3.1.1. Obtención del material vegetal

Materiales y métodos
3.1.1. Obtención del material vegetal: El material vegetal fue recolectado en forma
manual de acuerdo a las pautas establecidas por la OMS. Se seleccionaron cuidadosamente
aquellas plantas aromáticas de Origanum vulgare L. (orégano), Aloysia triphylla (cedrón),
Aloysia polystachya (té de burro), Mentha piperita L. (menta), Hyptis mutabilis, Tagetes
minuta L.y Eucaliptus globosus que no mostraron alteración morfológica visible, ni
indicios de afecciones patógenas. Se empleó el mismo criterio para los frutos maduros de
Citrus limonum Risso (limón). Las plantas fueron tipificadas y conservadas bajo números
de herbarios correspondientes y archivadas en el Museo Botánico de la Facultad de
Ciencias Exactas Físicas y Naturales de la UNC Las hojas verdes de las plantas
mencionadas anteriormente y las cáscaras de los limones fueron secadas al aire en un
espacio cerrado a temperatura ambiente (25ºC).
3.1.2. Extracción de los AEs: La extracción se realizó por hidrodestilación en un aparato
extractor por arrastre de vapor tipo Clevenger (figura 4), durante 2 horas. Brevemente el
material vegetal se colocó en una caldera con un doble fondo perforado; el vapor de agua
penetra en la cámara en la que se encuentra el material, arrastra las sustancias volátiles
(esencias) y conjuntamente se condensan, al hacer contacto con un refrigerante de doble
camisa. La emulsión obtenida fue enfriada a 4ºC y centrifugada a 3000 RPM.
Posteriormente, la fase superior (AEs) fue extraída con una pipeta Pasteur de vidrio. El AE
obtenido fue secado con NaSO4.anhidro, colocado en viales de vidrio color caramelo con
tapa de teflón y almacenados en freezer a –18ºC para evitar reacciones oxidativas que
puedan alterar su composición.
3.1.3. Identificación y cuantificación de los componentes de los AEs: Los AEs fueron
analizados en un cromatógrafo de gases Shimatzu GC-R1A con detector de ionización de
llama (FID). La separación se realizó con una columna capilar de sílica CBP-1 (30 m x
0,25 mm i.d.) 100% de dimetilpolisiloxano. La temperatura de la columna fue programada
desde los 60 ºC a los 240ºC con una rampa de 4ºC/minuto. Las temperaturas del inyector y
detector fueron de 270ºC. El gas transportador fue el N, a un flujo de 1mL/minuto. El área
24
Materiales y métodos
de los picos fue cuantificada por integración electrónica. Las cantidades relativas de los
componentes individuales se basaron en el área de los picos obtenidos, sin factor de
corrección. Los compuestos fueron determinados, por comparación de los tiempos de
retención con respecto a estándares puros de n-alcanos (Zunino et al., 1998).
1.
Condensador de doble efecto
2.
Cabezal de destilación
3.
Tapa móvil
4.
Tablero de comando
5.
Cámara de extracción
6.
Grilla soporte
7.
Balón generador de vapor
8.
Estructura autoportante
9.
Calefactor eléctrico
10. Soporte de apertura de
cámara de extracción
11.
Junta sándwich de la unidad
calefactora
Figura 4: Extractor por arrastre de vapor tipo Clevenger
25
Materiales y métodos
La cromatografía gaseosa - espectrometría de masa (GC-MS) fue realizada en un
equipo Perkin Elmer Q-910 usando una columna capilar cubierta con CBP-1 de 30 m x
0,25 mm. La temperatura de la columna y la del inyector fueron las mismas utilizadas para
la cromatografía gaseosa. El gas transportador fue He, a un flujo de 1mL/minuto. El
espectro de masa fue registrado a 70 eV. Los componentes fueron identificados por
comparaciones de sus tiempos de retención con aquellos de muestras auténticas, por
comparación de sus espectros de masa con respecto a aquellos de la librería de espectros de
masa del Instituto Nacional de Tecnología y Estándares (NIST 3.0) y otra librería de
espectros de masa y tiempos de retención de los compuestos volátiles (Adams, 1995).
