Ficha tecnica

INGENASA
PRION
INTRODUCCIÓN / INTRODUCTION
DESCRIPCION / DESCRIPTION
Los priones están implicados en la BSE (Encefalopatía Espongiforme
Bovina) y en su equivalente humano nvCJD (nueva variante de la
Enfermedad de Creutfeldt Jacob). Estas enfermedades y otras
similares se conocen como Encefalopatías Espongiformes
Transmisibles las cuales afectan también a otras especies como la
ovina (scrapie)
Los priones son variantes patógenas de proteínas que se producen
de forma natural en las células nerviosas principalmente. Los priones
naturales se conocen como PrPc (Prion Protein Cellular). Los
patógenos se conocen a su vez como PrPsc (sc procede de scrapie,
enfermedad priónica de ovejas). Estos priones patógenos obligan a
las proteínas normales a cambiar de estructura. Ambos tienen las
mismas características químicas siendo su única diferencia, la
conformación. Este cambio es el equivalente a la transmisión de la
infección y puede ocurrir tanto en la superficie celular como en
vesículas celulares donde la PrPc residual va cambiando de
estructura por el simple contacto con las conformaciones patógenas.
PrPsc es resistente a la degradación por los enzimas de los lisosomas
que circulan por el citoplasma celular y, por tanto, se van acumulando
en la célula. Las vesículas PrPsc pueden también viajar hacia el
aparato de Golgi e interceptar PrPc que están siendo procesadas allí.
De esta forma, las partículas PrPc podrían cambiar de conformación
antes de llegar a la membrana celular.
Los priones pueden entrar en el cerebro a través de los axones
neuronales, lo cual ocurre probablemente debido a un flujo de
retroceso de las vesículas que los transportan. Otra ruta de entrada
puede ser la sangre, probablemente en células inmunes. Los
Astrocitos y las células de la Glia también son susceptibles de la
producción de priones en su interior.
El hibridoma productor del anticuerpo monoclonal ha sido
obtenido a partir de linfocitos de bazo de ratón Balb/c
fusionados con células del mieloma X63/Ag8653. Purificado
por cromatografía de afinidad, presenta una pureza del
99%.
Prions are implicated in BSE (Bovine Spongiform Encephalopathy and
its human counterpart nvCJD (new variant Creutzfeldt Jakob Disease).
These and similar diseases are known as TSEs (Transmissible
Spongiform Encephalopathies). TSEs affect other species, most
importantly sheep (scrapie).
Prions are pathogenic variants of proteins that are naturally produced
in nerve cells and certain other cells. The normal "healthy" prions are
referred to as PrPc (Prion Protein cellular).
PrPc encounter rogue prions, named as PrPsc (sc stands for Scrapie,
the prion disease of sheep). The rogue prions seem to force the
normal proteins to change shape. Both types of proteins, the PrPc and
their corresponding prions, have the same chemical properties - just
differing in their conformation. It is this shape-flipping which is
equivalent to the transmission of infection. Such a conformational shift
or flip could happen in the cell surface or in the vesicles. Residual
PrPc might continue to be flipped by
contact with the rogue conformations for some time in these vesicles.
PrPsc is resistant to degradation by the enzymes contained in the
lysosomes that are floating nearby. Consequently, PrPsc accumulates
in the cell. PrPsc vesicles may also travel to the Golgi apparatus
and intercept PrPc that are being processed there. In this way,
PrPc particles could be switched to the rogue form before they
reach the surface of the cell. By such mechanisms, PrPc might be
switched to PrPsc at various points in and on the cell. Prions can enter
the brain along the axons of neurons. This probably happens by a
retrograde flow of prion filled vesicles. Another route of entry can be
the blood,
probably through immune cells. Astrocytes and other glial cells may
also be affected by the production of prions.
The hybridome which produces the monoclonal antibody has
been obtained by the fusion of lymphocytes from Balb/c
mice’s spleen with myelome X63/Ag8653 cells. The IgG
has been purified by affinity chromatography, showing a
purity of
99%.
APLICACIONES / APPLICATIONS
Detección PrP Bovina mediante las técnicas de
Inmunohistoquímica (IHQ) e Inmunoblotting (IB).
Detection of Bovine PrP by Immunohistochemistry (IHC)
and Immunoblotting (IB) techniques.
RESULTADOS / RESULTS
IHQ / IHC
Inmunobloting / Immunoblotting
IBPrP
1EF4
PrPc
no
PK
PrPSc
PK
PrPSc
PK
1/4
PrPSc
PK
1/8
6H4
PrPc
no
PK
PrPSc
PK
PrPSc
PK
1/4
Extracto de cerebro / Brain extract
PrPSc
PK
1/10
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DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO IHQ / IHC PROCEDURE b
CNS samples from an experimental inoculation are fixed in formalin and
processed to be included in paraffin.
