Estimación de la Vida de Anaquel de la Carne Luis Humberto López Hernández Diego Braña Varela Isabel Hernández Hernández Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Fisiología y Mejoramiento Animal. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Ajuchitlán, Colón, Querétaro Libro Técnico No. 11 Octubre de 2013 ISBN: 978-607-37-0092-4 DIRECTORIO INSTITUCIONAL SECRETARIA DE AGRICULTURA, GANADERÍA, DESARROLLO RURAL, PESCA Y ALIMENTACIÓN LIC. ENRIQUE MARTÍNEZ Y MARTÍNEZ Secretario LIC. JESÚS AGUILAR PADILLA Subsecretario de Agricultura PROF. ARTURO OSORNIO SÁNCHEZ Subsecretario de Desarrollo Rural LIC. RICARDO AGUILAR CASTILLO Subsecretario de Alimentación y Competitividad DR. FRANCISCO JOSÉ GURRÍA TREVIÑO Coordinador General de Ganadería INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES, AGRÍCOLAS Y PECUARIAS DR. PEDRO BRAJCICH GALLEGOS Director General DR. SALVADOR FERNÁNDEZ RIVERA Coordinador de Investigación, Innovación y Vinculación MSc. ARTURO CRUZ VÁZQUEZ Coordinador de Planeación y Desarrollo CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN DISCIPLINARIA EN FISIOLOGÍA Y MEJORAMIENTO ANIMAL DR. CÉSAR AUGUSTO MEJÍA GUADARRAMA Director ESTIMACIÓN DE LA VIDA DE ANAQUEL DE LA CARNE Luis Humberto López Hernández Diego Braña Varela Isabel Hernández Hernández Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Fisiología y Mejoramiento Animal. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Macroproyecto “Indicadores de calidad en la cadena de producción de carne fresca en México” con registro y fondos de SAGARPA-CONACYT No. 109127. Libro Técnico No. 11 ISBN: 978-607-37-0092-4 Ajuchitlán, Colón Querétaro. Octubre de 2013. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias Progreso No. 5, Barrio de Santa Catarina Delegación Coyoacán C.P. 04010 México, D.F. Tel (55)38718700 ISBN: 978-607-37-0092-4 Editor M. en B. Luis Humberto López Hernández Primera Edición, Octubre 2013 No está permitida la reproducción total o parcial de esta publicación, ni la transmisión de ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrónico, mecánico, fotocopia, por registro u otro método, sin el permiso previo y por escrito de la Institución. Contenido 1.- Introducción 1 2.- Vida de anaquel de la carne 2 3.- Conservación de la carne 5 4.- Las características iniciales de la carne, dictan la vida de anaquel 10 4.1.- Defectos de calidad en la carne 14 4.2.- La grasa en la carne 17 4.2.1.- La rancidez en la carne (Oxidación de lípidos) 4.3.- El color en la carne 18 20 5.- Relevancia de la nutrición animal en la vida de anaquel de la carne 25 6.- Alternativas de empaque en la preservación de la carne 27 6.1.- Ambiente con atmósferas controladas 30 6.2.- Empacado en atmosferas modificadas 31 6.3.- Envasado al vacío “segunda piel” 33 6.4.- Envases activos e inteligentes 35 6.5.- Recubrimientos y películas comestibles 36 6.6.- Puntos a considerar para evaluar la eficiencia de empaques 39 7.- ¿Cómo predecir la vida de anaquel de la carne? 42 7.1.- Biblioteca de datos 42 7.2.- Durante la distribución 43 7.3.- Pruebas de distribución en condiciones extremas 43 7.4.- Departamento de Quejas-Calidad 44 7.5.- Vida en Anaquel 44 7.6.- Pruebas Aceleradas 45 7.6.1.- Prueba acelerada Q10 7.7.- Clasificación de los modelos predictivos 48 50 7.7.1.- La carne y la microbiología predictiva 50 7.7.2.- Modelos cinéticos y probabilísticos 56 7.7.2.1.- Modelo de Gompertz 60 7.7.2.2.- Modelo Logístico 62 7.7.2.3.- Modelo de Arrhenius 64 7.7.2.4.- Modelo de Superficie de Respuesta 64 7.7.3.- Modelos mecanicistas 66 7.8.- Métodos para estimar vida de anaquel mediante Análisis Sensorial 67 7.9.- Validación de los modelos 69 8.- Referencias 71 1. Introducción Desde tiempos prehistóricos, la conservación de la carne ha sido una preocupación que ha estimulado la creatividad y el conocimiento. Esto llevó a nuestros ancestros a desarrollar diversos sistemas de procesado como el salado, ahumado, congelado, etc. Hoy en día, el reto principal, es el poder conservar la carne fresca (aquella que no ha sido sometida a ningún proceso que modifique de modo irreversible sus características sensoriales y físico-químicas, salvo la refrigeración y el envasado), por el mayor tiempo posible. Para la cadena de distribución de consumo de carne fresca, una alternativa para hacer más rentable y eficiente su negocio, es el aumento en la vida de anaquel. Esto es, extender en el tiempo las características organolépticas y de inocuidad de la carne, que la hagan aceptable por parte del consumidor. Lo anterior depende principalmente de las características fisicoquímicas, microbiológicas y organolépticas que tenga al inicio de su vida útil. Mientras mejor es la materia prima con que se inicien los procesos, mayor tiempo de vida de anaquel tendrá un producto. Estos parámetros iniciales son aspectos objetivos y cuantificables, que nos ayudan a predecir cuál será la vida útil de la carne, en función de los sistemas de conservación empleados. Figura 1. Carne de cerdo en anaquel refrigerado (foto obtenida de http://www.educacioncontracorriente.org). 