Recuento de plaquetas en sangre entera

Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia
Universidad Nacional de Tucumán
GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS
Nº 10
Pruebas básicas y especiales para el
estudio de las plaquetas y sistema
fibrinolítico
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PRUEBAS GLOBALES PARA EL ESTUDIO DE PLAQUETAS
Introducción: El estudio de las plaquetas en el laboratorio requiere extremos
cuidados con respecto a la toma de muestra y anamnesis del paciente,
teniendo en cuenta la principal característica de las plaquetas que es su gran
capacidad de activarse y adherirse. Otro aspecto muy importante a tener en
cuenta es que las plaquetas son fragmentos del citoplasma de megacariocitos
y al carecer de núcleo son incapaces de sintetizar proteínas, por lo cual una
medicación que afecte la funcionalidad la plaqueta no podrá repararla.
1- RECUENTO DE PLAQUETAS EN SANGRE ENTERA
1.a)- Método Manual
Fundamento: La sangre entera se mezcla con una sustancia que lisa los
glóbulos rojos dejando intactas las plaquetas.
Reactivos
EDTA disódico al 2%
Oxalato de amonio 0,1 N 0 al 1%
Obtención de la muestra: Se extrae sangre por punción venosa usando
material de plástico y EDTA como anticoagulante. El EDTA debe usarse en una
concentración aproximada de 2 mg por mL de sangre ya que a concentraciones
mayores las plaquetas tienden a hincharse y romperse y a concentraciones
menores no se evita su apelotonamiento.
Procedimiento:
Se diluye la sangre con la solución de oxalato de amonio al 1%, recientemente
filtrada, en una proporción de 1:20. Se deja reposar 10 minutos para permitir la
lisis de los glóbulos rojos, y posteriormente, se homogeneiza y se carga la
cámara de Neubauer. Se deja reposar la cámara en ambiente húmedo durante
10 minutos para que las plaquetas sedimenten. Se realiza el recuento de
plaquetas en el retículo central (se cuentan los cuatro cuadrados de las
esquinas y uno del centro).
Cálculo:
N x 400 x 20 x 10 = número de plaquetas por µL
80
N = nº de plaquetas contadas en los cinco cuadrados
400 = nº total de cuadrados pequeños de la cámara
80 = nº de cuadrados pequeños contados
20 = inversa de la dilución
10 = se multiplica por 10 para expresar el resultado en nº de plaquetas por
mm3 (µL)
Valores de referencia: 150.000 a 400.000/ µL
150 a 400 109/litro (SI)
1-b) Método automatizado:
Se emplean contadores hematológicos donde el recuento plaquetario forma
parte del perfil celular sanguíneo.
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Independientemente del método de recuento empleado, es importante observar
al microscopio un frotis de sangre periférica, para evaluar cantidad, distribución,
forma y tamaño plaquetario. Asimismo la observación del mismo permitirá
dilucidar una trombocitopenia producida como consecuencia de acúmulos
plaquetarios.
Trombocitopenia inducida por EDTA: Algunos pacientes presentan en su
plasma un anticuerpo que reacciona con un criptoantígeno en presencia de
EDTA. Este criptoantígeno se encuentra en la GP IIb-IIIa, lo que lleva a la
aglutinación in vitro de las plaquetas con la consiguiente disminución en el
recuento de plaquetas en la muestra obtenida con EDTA. Este descenso no se
correlaciona con la cantidad de plaquetas presentes in vivo ni con la
observación del frotis sanguíneo. En estos casos el recuento de plaquetas se
debe realizar en muestras obtenidas con otros anticoagulantes como citrato o
heparina.
2-TIEMPO DE SANGRÍA
Es una prueba que permite estudiar la forma en que se realiza la hemostasia
espontánea de pequeñas heridas. Cuando se produce la injuria tisular se
exponen componentes del subendotelio, como el colágeno tipo IV y V, a los
cuales se adhieren las plaquetas.
El tiempo de sangría (TS) se modifica fundamentalmente por la cantidad y
calidad de las plaquetas así como también por muy bajas concentraciones de
proteínas plasmáticas como el fibrinógeno y disminución de von Willebrand.
