Influencia del tipo de explanto para la inducción in vitro de callo de melocotón (Prunus persica L.). M. Pérez Jiménez, A. Carrillo Navarro y J. Cos Terrer. Hortofruticultura - IMIDA, 30150-La Alberca, Murcia. E-mail: margarita.perez3@carm.es Palabras clave: melocotón, callo, inducción, 2,4D, kinetina. Resumen El trabajo compara la influencia que tiene el tipo de explanto y las condiciones de iluminación en la inducción de callo de melocotón. Los explantos usados fueron hojas adultas en posición adaxial y abaxial, secciones de hojas adultas a las que se le habían eliminando las nervaduras principales en posición adaxial y abaxial, hojas jóvenes recién brotadas en posición adaxial, yemas axilares y yemas apicales aisladas, secciones de 0.4 cm de tallos herbáceos en posición polar y apolar. El medio de cultivo usado fue el WPM con 1.2 mg·l-1 de 2,4-D y 1 mg·l-1 de Kinetina, manteniendo los cultivos a 25ºC en condiciones de oscuridad y en presencia de luz con un fotoperiodo 16:8. Los resultados obtenidos indican que en todos los explantos apareció callo, siendo de tipología friable y color blanco en condiciones de oscuridad, y compactos y amarillo-verdosos en condiciones de luz. INTRODUCCIÓN El melocotón (Prunus persica L. Batsch) es una de las frutas más importantes, siendo España la cuarta productora mundial. La importancia de los programas de mejora genética radica en la obtención de variedades con las que se pueda competir en el mercado. El cultivo in vitro es un excelente complemento de la mejora clásica, ya que la introducción de un determinado carácter puede ser en determinadas ocasiones inviable, además de un proceso de larga duración. La utilización de las técnicas de transformación genética puede permitir acortar el periodo de obtención de una nueva variedad. El género Prunus está considerado como uno de los más recalcitrantes respecto a su comportamiento in vitro, y para su aplicación en programas de mejora genética, es fundamental disponer de un protocolo eficiente en cada una de las fases de organogénesis y embriogénesis somática, de forma que nos permita obtener callos con una capacidad organogénica y embriogénica estable. La inducción in vitro de callo a partir de un explanto inicial es una de las fases determinantes, ya que se ve afectada por muchos factores como el genotipo, la composición salina del medio de cultivo, los reguladores del crecimiento, las condiciones de cultivo, agar y el tipo y edad del explanto de partida. En esta fase las auxinas cumplen un papel primordial induciendo la proliferación y aparición de callo (Paris et al., 2003) que, junto a otros reguladores del crecimiento pueden ayudar a la cantidad y calidad del callo. Al igual, los factores físicos como la ausencia o presencia de luz, pueden darnos características diferenciales en la masa celular resultante. Los explantos utilizados para la inducción de callo son principalmente cotiledones maduros e inmaduros, raíces y hojas, tanto de plantas multiplicadas in vitro como de plantas (Fillati et al., 1987; Hammerschlag et al. 1985; Bhansali et al. 1990; Scorza et al. 1990), siendo la mayor dificultad obtener buenos resultados con material adulto ex vitro 103 (Gentile et al. 2002). El trabajo compara la inducción de callo en nueve tipos de explantos, y el efecto de la ausencia o presencia de luz. MATERIAL Y MÉTODOS Tipos de explantos Se utilizaron nueve tipos de explantos: secciones de hojas adultas en posición adaxial (1) y abaxial (2), secciones de hojas adultas a las que se le habían eliminando las nervaduras principales en posición adaxial (3) y abaxial (4), hojas jóvenes recién brotadas en posición adaxial (5), yemas axilares (6) y yemas apicales (7) aisladas, secciones de 0.4 cm de tallos herbáceos en posición polar (8) y apolar (9). Todos los explantos se desinfectaron con una solución diluida de hipoclorito sódico al 2%. El material vegetal estudiado son híbridos del programa de mejora genética que se está realizando en el IMIDA. Estas plantas tenían una edad de 4 meses, con un porte medio de 90 cm y se encontraban