3.1.4. Determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM): Se realizó por el
método de susceptibilidad a antifúngicos en medio semisólido (SAAS) Método semicuantitativo (Provine & Hadley, 2000). Para este ensayo se utilizó como medio caldo
infusión de corazón con el agregado de 0,5% de agar (medio semisólido). El medio fue
disuelto en agua ultra pura, fraccionado en alícuotas de 5 mL en tubos de vidrio de 16 x
125 mm y esterilizado en autoclave a 121ºC durante 15 minutos, con un pH final
aproximado de 7,4. En condiciones de esterilidad, se le incorporaron los AEs, para obtener
10, 20, 40, 50, 100, 200, 250, 500, 1000 y 1500 µl/l como concentración final y el DMSO
(puro en el control y como vehículo de los AEs) en la concentración más alta utilizada para
disolver los AEs. A continuación, se repitió el mismo esquema reemplazando el DMSO
por etanol. Para añadir la sustancia problema, inmediatamente a la esterilización, los tubos
con el medio se enfriaron en baño termostatizado a 45 – 50ºC y se agregaron los AEs,
posteriormente se almacenaron a 4ºC hasta su utilización. Además 5 tubos con el medio de
cultivo puro, sin ningún agregado, fueron utilizados como control positivo y 3 tubos
análogos, como controles de esterilidad (control negativo).
El inóculo se elaboró según la técnica descripta por Pujol et al. (1996) donde la cepa de
Fusarium verticillioides MRC 826 fue cultivada en placas de Petri de 90 mm de diámetro
con 15 mL de agar V8 e incubadas a 27ºC durante siete días. Las placas con la cepa fúngica
desarrollada, fueron inundadas con una solución acuosa estéril de Tween 80 (2,5 %) y su
superficie fue frotada con una espátula de Drygalsky con el objeto de remover el desarrollo
fúngico. La suspensión resultante fue extraída con una pipeta Pasteur de vidrio estéril y
transferida a un tubo cónico, el cual fue vigorosamente agitado en un vortex durante 15
26
Materiales y métodos
segundos. La suspensión fue ajustada espectrofotométricamente con la adición de la
solución estéril de Tween 80 hasta obtener un 95% de transmitancia a 530 nm. La
inoculación se realizó con un ansa de aro de 10 µL, insertando el inóculo hasta el fondo del
tubo que contiene el medio con el compuesto a evaluar, para obtener un desarrollo
bidimensional. Sobre el medio de cultivo inoculado se aplicó 0,5 mL de aceite mineral con
el objeto de evitar la esporulación y el desarrollo fúngico sobre la superficie como se
observa en la figura 5. Para verificar la pureza y la viabilidad de la cepa empleada, se
realizaron estrías sobre placas de Petri con agar papa dextrosa utilizando el ansa con la cual
se realizaron los inóculos. Los tubos inoculados, se incubaron hasta un buen desarrollo
aparente en el medio control (48- 72 horas). Para determinar el nivel de inhibición se
comparó a todos los tratamientos con el control (control +) y el desarrollo fue calificado de
la siguiente manera: 4+ desarrollo comparable con el control, 3+ aproximadamente el 75%
del control, 2+ el 50%, 1+ 25% de desarrollo o menos, con respecto al control y “0” sin
desarrollo visible. En el caso de los hongos filamentosos la inhibición del desarrollo de un
75% o más (1+) determina la CIM.
3.1.5. Infección fúngica en maíz: Para los experimentos de toxicogénesis de Fusarium
verticillioides en maíz, se colocaron las semillas en estufa de secado a 45ºC hasta obtener
peso constante, a continuación se colocaron 20 g de maíz en un Erlenmeyer de 100 mL de
capacidad y con el agregado de agua destilada, se ajustó la humedad a 35 %.
Posteriormente se esterilizó por autoclavado a 121°C durante 15 minutos, dos días
consecutivos. El maíz estéril fue inoculado con 200 uL de la suspensión fúngica y se
incubó a 27°C en oscuridad, realizando una homogenización manual diaria durante los
primeros cinco días. Al sexto día el contenido de cada frasco se transfirió, en esterilidad, a
una cápsula de Petri, formando una monocapa según Torres et al (2003) dejando un
espacio suficiente en el centro de la placa para colocar el disco de 6 mm de diámetro. Las
sustancias a probar fueron incorporadas a los 17, 20 y 23 días posteriores a la inoculación
para observar si una concentración conocida de AEs tenía efecto sobre la producción de
FB1. El AEO y los terpenos, timol y terpineol fueron diluidos previamente en etanol
absoluto calidad HPLC. El AEO se aplicó en concentraciones de 20 y 30 ppm, mientras
que los terpenos se aplicaron a concentraciones de 4 y 6 ppm, manteniendo la proporción
en la que se encuentran en el AEO (21% del aceite de origen). Posteriormente se
impregnaron los discos de papel (Wattmann 3) para facilitar su difusión, y las placas fueron
27
Materiales y métodos
introducidas en una cámara húmeda a 27ºC durante 28 días, condiciones óptimas para la
producción de fumonisinas.