Podemos tener alterado el TS en trombocitopatías congénitas (Bernard Soulier,
Trombostenia de Glazman, Síndrome de Pool de Depósito) o trombocipatías
adquiridas (uremia, en presencia de paraproteínas, afibrinogenemias),
síndromes mielodisplásicos, trombocitemia esencial).
2.a) Método de Duke
Fundamento: Consiste en medir el tiempo de duración de una hemorragia
provocada por una incisión realizada en el lóbulo de la oreja.
Procedimiento
Se desinfecta el lóbulo de la oreja y se practica en su borde inferior, con una
lanceta afilada, una incisión en sentido vertical. El corte debe ser suficiente
profundo (3 a 4 mm) para que la sangre fluya espontáneamente sin ejercer
presión. Cada 30 segundos se recogen las gotas de sangre sobre un papel de
filtro, sin tocar el borde de la incisión. Cuando la sangre fluye con mayor
rapidez se debe recoger con intervalos de tiempo menores. Se mide con
cronómetro el tiempo que transcurre entre la primera y última gota.
Valores de referencia: 1 a 4 minutos
Este método tiene la desventaja de su escasa sensibilidad.
2.b) Método de Ivy
Fundamento: Es la medida del tiempo de sangría en tres puntos del antebrazo
bajo presión continua.
Procedimiento
Se coloca en el brazo del paciente, por encima del codo, el brazal de un
aparato de presión (esfigmomanómetro) manteniendo una presión constante de
3
40 mm de mercurio durante toda la prueba (a fin de llenar los capilares y
eliminar la variabilidad del tono capilar).
Se desinfecta con alcohol y se hacen tres punciones separadas, de 3 mm de
profundidad, en una zona del antebrazo en la cual no existan venas visibles.
Simultáneamente se pone en marcha el cronómetro y sin tocar los bordes de la
incisión se recoge cada 30 segundos la gota de cada herida, mediante un papel
de filtro, hasta que las punciones dejen de sangrar. El promedio de los tiempos
obtenidos, es el tiempo de sangría.
Valores de referencia: 2 a 7 minutos
Es más sensible que el método de Duke.
2.c) Método de Mielke y colaboradores
El fundamento y procedimiento es igual al método de Ivy. La modificación
consiste en practicar un corte de 1 cm de longitud por 1 mm de profundidad
usando hojas de bisturí calibradas.
Valores de referencia: 2 a 9 minutos
2.d) Método de Template ó de Mielke modificado
El fundamento y procedimiento es igual al anterior pero el corte se realiza
empleando con dispositivos comerciales (Template).
3. FRAGILIDAD CAPILAR
Las petequias o equimosis se forman por la extravasación indiscriminada de
células sanguíneas fuera de la vasculatura capilar hacia la piel, tejido
subcutáneo o ambos.
En esta prueba intervienen la cantidad y funcionalidad plaquetaria; la calidad
del vaso y sus tejidos adyacentes y el gradiente de presión transmural que
produce la extravasación sanguínea.
Se encuentra alterada en trombocitopenias, trombocitopatías, púrpuras
vasculares, disproteinemias, Síndrome de Ehlers-Danlos, déficit de vitamina C,
etc.
Para determinar la fragilidad capilar existen dos tipos de métodos: a) métodos
de éstasis (hiperpresión) y b) métodos de succión (hipopresión).
3.a) Prueba del lazo o del torniquete
Se denomina también prueba de Rumpel-Leede, prueba de Hess o de la
fragilidad capilar.
Fundamento: Consiste en someter a los capilares de la piel del antebrazo a un
aumento de presión, obstruyendo la circulación venosa de retorno, respetando
la arterial y, en observar el número de petequias cutáneas que aparecen por
debajo del pliegue del codo.
