minutos Los productos de la amplificación se analizaron en un gel de agarosa al 1.2% cargando de 5-10 μl del producto de PCR. Resultados Regeneración in vitro El tratamiento previo a la desinfección superficial permitió realizar una esterilización más eficiente. Durante la etapa de establecimiento hubo una respuesta del 15.6%, solamente el 1 % se contaminó con bacterias, y el resto no tuvo respuesta. Las plántulas generadas en la etapa de establecimiento, se segmentaron para aislar los entrenudos, desechando la parte basal y apical. Las yemas se transfirieron a los medios de cultivo con diversas concentraciones de BA y AIB. Luego de seis 6 XII JORNADAS DE INVESTIGACIÓN Revista Investigación Científica, Vol. 4, No. 2, Nueva época. Mayo - Agosto 2008 ISSN 1870-8196 semanas los explantes presentaron un crecimiento de aproximadamente de 5 cm, con diversas cantidades de brotes adventicios. El mejor resultado que se obtuvo, estadísticamente, fue en el medio de cultivo suplementado con 4 mg/l de BA y 0.4 mg/l de AIB, el cual generó un promedio de 4.7 brotes por explante. En el tratamiento control no hubo la aparición de brotes adventicios; en los tratamientos que tuvieron AIB sin la citocinina se generaron callos en la parte basal, sin brotes adventicios. En el resto de los tratamientos se generaron brotes pero en menores cantidades que el primer tratamiento señalado. Por lo que en lo sucesivo este tratamiento fue el que se usó para la micropropagación de la papita de campo, obteniéndose resultados similares en los siguientes subcultivos. Se obtuvieron brotes más vigorosos luego de tres subcultivos, en el medio suplementado con 3 mg/l de BA con 100 mg/l de glutamina. Los tratamiento con AG3 produjeron explantes muy elongados y sin vigor. El uso de un 10% más de sales de nitrógeno tampoco indujo brotes más vigorosos. Los medios de cultivo sin reguladores del crecimiento vegetal (control), 1 mg/l de AIB sin BA y 2 mg/l AIB también sin BA, generaron sistemas radiculares abundantes y en los tres casos de una manera similar. En el resto de los tratamientos se produjeron raíces en menor cantidad y más pequeñas, excepto en el tratamiento con 3 mg/l sin BA, donde se generó un callo en la parte basal de los explantes. Se determinó la capacidad de aclimatación de 100 plántulas vigorosas con un sistema radicular desarrollado, de aproximadamente 8 cm de largo. Se logró concluir la etapa de aclimatación de manera favorable, en 83 plantas, luego de dos semanas. Inoculación de explantes y producción de raíces pilosas Las concentraciones bacterianas 108 y 109 bacterias/ml indujeron la generación de raíces pilosas abundantes en un 95% de los expantes, mientras que las raíces pilosas generadas usando el cultivo bacteriano de 107, fueron escasas y pequeñas. En el tratamiento 109 bacterias/ml se apreciaron raíces más largas y 7 XII JORNADAS DE INVESTIGACIÓN Revista Investigación Científica, Vol. 4, No. 2, Nueva época. Mayo - Agosto 2008 ISSN 1870-8196 más abundantes. La eliminación de bacterias de los explantes se logró en su totalidad en los medios de cultivo que se prepararon con 1,000 mg/l del antibiótico cefotaxima, mientras que en las concentraciones menores, la bacteria se apreció a las cuatro semanas después de que los explantes se subcultivaron en medios sin antibiótico. Prueba histoquímica Se analizaron 38 muestras, de las cuales 35 resultaron positivas a la prueba de GUS. Todas las raíces que fueron analizadas se mantuvieron en incubación bajo luz continua, siendo esta condición importante ya que el promotor Cab del vector binario pESC4 que controla al gen uidA, es inducible por luz. Las 3 muestras negativas a la prueba de GUS pero que presentaron un alto contenido de raíces pilosas, puede indicar que no fue transferido el gen reportero uid A que sintetiza la enzima ß-Glucoronidasa, sin embargo, es posible que el gen rol B del plásmido de RiA4 fue incorporado al genoma del tejido de la papa de campo. Las raíces tomadas de plántulas axénicas no inoculadas con la bacteria no mostraron actividad de GUS. Prueba molecular mediante PCR Al finalizar el proceso de amplificación del gen de interés, los productos obtenidos se analizaron en un gel de agarosa al 1.2% cargando de 5-10 μl del producto de PCR. En la primera cavidad del gel se colocó 1 μl del marcador de peso molecular conocido de 200, 400, 600, 800, 1000, 2000. 4000 pB. En la segunda y quinta cavidades, se colocó 1 μl del amplificado de la PCR. En la sexta se colocó el mismo volumen, pero de ADN genómico de la muestra biológica no sometida a PCR. El tercer y cuarto pozos no se utilizaron. 8 XII JORNADAS DE INVESTIGACIÓN Revista Investigación Científica, Vol. 4, No. 2, Nueva época. Mayo - Agosto 2008 ISSN 1870-8196 Posteriormente de corrido el gel, se fotografió y se pudieron observar las bandas correspondientes al marcador de peso molecular, así como la presencia de las bandas correspondientes a los segmentos de los genes rol B y nptII de 780 y 517 pB respectivamente. La presencia de estas bandas, junto con las pruebas anteriores, son evidencias irrefutables de la incorporación de transgenes a las células de la papita de campo por parte de Agrobacterium rhizogenes. Conclusiones 1. Se estableció un sistema eficiente de regeneración in vitro de la papita de campo. 2. Se demostró que Solanum cardiophyllum es susceptible de ser transformada genéticamente por medio de Agrobacterium rhizogenes. 9 XII JORNADAS DE INVESTIGACIÓN Revista Investigación Científica, Vol. 4, No. 2, Nueva época. Mayo - Agosto 2008 ISSN 1870-8196 Bibliografía Davis, T. Y R.A. Bye, Jr. 1982. Ethno botany and progressive domestication of sollanum cardiophyllum L. y Sollanum ehrenbergii; in México and Central America. Econ. Bot. 36(2) 225-241. Doyle, J.J. and J.L. Doyle, 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemistry Bulletin 19:11–15. Galindo,J. 1982 La papita güera: Naturaleza 13(3) : 175-180 Jofre-Garfias, A. E., Villegas-Sepúlveda, N., Cabrera-Ponce, J.L., Adame-Álvarez, R. M., Herrera-Estrella, L., Simpson, J. 1997. 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