1 En este manual, se tiene como objetivo dar a conocer las herramientas y técnicas de análisis de laboratorio más comunes para estimar, de forma objetiva, la vida de anaquel en carne fresca; además, se hace una revisión de los factores claves para la conservación, y de los que actúan en detrimento de las propiedades sensoriales como son el color, el olor y la estabilidad lipídica; las alternativas más modernas en sistemas de modificación de atmósferas y empacado de cárnicos, para terminar con una sección sobre sistemas de evaluación y predicción de la vida de anaquel. 2. Vida de anaquel de la carne El deterioro de los alimentos se produce por diversos cambios, principalmente en respuesta al crecimiento y metabolismo de microorganismos, la exposición, la cantidad y tipo de luz que recibe la carne, la oxidación de lípidos y pigmentos, etc. Lo interesante es que la gran mayoría de los cambios son normalmente percibidos por el consumidor mediante el uso de sus sentidos (vista, olfato, gusto, tacto y oído). Cuando el consumidor rechaza el producto, porque considera que sus características lo hacen inaceptable o porque pone en riesgo su salud, se dice que ha llegado al final de su vida de anaquel o vida útil. Existen diversas definiciones (Davies, 1995; Brody, 2001; Coma 2006; Eilert, 2005) sobre lo que implica la vida de anaquel, la mayoría incluye conceptos como el “preservar la calidad y asegurar el bienestar del consumidor”. A continuación se enuncian algunos ejemplos: “Período en el que un alimento almacenado bajo condiciones óptimas preestablecidas, mantiene características sensoriales y de seguridad aceptables para el consumidor”. “Periodo de tiempo bajo condiciones de almacenamiento conocidas, posterior a la manufactura y envasado de los alimentos. Durante este tiempo deberá conservar sus características de calidad sensorial, química, física, funcional o microbiológica, cumpliendo con todas las declaraciones de contenido nutrimental que aparecen en su etiqueta, cuando se almacena en condiciones adecuadas”. “El periodo entre la manufactura y venta al menudeo de un producto alimenticio, durante el cual el producto tiene una calidad satisfactoria”. 2 “La ventana de tiempo en la cual el alimento mantiene su calidad en sabor, textura y valor nutricional, la vida de anaquel está basada en la seguridad, calidad y nutrición”. “La determinada cantidad de tiempo en el que un producto alimenticio puede ser almacenado sin que se manifiesten cambios apreciables en su calidad o inocuidad”. Idealmente, todos los alimentos perecederos deberían declarar su vida de anaquel, indicando claramente la fecha de expiración en los empaques. Sin embargo, la vida de anaquel puede verse afectada por condiciones ajenas al producto, por ejemplo, por la temperatura ambiente en que fue conservado, rupturas en el empaque, exposición a la luz, etcétera (Marth, 1998). Esto hace necesario que el consumidor también sea responsable de su salud, razón por la cual debe de involucrar todos sus sentidos (el más rápido y sencillo laboratorio de determinación de calidad), en la decisión sobre consumir o no un determinado producto. Esta es la razón de la importancia que las pruebas sensoriales tienen en relación a la vida de anaquel. En términos generales, los factores que más influencia tienen sobre la vida de anaquel de la carne fresca y los productos cárnicos son: calidad del producto (pH, color, capacidad de retener agua, etc.), carga bacteriana inicial, temperatura, tiempo de almacenamiento y atmósfera en que es contenida la carne (Labuza y Fu, 2005; Tirado et al., 2005; Restrepo y Montoya, 2010). Cualquier falla en el control de alguno de estos factores, puede ser parcialmente compensada por el riguroso control de otro factor; la vida de anaquel óptima pudiera solamente ser alcanzada al controlar todos los factores en conjunto. Por esta razón se considera que para lograr una larga vida de anaquel se debe tener especial énfasis en los siguientes procesos: 1) Selección inicial del producto o materia prima: una vez muerto el animal del que provienen los productos cárnicos, la calidad sensorial de sus derivados frescos, solo tenderá a reducirse, ya que no se puede mejorar durante su almacenaje. Por lo que iniciar con un producto de buena calidad, es el primer paso para lograr una adecuada vida de anaquel. 