Procedimiento
Se realiza colocando el brazal de un aparato para tomar la presión sanguínea
en el tercio medio del brazo y se mide la presión. Se mantiene el brazal durante
5 minutos a una presión intermedia entre la sistólica y la diastólica (entre 80 y
100 mm de mercurio en un individuo normal). Se retira el brazal y durante los 5
minutos siguientes se cuenta el número de petequias que aparecen en la cara
anterior del antebrazo. Se puede repetir la prueba en el otro brazo, pero una
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vez practicada en ambos brazos, se debe esperar una semana para poder
repetirla.
Valores de referencia: En condiciones normales pueden formarse hasta 5
petequias.
La positividad de la prueba se expresa en cruces.
Positiva (+): pocas petequias en la cara anterior del antebrazo
Positiva (++): muchas petequias sobre la superficie anterior del antebrazo.
Positiva (+++): muchas petequias sobre todo el antebrazo y mano.
Positiva (++++): petequias de gran tamaño y confluentes en todo el antebrazo y
a veces se extienden al dorso de la mano. En algunos casos debido a la
abundancia y confluencia de las petequias, todo el antebrazo adquiere una
tonalidad violácea.
3.b) Prueba por succión o aspiración
Se conoce también con el nombre de prueba de presión negativa de la ventosa
o del petequiómetro.
Fundamento: Consiste en aplicar durante 1 minuto una presión negativa sobre
la piel en una región que puede ser el brazo o el antebrazo.
Procedimiento
Se realiza colocando durante 1 minuto una ventosa plástica de 2 cm de
diámetro, conectada a un tubo que contiene un émbolo, que permite producir
una presión negativa que puede graduarse por medio de un manómetro.
Como en el mercado es difícil conseguir este aparato, distintos autores han
diseñado pequeños instrumentos con esta finalidad.
Este método tiene la ventaja de tener una estandarización más exacta, ya que
la superficie examinada, es siempre exactamente igual, la presión negativa
aplicada también puede ser medida con exactitud, lo mismo que el tiempo
utilizado y puede repetirse con intervalos de tiempos muy cortos.
Valores de referencia: 0 a 3 petequias a 200 mm de mercurio.
La prueba es positiva cuando aparecen más de tres petequias.
4- RETRACCIÓN DEL COÁGULO
Fundamento: La retracción del coágulo se produce por la interacción de la
GPIIb-IIIa con la actina del citoesqueleto, produciéndose un reordenamiento de
la membrana plaquetaria. Se utiliza ATP como fuente de energía.
Esta prueba depende de: cantidad y funcionalidad de las plaquetas;
concentración del fibrinógeno y del hematocrito.
Se encuentra alterada en disfunciones plaquetarias congénitas o adquiridas,
principalmente la Trombastenia de Glanzmann e insuficiencias renales.
Procedimiento
Se coloca en tres tubos de hemólisis bien limpios 1 mL se sangre en cada uno
y se los mantiene a 37ªC durante 1 hora. Luego se observa la magnitud de la
retracción.
Valores de referencia: El coágulo normal debe separarse de las paredes y del
fondo del tubo.
Cuando el coágulo al final de la primera hora no se separa de las paredes del
tubo, se lo puede desprender mediante una varilla delgada, incubando
nuevamente el tubo, si la retracción es normal esta tiene lugar rápidamente.
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Se informa: retracción del coágulo aumentada (hiperretráctil), normal
(normorretráctil), disminuida (hiporretráctil) o nula (arretráctil).
PRUEBAS PLAQUETARIAS ESPECÍFICAS
1- ADHESIVIDAD PLAQUETARIA “in vivo” (Método de Borchgrevik)
Al producirse una injuria tisular quedan expuestos componentes del
subendotelio, en un primer momento la plaqueta se adhiere a los componentes
del subendotelio como el colágeno y FvW mediante las glicoproteína
plaquetaria (complejo Ib-V-IX). La plaqueta adherida forma una monocapa
sobre la herida y se activa.
Fundamento: Se mide la adhesividad plaquetaria comparando el número de
plaquetas presentes en una muestra de sangre obtenida por punción venosa
frente a otra obtenida a partir de una incisión realizada en el antebrazo. La
diferencia entre ambas expresa el número de plaquetas adheridas al tejido
lesionado o adhesividad plaquetaria.
