Establecimiento in vitro de Evolvulus glomeratus. Una nativa con potencial ornamental. Maritano, P. F.; Alderete, L. M. ; Mori, M. y Escandón, A. S. Instituto de Floricultura INTA-Castelar. De los Reseros y Nicolás Reppetto s/n (1720)-Bs.As. E-mail: patrimaritano@argentina.com Introducción El mercado internacional de cultivos ornamentales se caracteriza por su competitividad y su dinamismo debido a la necesidad de incorporar novedades en forma constante. La Argentina posee una gran variedad de plantas herbáceas, arbustivas y leñosas con potencial ornamental, lo que la convierte en una muy interesante fuente de material para el desarrollo de nuevas variedades. A pesar de la disponibilidad de este material y que nuestro país posee una gran tradición en el mejoramiento vegetal, en especies ornamentales muy poco es lo que se ha hecho en este aspecto Entre los géneros nativos con potencial ornamental, se encuentra el género Evolvulus (Convolvulaceae) que está representado en el país por siete especies, una variedad y una forma endémica (Zuloaga y Morrone, 1992). E. glomeratus Nees & Mart. es una planta herbácea, semi-erecta, con entrenudos largos en la zona apical y flores de tamaño mediano de un intenso color azul. Su área de distribución incluye una vasta región del norte y centro de la Argentina, llegando inclusive hasta el norte de la Patagonia. La Biotecnología ofrece una serie de herramientas alternativas para el mejoramiento de cultivos: la mutagénesis y la obtención de poliploides in vitro, la variación somaclonal, el cultivo de anteras, el cultivo de protoplastos, la transgénesis y la conservación de germoplasma nativo ex situ, entre otras. En todas las mencionadas está involucrado el cultivo in vitro de tejidos, por lo que la puesta a punto de un protocolo que permita el establecimiento de material de la especie de interés bajo condiciones de cultivo in vitro es el primer paso en el inicio de un programa de mejoramiento de la misma a través de la aplicación de herramientas biotecnológicas (Escandón, 2004). Objetivo Establecimiento del cultivo in vitro de E. glomeratus y el establecimiento de la nutrición mineral adecuada para el desarrollo de los explantos. Materiales y métodos Para el establecimiento in vitro de E. glomeratus, se ensayaron dos protocolos de desinfección para segmentos nodales de plantas mantenidas bajo condiciones de invernáculo. Se probó un protocolo de desinfección estándar de etanol/lavandina comercial/detergente (70%/25%/0,01%, V/V) con cultivo en medio (Murashige-Skoog, 1962) libre de hormonas, suplementado con 20 g/L de sacarosa y solidificado con 7 g/L de agar, pH: 5,7. El segundo protocolo tuvo el mismo esquema de desinfección que el primero, con siembra posterior en el mismo medio anterior pero suplementado con la mezcla (1X) de antibióticos-antimicóticos de Sigma (AAS). Luego de 22 días de cultivo los brotes fueron transferidos al mismo medio pero sin el agregado de AAS. Estas vitroplantas fueron utilizadas como explantos y fueron subcultivadas a diferentes diluciones del medio MS: 0,5X, 0,25X, 0,125X. Todos los tratamientos fueron suplementados con 20 g/L de sacarosa y 100 mg/L de inositol; se solidificó con 7 g/L de agar Sigma® y el pH fue ajustado a 5,7. Los explantos fueron cultivados en cuartos de cultivo a 24ºC±2ºC y bajo un fotoperíodo de 16 horas de luz con una irradiancia de 52 μmol.mˉ².seg. Se sembraron 60 explantos por tratamiento. La longitud de los explantos fue medida en el momento de la siembra de los mismos y luego de 4 semanas. Se calculó un índice de crecimiento (IC) como longitud final/longitud inicial. Los datos se analizaron mediante el test de Student. Al término de 4 semanas también se llevaron a cabo registros acerca de los porcentajes de enraizamiento espontáneo y oxidación observados bajo cada una de las condiciones ensayadas. Resultados y discusión Al cabo de de 5 días de cultivo, el 100% de los brotes desinfectados y sembrados en el