3 2) Formulación: seleccionando las materias primas más apropiadas, con cargas microbianas específicas (mínimas) y dentro de normativas, así como del uso de ingredientes funcionales que aseguren la integridad del alimento. 3) Procesamiento: asegurando la disminución de operaciones alimentarias que modifiquen las propiedades inherentes de la materia prima o producto terminado, teniendo especial énfasis en evitar contaminaciones microbianas cruzadas. 4) Empaque: considerando la forma y destino final del producto, se seleccionará el empaque adecuado, particularmente que logre reducir el impacto negativo del ambiente (cambios bruscos de temperatura o humedad), así como las diferentes contaminaciones fisicoquímicas (por ejemplo, de olores o sustancias ajenas), y microbiológicas. 5) Condiciones de transporte y almacenamiento: considerando el adecuado seguimiento de la cadena de frío desde almacén de materias primas, almacén de producto terminado, distribución, venta, e incluso las condiciones a las que será expuesto durante el transporte y el almacenamiento en el hogar. Por supuesto, la vida de anaquel está en función directamente proporcional, al esfuerzo invertido en los procesos. En la medida en que se tienen mayores esfuerzos, se pueden lograr mayores vidas de anaquel. Por ejemplo, de dos cerdos criados en la misma granja (idéntica materia prima), uno de ellos sacrificado en un rastro TIF de exportación, puede lograr una vida de anaquel superior a 60 días; mientras que su hermano, procesado en un rastro de mala calidad, escasamente tendrá una vida de anaquel superior a 1.5 días. Es claro que el entendimiento y la estimación de la vida de anaquel, son aspectos relevantes para poder tener una adecuada comercialización de los productos perecederos. Esta vida debe al menos exceder el tiempo mínimo requerido de distribución del productor al consumidor. La capacidad de predicción que se tenga, permitirá a los industriales evitar pérdidas por devoluciones, y establecer una correcta inteligencia de mercados, sustentada en la calidad del producto y en la confianza del consumidor (Rodríguez, 2003). 4 Figura 2. Tecnología en la comercialización de carne fresca (temperatura a 1C, atmosfera modificada, envoltura impermeable al oxígeno, almohadilla para absorber escurrimientos, luz roja especial para resaltar el color pero sin promover la oxidación de pigmentos y grasas en la carne (foto obtenida de http://www.Carnetec.com/Industry/TechnicalArticles/Details/813) 3. Conservación de la carne Algunas teorías evolucionistas consideran que el consumo de alimentos ricos en proteína, energía y minerales, como lo son las carnes, fue uno de los factores clave que permitió la evolución del cerebro humano. Pero el tener acceso frecuente a esta carne, muchas veces era imposible de no contar con métodos que ayudaran a preservarla por algún tiempo (Davies, 1995). Esta necesidad, promovió el desarrollo de métodos de conservación como la salazón (en seco o salmuera), el ahumado (en frío o caliente), etcétera. Esto porque nuestros antepasados entendieron que tanto el salado, como la desecación o la deshidratación, disminuyen el contenido de agua de los alimentos y modifican su percepción sensorial. Gracias a esto, la cantidad de agua del alimento que queda disponible para los microorganismos se reduce hasta tal punto, que los microorganismos quedan inactivos o mueren (Marth, 1998). Otros métodos que limitan el desarrollo de bacterias y hongos, es la adición de nitratos, compuestos bactericidas del humo, o los presentes en algunas plantas o semillas (albahaca, orégano, pimienta, etc.). 5 La fermentación es igualmente un método tradicional, que favorece la conservación de alimentos (los embutidos fermentados), donde por competencia, o por la producción de compuestos derivados de su metabolismo (por ejemplo, el ácido láctico o ciertas bacteriocinas) grupos de microorganismos excluyen el crecimiento de otros (Aberle, 2002). Desde finales del siglo XIX, el principal método de preservación de la carne a largo plazo, ha sido la congelación a -20ºC; mientras que para períodos de tiempo cortos, se prefiere la refrigeración a temperaturas entre 0 y 4ºC. El mantenimiento de la cadena de frío se hace para salvaguardar la seguridad de los consumidores y la protección de la salud pública (Eilert, 2005). Esto se