laboratorio-medios-de-cultivo

DUOC UC
Escuela de Recursos Naturales
Ingeniería (E) Agronomía
Fisiología Hortícola
Angela Blanco B.
Laboratorio 4: Cultivo in vitro
Preparación Medios de Cultivo
Introducción
El medio de cultivo es la combinación sólida o líquida de nutrientes y agua.
Usualmente incluye sales inorgánicas, carbohidratos, vitaminas y aminoácidos. A
menudo se denomina Medio Basal y puede ser suplementado con algún regulador de
crecimiento y ocasionalmente con otras sustancias varias.
Los nutrientes son esenciales para el crecimiento y desarrollo de la planta: sin
agua y nutrientes minerales una planta no puede vivir ni in vitro ni in vivo. También se
debe añadir azúcares al medio de cultivo, ya que las plantas (o sus fragmentos) no son
completamente autotróficas cuando se desarrollan en estas condiciones.
Tabla 1. Conjunto de sustancias que pueden formar parte de los medios nutritivos, para inducir el
crecimiento y desarrollo (Pierik, 1987, modificado).
Necesidades nutricionales y hormonales de los cultivos de órganos y tejidos vegetales
Agua
Sustancias orgánicas
Azúcares
Aminoácidos
Auxinas
Citoquininas
Giberelinas
Acido abcísico
Macro
Micro
elementos
N
P
K
Ca
Mg
S
Fe
Zn
B
Mn
Cu
Ni
Co
Al
Mo
I
Los requerimientos nutritivos para un crecimiento in vitro óptimo varían con la
especie, e incluso son específicos de acuerdo a la parte de la planta que se esté
cultivando y a la respuesta que se desea obtener. Debido a estas necesidades específicas
se han desarrollado muchas formulaciones para los medios de cultivos.
El medio MS, o de Murashige y Skoog (1962), es muy usado, particularmente si
el objetivo es regenerar plantas; existen numerosas variaciones comerciales de este
medio.
El medio B5 o de Gamborg et al. (1968), o sus varios derivados, ha sido de un
gran valor en el cultivo de células y protoplastos, y también es utilizado eficazmente en
regeneración de plantas. La diferencia principal entre los medios MS y B5 es la menor
concentración de nitratos en B5.
El medio WPM (1980) de baja concentración de sales está especialmente
indicado para especies leñosas.
Una vez escogida la formulación del medio de cultivo, se procede a su
preparación
Ya que las cantidades a ocupar de macro, micronutrientes, hierro y vitaminas
son bastante pequeñas, sería bastante lento e impreciso tener que pesarlas cada vez que
se prepara un medio. Es una práctica habitual en todos los laboratorios preparar
soluciones stock concentradas de los distintos componentes, agrupados de forma que no
se produzcan fenómenos de precipitación.
Para ello, se realizan cuatro soluciones stock base para la preparación de medio
MS: macronutrientes (1), una de micronutrientes (2), una de hierro con un agente
quelante (3), otra de vitaminas y mioinositol (4); así como con soluciones específicas
para los demás componentes del medio (reguladores de crecimiento, etc). Éstas pueden
mantenerse durante un cierto tiempo en refrigeración o congeladas.
Estas soluciones se agregan medidas con pipeta al momento de preparar el
medio, junto con la sacarosa.
Una vez obtenido el volumen de medio deseado se procede a ajustar su pH al
valor prefijado mediante la adición de NaOH y/o HCl 0.1-1 N. A continuación,
dependiendo de que se vaya a preparar un medio sólido o líquido, se añadirá en el
primer caso el agente solidificante (agar), se fundirá por calentamiento breve para,
finalmente, ser dosificado en los contenedores adecuados. En el caso de tratarse de un
medio líquido se procederá a dosificar directamente en los contenedores escogidos.
Para ambos tipos de medios a continuación se autoclavan en los contenedores
(generalmente a 121ºC durante 20 minutos).
Conviene tener en cuenta que algunos de los componentes del medio de cultivo
pueden ser termolábiles (algunas vitaminas, algunos reguladores, etc). En este caso, la
esterilización de la solución que contienen la substancia termolábil debe hacerse por
filtración y añadirse una vez esterilizada al medio de cultivo previamente esterilizado y
parcialmente enfriado (en medios sólidos) o totalmente (en medios líquidos)
Figura 1: Descripción preparación medios de cultivo
Preparación del Medio de Cultivo
Objetivos:
Preparar medio de cultivo in vitro para luego iniciar uno.
Materiales:
Por grupo:








1 Frasco para preparar medio o matraz
láminas de polipropileno de 10x10 cms
elásticos
pinzas largas
vasos precipitados
placas petri
bolsas papel kraft
frascos de colados
General:












Medio MS
Agar
Azúcar
agua destilada con baja conductividad eléctrica
papel toalla
alcohol 70% con rociador
revolvedor magnético
"pescadito"
microondas
balanza analítica
autoclave
Probeta de 500ml
Procedimiento:
Preparación de medio MS a partir de mezcla comercial
Para la obtención de 100ml de medio de cultivo MS:








Poner en un erlenmeyer 50ml de agua destilada
Agregar 0,443g de medio MS comercial
Añadir 3g de sacarosa y agitar hasta que se disuelva completamente.
Verter el contenido en una probeta de enrasar a 100ml
Devolver la solución preparada al erlenmeyer, agitar y ajustar el pH para que se
encuentre entre 5,7-5,8.
Añadir 0,7g de agar, agitar y calentar la solución en el microondas hasta que el
agar quede disuelto.
Verter el contenido en los recipientes de cultivo
Cerrar frascos con lámina de polipropileno y elástico
Esterilización de herramientas



Colocar las pinzas en una bolsa de papel kraft y cerrarla
Colocar placas petri en bolsas de papel kraft y cerrarlas
Colocar agua destilada en vasos precipitados y sellarlos con láminas de
polipropileno y elásticos
Esterilizar todo en autoclave (20 minutos a 121 ºC).