Procedimiento
Se realiza el tiempo de sangría según el método de Ivy o Mielke y a los 2
minutos, se toma con micropipeta una muestra de la sangre que fluye de la
incisión practicada para el tiempo de sangría. Se realiza el recuento de
plaquetas en esta muestra (RT2). Al mismo tiempo se toma una muestra de
sangre venosa y se realiza el recuento plaquetario basal (RT0).
% de Adhesividad =
(RT0 – RT2) x 100
RT0
Resultados
Valores de referencia: 30 a 70 %
Se encuentran valores de adhesividad plaquetaria disminuidos en la
enfermedad de Bernard Soulier (donde está alterada la GP Ib-V-IX) y también
en la enfermedad de von Willebrand. También se encuentra alterada en la
enfermedad de Pool de depósito y en trombocitopatías adquiridas como
síndromes mieloproliferativos, enfermedad renal crónica y síndrome de
plaquetas activadas.
2-AGREGACIÓN PLAQUETARIA
Cuando se produce una injuria tisular distintos estímulos inducen la agregación
plaquetaria, entre ellos destacamos la exposición de componentes del
subendotelio como el colágeno, productos formados por la activación del
sistema de coagulación como la trombina, sustancias que son secretadas por
la plaquetas o aportadas por la membrana del glóbulo rojo como el ADP, o
sustancias liberadas en el lugar de la injuria como la adrenalina. Todas estas
sustancias solas o combinadas son capaces de convertir plaquetas en estado
de reposo a plaquetas en estado activado.
El mecanismo de agregación plaquetaria es consecuencia de un proceso
metabólico complejo.
Para cada activador interviene un receptor de la membrana plaquetaria
específico, y esta unión ligando-receptor desencadena vías metabólicas, las
cuales conducen a la agregación plaquetaria.
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Fundamento: Se define como agregación plaquetaria a la interacción
plaqueta-plaqueta medida sobre PRP por método óptico, requiriéndose para
este proceso la integridad metabólica de las mismas, dado que este
mecanismo incluye cambios morfológicos y químicos.
Procedimiento
La valoración de la respuesta de agregación de las plaquetas puede realizarse,
con las mismas en su medio natural, en el plasma, o bien resuspendidas en
distintos medios.
Se usa un método turbidimétrico que se basa en medir mediante un
agregómetro, la diferencia en la densidad óptica (DO) existente entre el plasma
rico en plaquetas (PRP) y el plasma pobre (PPP). A medida que las plaquetas
se agregan y permiten el mayor pasaje de luz, disminuyendo así la DO, se
inscriben las curvas de agregación en función del tiempo.
El agregómetro tiene un sistema magnético que hace girar una barrita
agitadora incluida en la cubeta de PRP en el momento del ensayo. Esta barrita
agitadora simula la turbulencia sanguínea, la cual es fundamental para que se
produzca la colisión entre las plaquetas y se mezcle el agente agregante
incluido en la muestra. La temperatura a la que se realiza el ensayo es de
37ºC.
La muestra no debe entrar en contacto con material de vidrio, porque en este
caso se originaría la adhesividad de las plaquetas y la activación de la muestra.
Obtención de la muestra
Para los estudios de función plaquetaria es fundamental que el paciente no
tome medicamentos que contengan aspirina desde los 10 días previos al
estudio, y en lo posible que se suspendan 48 horas antes otros medicamentos
(especialmente si estos son anti-inflamatorios). Además debe presentarse con
un ayuno de más de 8 horas.
Se extrae sangre venosa con agujas 19G 1 ½, procurando una punción sin
dificultades y un buen flujo sanguíneo. Se deja drenar la sangre
espontáneamente a tubos de plástico que contengan citrato de sodio al 3,8%
en una relación 9:1 de sangre y anticoagulante respectivamente. Se debe
homogeneizar suavemente.
La relación entre la sangre y el anticoagulante depende del hematocrito del
paciente, debido a que el exceso de citrato en el medio modificará la
disponibilidad de calcio ocasionando variaciones en la amplitud de las curvas
de agregación.