One pass of 10 min and two of five min. in Xilol..
One pass of five min in ethanol 100%
Treatment to inhibit the endogen peroxidase with a solution of
Hidrogen peroxide 3% in Methanol for 30 min. and soft shaking;
one pass of five min. in ethanol 100%; one pass of five min. in
ethanol 96%
One pass of five min. in ethanol 70%; two washing steps of five
min. in destilled water.
Treatment with formalin 15 min.
One pass of 15 min. in distilled water.
Three passes of 5 min. in PBS.
One pass at 37ºC in Proteinase K buffer to equilibrate at pH 8.4
Digestion with Proteinase K 15 min.at 37ºC
Three passes of 5 min. in PBS.
Incubation f o r 30 min. at room temperature in wet chamber with
goat serum 10% diluted in PBS
Incubation in wet chamber for 18 hours at 4ºC with AcM diluted in
PBS diluted at 10% in goat serum (See recommended use
conditions for dilution. Note that the supernatant is supplied ready
to use)
Incubate 1 hour at room temperature
3 washing steps of 5 min in PBS with soft shaking
Incubation in wet chamber for 30min. at room temperature with a
second biotiniled rabbit antimouse antibody diluted 1/20 in PBS
diluted 10% goat serum
Incubation with third serum ABC (Vector) in dark wet camera for
1 h.
Wash in Tris for 10 min.
Develop for 1 min.
Wash for 10 min. in water
Stain with Harrys’ hematoxilin for 30 min.
Wash for 10 min. in water
Two passes in Ethanol 96%; Two passes in ethanol 100%
Three passes of 2 min. in Xilol
Preparation in DPX.
Muestras de SNC
procedentes
de una
inoculación
experimental, fijadas en formol e incluidas en parafina.
- Una inmersión de 10 min. y dos de 5min en Xilol
- Una inmersión en Etanol 100% 5min.
- Bloqueo de peroxidasa endógena con Peroxido de Hidrógeno en
metanol al 3% en agitación, 30min., Etanol 100% 5min, Etanol
96% 5min, Etanol 70% 5min.
- Agua destilada 5min.+ 5min.
- Inmersión en ácido fórmico 15min.
- Lavar en agua destilada15 min y realizar 3 lavados en PBS de
5min. cada uno.
- Inmersión de las secciones en el buffer de proteinasa K (equilibrar
pH= 8.4) a 37ºC.
- Digestión con proteinasa K 15min. a 37ºC.
- Realizar 3 lavados en PBS 5min. cada uno
- Suero normal de cabra al 10% en PBS. 30min..
- Anticuerpo diluido, con suero normal de cabra al 10% (en PBS) en
cámara húmeda a 4ºC una noche. (Ver condiciones de uso
recomendadas para dilución. Atención, el sobrenadante se
suministra listo para usar). Incubar 1 hora a temperatura ambiente.
- Realizar 3 lavados en PBS de 5min. cada uno.
- Incubar con el anticuerpo secundario (Ac. Antiratón biotinilado
creado en conejo) a una dilución 1/20 en suero normal de cabra al
10% (diluido 10% en PBS) 30min.
- Realizar 3 lavados en PBS de 5min. cada uno.
- Suero terciario ABC (Vector) Cámara en oscuridad 1 h.
- Lavado en TRIS durante 10min.
- Revelar durante 1min.
- Lavar en agua 10min..
- Teñir con hematoxilina de Harris durante 30min.
- Lavado en agua durante 10min.
- 2 inmersiones en Etanol de 96% - 2 inmersiones en Etanol
absoluto (100%) - 3 inmersiones en xilol. 2min. cada una.
- Montaje de las preparaciones en DPX.
CARACTERÍSTICAS / CHARACTERISTICS
AcM / MAb
Isotipo / Isotype
Especificidad / Specificity
IgG1
PrP (bovine)
4EF1
PRESENTACIÓN / FORMAT
Disponible en dos presentaciones / Two formats available:
PRESENTACIÓN /
FORMAT
Sobrenadante /
Supernatant
Purificada / Purified
CANTIDAD /
QUANTITY
CONCENTRACIÓN / CONCENTRATION
(aproximada / appoximated)
5 ml
10-20 μg / ml
1 ml
1mg / ml
REFERENCIA /
REFERENCE
M.12.PRP.B4EF1
M.12.PRP.I4EF1
REFERENCIAS / REFERENCES
CONSERVACIÓN / STORAGE
CISA INIA, Madrid, Spain
-20%C
PRODUCTO DESARROLLADO POR INGENASA / PRODUCT DEVELOPED BY INGENASA
Inmunología y Genética Aplicada, SA
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9175.ING2
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Última revisión / Last review: 060213