medio sin AAS, mostraron desarrollo de contaminación fúngica. Por su parte, el 95% de los brotes desinfectados y cultivados en el medio suplementado con AAS se mostró libre de contaminación y la totalidad de los mismos fueron transferidos al mismo medio libre de AAS. Es posible que la desinfección por el método estándar haya sido efectiva en el eliminación de la contaminación superficial de los explantos pero no resultó suficiente para el control del desarrollo tardío de los organismos contaminantes, los que si pudieron ser controlados satisfactoriamente con el agregado al medio de cultivo de la mezcla AAS. Si bien en la primera semana se observó movimiento de las yemas de los explantos en todas las diluciones del medio MS probadas, posiblemente estuvieran activadas por el hecho de provenir todas de un medio con condiciones favorables de cultivo, a los 30 días de cultivo las diferencias de cultivo se hicieron evidentes. La Figura 1 muestra el grado de desarrollo detectado entre los tratamientos al cabo de 4 semanas de cultivo. Figura 1. Comparación de los explantos en la 4º semana, de izquierda a derecha: explantos establecidos en MS 1X, MS 0,5X, MS 0,25X y MS 0,125X. En este contexto es importante destacar que, en los diferentes medios, E. glomeratus mostró diferentes respuestas, según el parámetro evaluado. En efecto, en lo que a desarrollo se refiere la dilución 0,25X fue la menos efectiva de las cuatro probadas, mostrando diferencias significativas respecto al resto de los tratamientos, en los que se observó una respuesta similar en cuanto a su capacidad de crecimiento medida como IC. En cambio cuando se evaluó su capacidad de enraizamiento fue notoria la diferencia detectada a favor de la dilución 0,5 X. Por otra parte, el porcentaje de explantos con signos de oxidación también mostró diferencias entre los tratamientos, siendo el MS 1X la más adecuada respecto de las otras diluciones probadas (ver Tabla 1). Dilución MS MS 1,0X MS 0,5X MS 0,25X MS 0,125X n 56 51 33 40 IC 6,575¹ 7,333¹ 4,909² 7,608¹ % Enr. 0 11,6 0 5 % Oxid. 6,6 15 45 33,3 Tabla 1. Resultados de los cuatro tratamientos aplicados. n: cantidad de explantos por tratamiento; IC.: media de los índice de crecimiento; % Enr.: porcentaje de explantos que enraizaron espontáneamente; % Oxid.: porcentaje de explantos oxidados en cada tratamiento; Diferentes números indican diferencias significativas (P≤ 0,05) entre tratamientos. No son numerosos los reportes sobre cultivo in vitro de tejidos en la familia Convolvulaceae (Monteiro Correa et al., 2003), en este contexto, es importante indicar que este es el primer reporte sobre el cultivo de tejidos de E. glomeratus y que servirá de base para futuras aplicaciones de herramientas biotecnológicas en el mejoramiento del género. Conclusiones La utilización de la mezcla ASS como suplemento del medio MS posterior al método de desinfección estándar resultó ser limitante para la introducción in vitro de E. glomeratus. El ensayo con diferentes diluciones de medio MS permitió determinar la sensibilidad de E. glomeratus a las diferentes concentraciones, por lo que un protocolo ajustado para la multiplicación in vitro de esta especie deberá usar medio MS 1X para el establecimiento y, eventualmente, la multiplicación del cultivo y el MS 0,5 X para la etapa de enraizamiento. Bibliografía Escandón, A.S. Biotecnología en el cultivo de especies ornamentales. Sección: VIII. Cap.: 1. En: Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. Editores: Viviana Echenique, Clara Rubinstein y Luis Mroginski. Pags.: 1-10; 2004. Monteiro Corrêa, R. Potencial do carvão ativado, filtro amarelo e interação fotoperiodo/temperatura de batata-doce in vitro. Ciência Rural, vol.33, n.3, pag. 423-430; 2003. Murashige, T. & Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. PI 15: 437-497; 1962. Zuloaga, F.; Morrone, O.; Catálogo de las Plantas Vasculares de la República Argentina II; Missouri Botanical Garden Press; 1999.