Obtención del PRP
Se centrifuga la muestra en centrífuga no refrigerada (el frío estimula las
plaquetas) durante 5 a 7 minutos a baja velocidad (180 g). Es importante que la
muestra esté libre de glóbulos rojos y blancos debido a que los primeros
modifican la disponibilidad de ADP y los segundos inhiben la agregación
plaquetaria.
Posteriormente se separa el plasma rico en plaquetas con pipeta plástica y se
lo transfiere a tubos plásticos, que se tapan para evitar la oxidación del plasma.
El resto de sangre se centrifuga nuevamente durante 20 minutos a alta
velocidad para obtener PPP que será utilizado para calibrar el aparato.
Debido a que las plaquetas necesitan ser metabólicamente activas deberá
realizarse el ensayo de agregación dentro de las 2 horas desde la extracción
de sangre y no antes de los 20 minutos, ya que responden menos,
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probablemente porque no se metabolizó toda la PGI2 que pudiera estar
presente en la muestra.
En cada prueba se utiliza una cubeta con 450 uL del PRP a la que se le
incorpora la barrita agitadora y el agente agregante a probar en la dilución
correspondiente.
Los agentes agregantes o agonistas deben permanecer en gradillas enfriadas
una vez preparados.
Los agonistas que se pueden usar y su concentración final en la cubeta de
reacción son:
Acido Araquidónico: 2.5 mM
ADP: 3,3 x 10-6 M
Adrenalina: 10-6 M
Colágeno: 2 - 5 µg/mL
Ristocetina: 1.5 mg/mL
Trombina: 0,2 - 0,5 U/mL
Procedimiento
Cada día al comenzar y al terminar el estudio de los pacientes deberá
chequearse por lo menos un normal que asegurará la buena actividad de todo
el sistema.
El primer paso es la calibración del agregómetro. Se ajusta el 100% de DO con
PRP y el 0% con PPP correspondiente, en ambos extremos del papel donde se
grafican las curvas que deberá correr a 2 cm/minuto.
Al colocar la barrita agitadora dentro de los 450 uL de PRP, lo primero que se
observa son las oscilaciones características de las plaquetas discoides en
suspensión.
El segundo paso será ensayar la agregación espontánea durante 20 min.
Se considerará que existe agregación espontánea cuando supere el 15 % de
agregación.
Posteriormente se continúa con los otros agonistas, obteniéndose curvas
características con cada uno de ellos.
Las siguientes gráficas ejemplifican el tipo de curva que se obtiene de acuerdo
al tipo de agonista (Fig N° 1).
FIGURA N° 1: Agregación plaquetaria. Curvas normales empleando ADP y
adrenalina
ADP
Adrenalina
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FIBRINOLISIS
Los componentes del sistema fibrinolítico pueden ser evaluados en conjunto
mediante pruebas globales (las cuales son pruebas funcionales) o estudiando
específicamente la funcionalidad cada uno de sus componentes (pruebas
antigénicas y/o estudios de biología molecular)
También se puede evaluar si hubo activación de este sistema investigando la
presencia de los productos generados por su activación.
Debemos tener en presente que los ensayos que evalúan el sistema
fibrinolítico en el laboratorio son pruebas in vitro. En las mismas se trabaja con
una muestra de sangre del paciente (ex vivo), de tal manera que solo
evaluamos los componentes del sistema fibrinolítico que tenemos en el tubo
(principalmente las proteínas), es decir no intervienen las células (endoteliales,
plaquetas, micropartículas) ni los receptores celulares que fisiológicamente
desarrollan una función importante in vivo. Debido a ésto los resultados del
laboratorio presentan cierta limitación.
