Ingeniería tisular: Aplicación de células ... epidérmicos. TÍTULO DE LA TESIS

TÍTULO DE LA TESIS
Ingeniería tisular: Aplicación de células madre en reparación de defectos
epidérmicos.
RESUMEN
Una adecuada cicatrización de las heridas de la piel es clave en el desarrollo favorable de
numerosos cuadros patológicos. Se han descrito un gran número de complicaciones médicas
o quirúrgicas que pueden ser atribuidas a deficiencias en la cicatrización de las heridas,
existiendo un amplio abanico de enfermedades y entidades patológicas (insuficiencia venosa
periférica, isquemia arterial, diabetes, cáncer, inmunodepresión), que influyen de forma
negativa sobre la reparación de las heridas, siendo la causa de una parte importante de la
morbilidad e indirectamente, de la mortalidad, que encontramos a nivel hospitalario. Mención
especial merecen por su frecuencia y por el gran impacto sanitario y socioeconómico que
acarrean sus potenciales secuelas, las úlceras por decúbito y/ó vasculares.
La ingeniería tisular, se ha visto enriquecida en los últimos años por la aparición continua de
numerosos estudios que intentan aportar más luz sobre la biología de las células madre y sus
posibles aplicaciones terapéuticas.
Como hipótesis de trabajo, nos planteamos, si las células madre musculares (muscle
derived stem cells, MDSC) podían representar una alternativa eficaz para la reparación de
defectos cutáneos excisionales. Para verificar esta hipótesis, nos propusimos dos objetivos:
-Aislamiento, caracterización y elección del momento para el transplante de las MDSC.
-Aplicación de las MDSC como terapia celular sobre un modelo experimental de defecto
excisional cutáneo.
En el primer objetivo se diseñó un protocolo de obtención de MDSC. Las células
fueron extraídas a partir de una biopsia del músculo dorsal de conejos blancos de Nueva
Zelanda (n=20), y se llevó a cabo su caracterización mediante técnicas inmunohistoquímicas
y de Western blot. Se realizaron ensayos de proliferación con 3H-Timidina y estudios de
microscopía óptica y electrónica de transmisión y barrido. Los resultados obtenidos
confirmaban que tras 14 días en cultivo, la población celular se compone principalmente de
células precursoras, con capacidad de proliferación, adhesión y migración, lo cual
recapitulaba propiedades biológicas, para la aplicación de las mismas en el modelo
experimental de cicatrización diseñado en el segundo objetivo, donde se realizó un defecto
excisional cutáneo de 2 cm de diámetro en cada una de las orejas del animal de
experimentación. Los defectos se realizaron en la cara dorsal de ambas orejas del animal con
un dispositivo rígido, cilíndrico y cortante. Se respetó el tejido correspondiente al pericóndrio
del cartílago de la oreja. El sacrifico de los animales se realizó a los 14 días, estableciéndose
dos grupos de estudio: grupo I – control (oreja izquierda), (n=10): defectos sin tratamiento,
y grupo II (n=10), defectos que fueron tratados con transplante de células madre autólogas
(MDSC) (oreja derecha). La población celular, fue marcada con PKH-26 para su seguimiento
dentro del defecto. Las heridas se protegieron con una cubierta de polietileno de diseño
propio. A continuación, se colocó un collarín alrededor del cuello del animal para evitar que
éste manipulara las heridas con sus extremidades.
A nivel macroscópico, los defectos creados fueron evaluados en cuanto a los
fenómenos de contracción y recubrimiento. Las áreas de contracción y reepitelización se
estudiaron por histomorfometría. Los estudios morfométricos fueron realizados mediante
técnicas de análisis de imagen. Para el estudio estadístico se empleó el test de la U de
Mann-Whitney.
Los estudios histológicos fueron realizados empleando técnicas de microscopía óptica
y electrónica de transmisión y barrido e inmunohistoquímicos.
Los resultados morfométricos, muestran que el fenómeno de contracción fue
significativamente superior en el grupo control que en el tratado (1.83 cm 2 vs 2.72 cm2;
*p<0.05). Expresado en porcentaje de contracción observamos un 50.83± 12.84 % en el
grupo control frente a un 22.25± 9.56 % en el grupo sometido a terapia celular. El área de
reepitelización fue significativamente mayor en el grupo tratado que en el grupo control
(2.50 cm2 vs 1.29 cm2; *p<0.05). Los respectivos porcentajes de las áreas reepitelizadas
fueron de 96.33± 3.09 % vs 70.91±6.94 %.
La microscopía óptica mostró como el proceso cicatricial en las heridas control,
avanza a partir de los bordes sanos del defecto. En este proceso encontramos con frecuencia
en las áreas más superficiales, células blancas, células de características epiteliales y yemas
vasculares. La tinción rojo sirio para la detección del colágeno, reveló la presencia de
colageno tipo III en los defectos control y de colágeno tipo I o maduro en las orejas
sembradas. En estos defectos el trazador PKH-26, permitió observar su evolución dentro de
la herida. En presencia del sustrato sembrado se observó una superficie continua entre los
bordes del defecto. Este sustrato favorece la proliferación y migración de las células desde
los bordes sanos. Los queratinocitos proliferaban sobre dicho sustrato y de forma centrípeta,
hacia el centro del defecto.
El estudio inmunohistoquímico realizado sobre las muestras control y las sometidas a
terapia celular, reveló en ambos casos una ausencia de expresión para vimentina y desmina,
mientras que la expresión para α-actina, se localizaba sobre los vasos nativos en los dos
grupos de estudio. La expresión de miosina en las muestras control fue mayor que en las
heridas tratadas, posiblemente correspondientes a zonas de mayor presencia de
miofibroblastos y consecuentemente a áreas de contracción.
Los resultados obtenidos nos permiten formular las siguientes conclusiones:
1.- La población aislada a partir de músculo esquelético, posee las propiedades
inherentes a una población de células indiferenciadas y con gran capacidad de proliferación y
autorrenovación como lo demuestran los resultados comparados con la población de
fibroblastos utilizados como control de celulas diferenciadas.
2.- Tras 14 días de cultivo, la población de MDSC es indiferenciada, proliferativa y
muy adherente,
por lo que consideramos que son características idóneas para ser
transplantadas como terapia celular sobre un defecto cutáneo excisional.
3.- Los defectos sometidos a terapia celular durante dos semanas, mostraron una
significativa disminución del área de contracción del defecto creado, así como una
significativa aceleración de la reepitelización con respecto al grupo sin tratamiento alguno.
Las conclusiones anteriores, nos permiten elevar nuestra hipótesis a categoría de
tesis y afirmar que:
Las células derivadas de células musculares indiferenciadas MDSC aisladas por
nosotros y tras 14 días de cultivo, cumplen los requisitos exigidos para su uso como terapia
celular, tanto en número como características de adhesión, proliferación y diferenciación.
Directores:
Profa. Dra. Dña. Julia Buján Varela
Prof. Dr. D. Juan M. Bellón Caneiro