Figura 5: Esquema de la marcha metodológica para la determinación de la CIM con el método SAAS.
3.1.6. Animales: Para los estudios de intoxicación experimental se utilizaron ratas Wistar
machos, de 6-8 semanas de edad al comienzo de la administración de AEO y FB1. Los
animales fueron puestos de a pares en las jaulas, y se mantuvieron en el bioterio del
Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas, UNC, durante todo
el período de experimentación.
3.1.7. Obtención de FB1 para alimentar los animales: La obtención de FB1 se realizó
colocando 300 g de maíz en Erlenmeyers de 1L, se ajustó la humedad a 35% con el
agregado de agua destilada, y posteriormente se esterilizó por autoclave a 121°C durante 15
minutos por dos días consecutivos. El maíz estéril fue inoculado con tacos de micelio de
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Materiales y métodos
Fusarium verticillioides MRC 826 en etapa de crecimiento activo, obtenido a partir de un
cultivo desarrollado en agar V8. Las condiciones de agitación, incubación y extracción de
FB1 se desarrollaron de la misma manera que en el apartado 3.1.5. La separación y
purificación se realizó de acuerdo a la metodología propuesta por Voss et al. (1990). Al
final del período de incubación, el maíz fue inactivado por autoclave y secado durante 24
horas en estufa de aire forzado a 60°C. La extracción y conservación de la FB1 se describen
en el apartado 3.1.8.
3.1.8. Preparación de extractos acuosos de FB1: Al final del período de incubación, el
maíz fue esterilizado por autoclavado y secado en estufa a 60°C durante 48 horas.
Posteriormente se molió en un molino de rodillos y fue cribado en tamiz de malla de acero
inoxidable hasta obtener partículas < 2 mm. La extracción de FB1 se realizó mediante
extractos acuosos en una relación 1:3 (1 parte de muestra + tres partes de agua tridestilada),
peso en volumen, en un agitador orbital durante 2 horas a 200 RPM. Luego de decantar y
filtrar los extractos, la fase líquida fue almacenada a -18°C hasta su cuantificación por
HPLC o para la preparación de las dietas. La separación y purificación de FB1 a partir del
maíz fermentado se realizó de acuerdo a la metodología propuesta por Voss et al. (1990).
3.1.9. Cuantificación de FB1: Se tomaron alícuotas de los extractos acuosos de FB1 y
fueron diluidas con volúmenes iguales de acetonitrilo grado HPLC. La cuantificación de
los extractos fue realizada siguiendo la metodología propuesta por Shephard et al. (1990).
Una alícuota (50 µL) de los extractos diluídos fue derivatizada con 200 µL de una solución
de O-ftaldialdehído (OPA) obtenida por el agregado de 5 mL de Na2B4O7 0,1 M y 50 µL de
2-mercaptoetanol, a 40 mg de OPA disuelto en 1 mL de metanol. La FB1 fue detectada y
cuantificada utilizando un HPLC Hewlett Packard 1100 con detector de fluorescencia. Las
λ utilizadas fueron 335 y 440 nm para excitación y emisión, respectivamente. La
separación de los componentes del extracto fue realizada en una columna C18 (150 mm x
4,6 mm; tamaño de partícula de 5 µm), conectada a una pre-columna C18 (20 mm x 4,6
mm; tamaño de partícula de 5 µm). Como fase móvil se utilizó una solución de
metanol:NaH2PO4 0,1M (75:25) y pH 3.35 ± 0.02, ajustado con ácido orto-fosfórico, y un
flujo de 1,5 mL/min. La cuantificación de la toxina se realizó mediante una curva de
calibración realizada con estándares de 2,625; 5,250 y 10,500 µg FB1/mL. (PROMEC,
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Materiales y métodos
Programme on Mycotoxins and Experimental Carcinogenesis, Tygerberg, República de
Sudáfrica).