en invernadero en condiciones de cultivo controladas. Luz/oscuridad Se estudiaron dos tratamientos: a) oscuridad y b) iluminación bajo unas condiciones de 45 μ mol.m-2.s-1 (Philips TLD 58W/54) y un fotoperiodo de 16 horas luz:8 horas de oscuridad. Todos los explantos se colocaron en la cámara de cultivo a 25ºC. Medio de cultivo, y Condiciones de cultivo El medio de cultivo utilizado fue el WPM (Woody Plant Medium) con vitaminas, 1.2 mg.l-1 de 2,4-D y 1 mg.l-1 de Kinetina. La concentración de sacarosa del medio fue de 30 g.l-1 y 7 g.l-1 de agar de ‘Propagación’ (Pronadisa). Parámetros estudiados Los controles realizados para cuantificar el estudio fueron: el porcentaje de explantos que desarrollaron callo, el número de días a los que aparece, color y tipo del callo y el tamaño relativo del callo respecto al explanto inicial al final del cultivo. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los resultados obtenidos muestran la buena respuesta de todos los tipos de explantos estudiados. El porcentaje de explantos que indujeron callo fue del 100% en todos los materiales estudiados, en la Figura 1 podemos ver como el crecimiento relativo del callo respecto al explanto inicial fue mayor en condiciones de oscuridad. En todos los casos la coloración de los callos obtenidos en condiciones de oscuridad fue amarilla clara con una tipología friable, mientras que la obtenida en condiciones de luz fue verdosa y una textura más compacta (Figura 3). La velocidad de aparición de callo fue mayor en condiciones de luz que en oscuridad, independientemente del tipo de explanto utilizado como se puede observar en la Figura 2. Los resultados obtenidos nos permiten iniciar los estudios de organogénesis y embriogénesis para disponer de un protocolo de regeneración eficiente para esta especie. Referencias Bhansali R.R., Driver .JA. and Durzan D.J. 1990. Rapid multiplication of adventitious somatic embryos in peach and nectarine by secondary embryogenesis. Plant Cell Rep. 9: 280–284. 104 Fillati, J.J., Sellmer, J., McCown, G., Haissig, B., and Comai, L. 1987. Agrobacterium mediated transformation and regeneration of Populus. Molecular and General Genetics. 206:192-199. Gentile, A., Monticelli, S., Damiano, C. 2002. Adventitious shoot regeneration in peach (Prunus persica (l.) Batsch). Cell Biology and Morphogenesis. 20:1011-1016. Hammerschlag, F.A., Bauchan, G. and Scorza, R. 1985. Regeneration of peach plants from callus derived from immature embryos. Theor. Appl. Genet. 70: 248–251. Paris, R., Patresi, D., Negri, P. 2004. In vitro morphogenic ability of mature or embryonic apricot tissues. Proceedings of the XIth Eucarpia Symposium on Fruit Breeding and Genetics, Vols 1 and 2. Acta hortoticulturae. 663: 487-490. Part 1-2. Scorza, R., Morgens, P.H., Cordts, J.M., Mantem, S. and Callahan, A.M. 1990. Agrobacterium-mediated transformation of peach _Prunus persica L. Batch_ leaf segments, immature embryos and longterm embryogenic callus. In Vitro Cell Dev. Biol. 26: 829–834. Crecimiento relativo de callo (%) 100 LUZ OSC 80 60 40 20 Yema axilares Yemas apicales Secciones de tallo posición polar Secciones de tallo posición apolar Hojas adultas sin nervaduras principales abaxial Hojas adultas sin nervaduras principales adaxial Hojas jóvenes Hoja adulta abaxial Hoja adulta adaxial 0 Figura 1. Crecimiento relativo de callo (%) respecto al explanto inicial, en los 9 tipos de explantos utilizados, en condiciones de luz y oscuridad. 105 100 Luz 80 % 60 40 20 0 0 5 10 15 20 25 30 15 20 25 30 Días 100 Oscuridad 80 % 60 40 20 0 0 5 10 Días Hoja adulta adaxial Hoja adulta abaxial Hojas jóvenes Hojas adultas sin nervaduras principales adaxial Hojas adultas sin nervaduras principales abaxial Secciones de tallo posición apolar Secciones de tallo posición polar Yemas apicales Yemas axilares Figura 2. Evolución del porcentaje de explantos que desarrollaron callo a partir de los distintos tipos de explantos y en las dos condiciones de iluminación. 106 Explantos iniciales Oscuridad Luz Figura 3. Situación inicial y final de los explantos. 107