Obtención de la muestra
Para el estudio de la fibrinólisis se debe tener presente algunas
consideraciones:
o
Algunos componentes presentan fluctuaciones diarias debido al ritmo
circadiano, por ejemplo el pico de síntesis del Inhibidora del activador
plasminógeno (PAI) es entre las 3 y 6 de la mañana y su valle por la tarde,
mientras que el activador tisular del plasminógeno (tPA) presenta un nivel
máximo a las 9 de la mañana. Para que las técnicas de fibrinólisis puedan ser
reproducibles se estableció que el horario de extracción debe realizarse
siempre entre las 8 y 10 de la mañana.
o
Como varios de los componentes de este sistema son sintetizados por
las células endoteliales, la punción venosa debe ser limpia procurando el
menor éstasis posible (no superior a 2 minutos) para evitar la activación del
endotelio y la posterior liberación de tPA.
o
Existen factores externos que potencian el sistema fibrinolítico, entre
ellos: isquemia, oclusión venosa, ejercicio físico, frío intenso, sustancias
vasoactivas, ingestión moderada de alcohol, tratamiento para la
hipertrigliceridemia, la raza blanca y un factor etáreo (cuanto más joven más
activo). Disminuyen su acción: Tabaco, diabetes, ingesta excesiva de alcohol,
anticonceptivos orales, aterosclerosis, hipertrigliceridemia.
o
Para minimizar los posibles efectos de factores externos en la
evaluación de la función fibrinolítica se solicita la paciente la restricción del
consumo de alcohol 18 a 24 h previas a la toma de la muestra y del consumo
de cigarrillos por lo menos 15-20 días previos al estudio. Se recomienda no
realizar actividad física (no hacer gimnasia, no subir escaleras, no correr, etc);
el paciente deberá permanecer en reposo, en un ambiente tranquilo, entre 20 a
30 min antes de la extracción.
o
El anticoagulante recomendado para la lisis de euglobulinas es el citrato
ácido de sodio (pH 5) porque preserva el tPA (tiene vida media corta) y evita la
formación in vitro del complejo tPA-PAI. Para el resto de las pruebas se utiliza
citrato de sodio 0,11 M. Es recomendable la pronta separación del plasma del
paquete globular, obteniéndose el PPP por doble centrifugación dentro de los
20 minutos realizada la extracción.
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PRUEBAS GLOBALES DEL SISTEMA FIBRINOLITICO
1-Tiempo de lisis de sangre entera diluida
Fundamento: El tiempo de lisis del coágulo formado a partir de sangre entera
diluida en buffer, depende de los niveles de fibrinógeno, plasminógeno, FXIII y
del equilibrio entre los activadores e inhibidores del sistema fibrinolítico. Si los
niveles de fibrinógeno, plasminógeno y FXIII son normales, el tiempo de lisis
dependerá fundamentalmente del equilibrio tPA-PAI.
Procedimiento
Colocar en un tubo de vidrio en baño de agua a 37ºC:
0,9 mL de tampón acetato de sodio (0,12 M, pH 7,4)
0,1 mL de sangre entera citratada
0,05 mL de trombina (solución 5 U/mL en tampón acetato)
Incubar y registrar el tiempo de lisis del coágulo. Se informa el tiempo que tarda
en lisarse el coágulo.
Valores de referencia
En individuos normales el tiempo de lisis del coágulo de sangre entera diluida
es variable. Cada laboratorio debe establecer el rango de referencia. Se
considera normal un tiempo de lisis superior a 18 horas. Tiempos de lisis
menores a 2 h indican un aumento de la actividad fibrinolítica a expensas
fundamentalmente de los activadores del sistema.
2-Tiempo de lisis de euglobulinas
Fundamento: La dilución y acidificación del plasma produce la precipitación de
una fracción proteica que contiene el fibrinógeno, el plasminógeno, los
activadores del plasminógeno y la plasmina. Esta fracción denominada
euglobulinas, es resuspendida en un buffer alcalino, coagulada e incubada a
37ºC, para registrar finalmente el tiempo de lisis del coágulo. Mediante este
procedimiento se eliminan los inhibidores de la fibrinólisis (sobrenadante)
acortándose significativamente el tiempo de lisis en comparación con el de
sangre entera.
Procedimiento
Una vez obtenida la muestra debe mantenerse en baño de hielo hasta su
procesamiento, el cual debe llevarse a cabo dentro de los 20 min. de extraída
la misma. La sangre se centrifuga durante 10 min. a 3.000 rpm para obtener
PPP. La prueba debe realizarse por duplicado.