3.1.10. Determinación de ergosterol: Se realizó mediante la técnica de extracción asistida
con microondas (MAE) según Young (1995). El maíz fermentado se secó a 60ºC en una
estufa de aire forzado durante 72 horas. Las semillas se molieron y se tomó una alícuota de
25 mg finamente molido (tamizado con malla de 40 µm de poro). Posteriormente fue
colocado en un tubo de cultivo de 17 mL al que se le agregó 2 mL de metanol y 0,5 mL de
hidróxido de sodio 2 M en solución acuosa. Los tubos fueron colocados en un microondas
doméstico de 2450 MHz y a 750 W de potencia máxima, calentando la muestra al 50% de
potencia dos veces por un lapso de 20 segundos, con un intervalo entre cada calentamiento,
de 15 minutos. Luego de que la muestra tomara temperatura ambiente, el contenido fue
neutralizado con ácido clorhídrico 1M. El ergosterol fue extraído con n-pentano (3 x 2ml)
agitando en vortex por 30 segundos. Luego de la separación de dos fases, la superior (npentano) se extrajo con pipeta Pasteur, se evaporó hasta sequedad y se resuspendió en 1 mL
de metanol para su posterior análisis. El ergosterol se detectó en un HPLC Hewlett Packard
con detector UV-VIS. El λ utilizada fue de 282 nm. La columna utilizada fue ODS 3µm de
acero inoxidable (CSC, Montreal, PQ). La fase móvil utilizada fue acetonitrilo/metanol
(80:20) con un flujo de 1,3 mL /minuto. La confirmación se realizó por comparación del
tiempo de retención relativo del estándar corrido bajo idénticas condiciones y por coinyección con el estándar (Fluka).
3.1.11. Estudio de la viabilidad de las semillas: 1000 g de semillas de maíz previamente
seleccionadas, sin daño físico, fueron desinfectadas, sumergiéndolas 5 minutos en una
solución de hipoclorito de sodio comercial al 0,5%. Luego se enjuagaron con agua
destilada estéril y se secaron con papel tissue estéril. Posteriormente se colocaron 20 g en
placas de Petri formando una monocapa y se sometieron simultáneamente al mismo
esquema de tratamiento expuesto en el apartado 3.1.5. excepto que las semillas no fueron
infectadas.
El día 29 las cápsulas de Petri se retiraron de la cámara y se seleccionaron 8 semillas al
azar de cada placa. Éstas se colocaron en forma radial en una placa de Petri sobre 10 mL de
30
Materiales y métodos
agar-agua al 0,4% estéril, observándose la aparición de la radícula en el día 1, 3 y 5
posterior al montaje de la semilla sobre el soporte semisólido de agar.
3.1.12. Alimento balanceado comercial: Alimento balanceado rata-ratón Cargill S.A.C.I.,
libre de AFB1 y FB1. Proteínas >24%, extracto etéreo >6%, fibra dietaria >7%, calcio >1%,
fósforo >0,5%, humedad <13%, minerales totales <8%, valor energético > 2780 kcal/kg.
3.1.13. Dieta experimental control (DEC): Se preparó agregando 435 mL de extracto
acuoso de maíz no inoculado con F. verticillioides a una solución de agar (Difco) en 435
mL de agua destilada. La mezcla se calentó hasta disolución completa del agar, se dejó
enfriar hasta 50°C, y se agregaron 75,4 µL de aceite de oliva. Luego de mezclar
enérgicamente, se incorporaron 1000 g de alimento balanceado comercial finamente
molido, obteniéndose una mezcla homogénea. Se moldearon piezas cilíndricas de
aproximadamente 20 g cada una, y luego del enfriamiento y solidificación el alimento fue
conservado a -18°C hasta su utilización.
3.1.14. Dieta experimental con FB1 (DEFB1): Se realizó de la misma manera que la
DEC, ajustando la cantidad de FB1 con diferentes proporciones de extracto acuoso de FB1
y extracto acuoso de maíz sin inocular. La concentración final de FB1 en el alimento fue de
100 ppm.
3.1.15. Dieta experimental con FB1 y AEO (DEM): Se preparó siguiendo la misma
metodología que la DEC, agregando 30 µL de AEO disuelto en aceite de oliva; y ajustando
la cantidad de FB1 con diferentes proporciones de extracto acuoso de FB1 y extracto acuoso
de maíz sin inocular. Las concentraciones finales de AEO y FB1 fueron de 30 ppm y 100
ppm, respectivamente.