En un tubo de vidrio agregar:
8 mL de agua destilada fría.
0,5 mL de PPP
0,15 mL de ácido acético 1%
Se mezcla por inversión y se dejan durante 30 minutos en heladera a 4ºC para
que se complete la precipitación de las euglobulinas.
Centrifugar a 5 min a 3.000 rpm. Descartar el sobrenadante y colocar los tubos
invertidos sobre un papel de filtro, durante 2 minutos para que escurra todo el
líquido.
A continuación agregar 0,5 mL de solución de borato de sodio (9 g de NaCl, 1 g
de borato de Na y agua destilada csp 1000 mL). Mezclar con una varilla hasta
disolución total del precipitado.
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Mantener el tubo a 37ºC y agregar 0,5 mL de Cloruro de Ca 0,025 M. Registrar
el tiempo al cual la mezcla coagula.
Controlar cada 15 minutos hasta observar la lisis total del coágulo. Informar el
tiempo de lisis del coágulo de euglobulinas.
Valores de referencia: El coágulo no debe lisarse antes de las 2 horas.
Tiempos de lisis menores de 1 hora 30 minutos indican un aumento de la
actividad fibrinolítica a expensas fundamentalmente de los activadores del
plasminógeno. La prueba puede, sin embargo, estar afectada por la
concentración del fibrinógeno y del plasminógeno presentes en la muestra a
analizar.
3-RESPUESTA FIBRINOLÍTICA POST-ISQUEMIA
Fundamento: Esta prueba permite evaluar la respuesta del sistema fibrinolítico
a un estímulo como la isquemia, provocada por la oclusión de la circulación
sanguínea. Esta oclusión produce la estimulación de las células endoteliales
que liberan componentes del sistema fibrinolítico y también una menor
depuración hepática de los componentes (tPA, PAI, etc) lo cual conduce a un
acortamiento de la prueba.
Procedimiento
La prueba consiste en tomar una muestra basal y otra post isquemia. La
isquemia se produce colocando en el brazo del paciente un esfigmomanómetro
durante 10 minutos a una presión media entre la máxima y la mínima de la
presión arterial del paciente, lo cual impide su flujo sanguíneo. Concluido los 10
minutos, antes de retirar el esfigmomanómetro se obtiene la muestra de sangre
post-oclusión.
Sobre la muestra basal y post-oclusión se realiza alguna de las pruebas
globales de la fibrinólisis como la lisis de sangre entera diluida o la lisis de
euglobulinas.
Resultados de lisis de euglobulinas:
Se puede expresar el resultado: Lisis pre isquemia: > 120 minutos
Lisis post isquemia: < 45 minutos
También se pueden expresar los resultados como la diferencia en minutos del
tiempo de lisis basal y el tiempo de lisis post isquemia, ó como el cociente entre
post isquemia lisis / lisis basal. Se considera que la respuesta a la isquemia es
buena si el cociente es menor de 0.70-0.75.
Niveles basales aumentados de PAI conducen a una respuesta fibrinolítica al
estasis venoso pobre o ausente, debido a el PAI bloqueará el tPA liberado por
el estímulo impidiendo su acción fibrinolítica. Una menor liberación de tPA
producirá una respuesta similar.
PRUEBAS ESPECÍFICAS FUNCIONALES DEL SISTEMA
FIBRINOLITICO
DOSAJE DE PLASMINÓGENO
Existen métodos directos e indirectos para estudiar el plasminógeno.
Detallaremos un método directo amidolítico.
Los métodos amidolíticos se basan en la capacidad que tienen las enzimas en
actuar sobre sustratos específicos. Los sustratos cromogénicos son péptidos
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sintéticos que presentan el mismo enlace que el sustrato natural de la enzima a
estudiar. Al producirse la ruptura de dicha unión liberan un cromógeno (pnitroanilina) cuya intensidad se puede leer en espectrofotómetro a 405 nm.