3.1.16. Consumo de alimentos, peso corporal, ganancia de peso corporal, y consumo
de FB1: La determinación de los parámetros nutricionales fue realizada teniendo en cuenta
las especificaciones existentes en la bibliografía (Wilson et al., 2001). El consumo diario
de alimentos se calculó por diferencia entre el peso de las cantidades suministradas y el de
las retiradas a las 24 horas posteriores. El peso corporal se determinó semanalmente usando
31
Materiales y métodos
una balanza Ohaus, Florham Park, NJ, USA, con una precisión de 0,05 g. La ganancia de
peso corporal se calculó por diferencia de pesos de los animales a los 30, 60 y 90 días de la
intoxicación, con respecto al peso registrado en el mes anterior. El consumo total de FB1 se
determinó a los 30, 60 y 90 días, teniendo en cuenta el consumo de alimentos de cada
animal, la ganancia de peso corporal durante los 30, 60 y 90 días, y la concentración de FB1
en el alimento, de acuerdo a las siguientes fórmulas matemáticas:
Consumo de toxina
(mg FB1/kg peso corporal/día)
[Toxina]
= (mg toxina/kg alimento)
Consumo de alimentos (kg) en X días
CRA
=
(kg/kg/día)
X días
+
x
[
Consumo relativo de alimentos (CRA)
(kg alimento/kg peso corporal/día)
Peso corporal (kg)
(día 0)
+
Ganancia de peso
en X días (kg)
2
]
3.17. Determinaciones bioquímicas: Se determinaron los niveles de colesterol total,
triglicéridos, calcio total, y las actividades enzimáticas aspartato aminotransferasa (AST),
alanino aminotransferasa (ALT), gamma glutamil transpeptidasa (GGT) y fosfatasa alcalina
(FAL); en sueros obtenidos por punción intracardíaca al final del período de intoxicación.
Las determinaciones fueron realizadas con un autoanalizador Technicon RA-1000.
3.18. Estudios histopatológicos: Al final del esquema de alimentación con las diferentes
dietas experimentales, se tomaron muestras de esófago, intestino delgado, hígado, pulmón
y riñón. Los tejidos fueron inmediatamente fijados con una solución de formaldehído 4%
en buffer fosfato de pH 7,4. Las muestras se incluyeron en parafina y se realizaron cortes
de 4 µm de espesor. Finalmente, se realizó el estudio histopatológico en los tejidos
coloreados mediante la técnica de hematoxilina y eosina.
3.19. Análisis estadístico: Se utilizó el software Instat (Instat, San Diego, CA). El análisis
estadístico de los datos fue realizado mediante análisis de varianza de una vía (ANOVA), y
test de comparaciones múltiples de Bonferroni.
32
Materiales y métodos
Para los estudios de inocuidad del vehículo la comparación entre los grupos se hizo
mediante el test de Tukey-Kramer. En todos los casos, las diferencias fueron consideradas
significativas para p < 0.05.
33
Materiales y métodos
3.2. MEDIOS DE CULTIVO
3.2.1. Agar agua: Se preparó una solución de agar-agar al 2% en H2O destilada. Luego de
la disolución del agar en baño de H2O, el medio de cultivo fue esterilizado por autoclave a
121 °C durante 15 minutos.
3.2.2. Agar hojas de clavel: El estudio microscópico de Fusarium verticillioides MRC
826 fue realizado en colonias crecidas en agar-agar (2% en H2O destilada), con el agregado
de hojas, en etapa de crecimiento activo de clavel blanco.
3.2.3 Agar papa: Se utilizó para el estudio de las características culturales de F.
verticillioides MRC 826. El medio fue preparado disolviendo 20 g de agar agar en 500 mL
de H2O destilada. Luego de la disolución del agar se agregaron 250 mL de una solución
obtenida mediante el filtrado del líquido de cocción, en el que se habían hervido 250 g de
papas blancas cortadas en trozos pequeños. Se agregó 10 g de las papas hervidas, y
posteriormente el medio de cultivo fue esterilizado por autoclave durante 15 minutos a 0,8
atmósferas.
3.2.4. Agar semisólido de infusión de corazón: Se utilizó para cuantificar el desarrollo de
F. verticilliodes en un medio semisólido en profundidad, con el objeto de limitar el
desarrollo a un sistema bidimensional (realizado en tubos de ensayo). El medio fue
preparado disolviendo 35 g de polvo de infusión de corazón y 5 g de agar - agar en 1000
mL de agua destilada, se disolvió en agitador magnético con calentamiento hasta
disolución completa y se fraccionó en tubos de ensayos. Posteriormente se esterilizó por
autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
3.2.5. Agar V8: Se utilizó para el desarrollo de F. verticillioides MRC 826, previo a la
inoculación del maíz. El medio de cultivo fue preparado mediante disolución de 180 mL de
jugo comercial V8, 2 g de CaCO3, y 15 g de agar-agar; en 850 mL de H2O destilada. La
esterilización se realizó por autoclave a 121°C durante 15 minutos.
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