El plasminógeno circula como un zimógeno (proteína sin actividad). Para que
esta proteína exprese su funcionalidad debe ser activada por activadores que
pueden ser exógenos (estreptoquinasa) o endógenos (tPA). El plasminógeno
de la muestra del paciente al ser colocado junto a un activador
(estreptoquinasa) se convierte en plasmina (enzima activa). La plasmina
liberada actúa sobre el sustrato cromogénico específico liberando un
cromógeno que es medido a 405 nm
Plasminógeno (muestra) + SK en exceso
Plasmina + sustrato
Plg-SK
p-nitroanilina
Plasmina
405 nm
PRODUCTOS GENERADOS POR LA ACTIVACIÓN DEL SISTEMA
FIBRINOLÍTICO
Como consecuencia de la activación del sistema fibrinolítico se genera
plasmina, enzima proteolítica que puede actuar sobre distintos sustratos. Su
principal sustrato fisiológico es la malla de fibrina. Cuando la plasmina degrada
la fibrina el producto final de este proceso son los Dímeros D (fibrinólisis).
Cuando la cantidad de plasmina generada degradó completamente la malla de
fibrina y superó la capacidad de los inhibidores (α2 antiplasmina) capaces de
frenarla, esta enzima sigue actuando sobre otros sustratos como el fibrinógeno,
cuyos productos finales de degradación son los PDF (fibrinógenolisis).
COAGULACIÓN
TROMBINA
FIBRINÓGENO
MONÓMEROS
DE FIBRINA
FXIII
COÁGULO DE FIBRINA
X
Y
D
E
PLASMINA
D
D
PDF
Dímeros D
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DETERMINACIÓN DE DÍMEROS D-D
Métodos de aglutinación de partículas de látex
Es una técnica rápida, semicuantitativa, para la determinación de productos de
degradación de la fibrina D-D dímeros en el plasma.
Se utilizan partículas de látex recubiertas con un anticuerpo monoclonal de
ratón anti D-D humano.
La prueba es positiva con concentraciones de D-D que superen los 0,5 ug/mL.
Es menos sensible que la determinación de D-D por enzimoinmunoensayo,
pero resulta útil ya que es una técnica rápida que aporta información para el
diagnóstico de emergencia o en el control de la terapia trombolítica.
El ensayo es insensible a la presencia de fibrinógeno, productos de
degradación tempranos (fragmentos X e Y) y al fragmento E.
Valores de referencia: Valores menores de 500 ng/mL (plasma de individuos
de ambos sexos con edades entre 18 y 55 años).
El hallazgo de dímero D indica la activación del sistema de coagulación con
generación de trombina y posterior acción del sistema fibrinolítico.
Son de utilidad en el diagnóstico de Coagulación Intravascular Diseminada.
Para el diagnóstico temprano de trombosis venosa profunda y
tromboembolismo pulmonar es necesario utilizar una metodología altamente
sensible que le otorgue un valor predictivo negativo alto como el ELISA o
micropartículas de alta sensibilidad.
La determinación de dímeros D resulta útil también para la evaluación de
estados protrombóticos como neoplasias, leucemias agudas (M3) y en
hepatopatías.
BIBLIOGRAFÍA


Manual de Hematología de la Academia Nacional de Medicina. 1990.
Manual de Hemostasia y Trombosis - Grupo Cooperativo de Hemostasia y
Trombosis (Grupo CLAHT). 1990
 Hemostasia y Trombosis Técnicas e interpretación. Dr. Edgardo Iglesias
1978.
 Guía de trabajos prácticos de Hemostasia. Universidad de Buenos Aires.
Departamento de Análisis Clínicos – 1987.
 Wintrobe’s Clinical Hematology. 9ª Edición 1993 .
 Trombosis. Tomo 1. Raúl Altman y colaboradores. 2005.
 Fundamentos para el Manejo Práctico en el Laboratorio de Hemostasia.
Grupo CAHT (Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis).
2003.
 Guías de Trabajo Práctico del Curso de Posgrado Avances en Hemostasia
1999. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. UBA.