logra por la desaceleración de reacciones enzimáticas propias de la misma carne, así como por la reducción del daño microbiano y/o contaminación biológica, puesto que la temperatura baja, reduce importantemente la replicación de la mayoría de los microorganismos, quienes son los responsables de la aparición del limo superficial, desarrollo de olores desagradables, así como de producir enfermedades, ya sea por la presencia particular de algunas de las bacterias como la Salmonella, o de toxinas microbianas derivadas de su metabolismo como las producidas por el Staphylococcus aureus (Arinder y Borch, 1999; Baranyi et al., 1993 a y b). El efecto de la temperatura de almacenado es tan importante, que puede resultar en importantes modificaciones en la vida útil de producto. Se ha encontrado que la vida útil tiene una reducción considerable a medida que aumenta la temperatura. Estudios con carne de cerdo congelada en diversos empaques y almacenada por diferentes tiempos, consistentemente muestran que la gente prefiere la carne fresca. Esta percepción negativa hacia la carne congelada, puede mejorar cuando se emplean sistemas tecnificados de congelación, los cuales se basan en un adecuado y rápido congelado, lo que dificulta que el consumidor detecte diferencias cuando la consume (Jeremiah, 2007 a y b). Para reducir los efectos adversos asociados a la congelación y particularmente a los efectos negativos que se presentan durante el descongelado, se han desarrollado técnicas de ultracongelación, o congelación rápida. En éste método, se reduce rápidamente la temperatura del alimento mediante flujos de aire frío a alta velocidad, o por contacto con placas frías, por la inmersión en líquidos a muy baja temperatura, por ejemplo en nitrógeno líquido, etc. La ultracongelación es el método de conservación de largo plazo, que menos alteraciones provocan en el producto (Moore y Sheldon, 2003 a y b; Rokka et al., 2004). 6 La velocidad de congelado, puede afectar el color y la luminosidad de la carne. Esto se debe al tamaño de los cristales de agua que se forman dentro de la fibra muscular; cuando el congelado es ultra-rápido, se forman cristales muy pequeños de agua, los cuales dispersan la luz y por lo tanto la carne se ve más opaca y pálida. En cambio la carne congelada de forma lenta, forma cristales de mayor tamaño, y su carne tiene un color más traslucido y obscuro (Russell et al., 1996, Tolstoy, 1991; Young et al., 2005). El color de la carne al descongelarse, es muy inestable debido a la alta tasa de oxidación de los pigmentos, lo que se agrava con tasas lentas de congelamiento (Buege y Aust, 1978; Berge et al., 2005). Además, durante el congelado, la superficie de la carne puede comenzar a producir metamioglobina, por lo que adquiere un color café en la superficie, el cual permanece luego del descongelado. La decoloración que se observa en carne congelada, puede estar también asociada a la exposición continua a la luz (Faustman, 1990). La carne que puede estar almacenada sin cambios luego de 3 meses, puede perder su color natural en tan solo 3 días de exposición a la luz. Otro efecto negativo que reduce la vida de anaquel de la carne congelada, son las quemaduras por frío. Estas se asocian principalmente a problemas de deshidratación en la superficie, y son muy relevantes en carne expuesta al aire seco que circula a altas velocidades. Otra metodología cada día más difundida, es la modificación del ambiente que rodea a la carne, ya que al privar, por ejemplo, del oxígeno del aire a la carne, se puede evitar que las bacterias aerobias se reproduzcan; además al empacar la carne, se evita que ésta se contamine con la presencia de bacterias deteriorantes (Coma, 2006; Davies, 1995). Por ejemplo, una carne de buena calidad, que sea refrigerada sin empacar (expuesta al ambiente), tendría una vida de anaquel de 5 a 7 días; si esta misma carne, hubiera sido además empacada al vacío, su vida útil fácilmente se pudiera extender a 30 días, e incluso a temperaturas de 2ºC pudiera haber llegado a 50 días de vida útil. Más adelante, se consideran los sistemas modernos de empaque, tanto con atmósferas modificadas, como mediante el uso de empaques activos, interactivos o inteligentes. Estos son los métodos que en el futuro tendrán mayor impacto en la vida de anaquel de la carne, particularmente en la medida en que su uso se extienda y los costos se abaraten. 7 Una de las acciones que permitirá una comercialización más sana y eficiente de la carne, incluye la educación y concientización de la gente. Existen diversos problemas, asociados al hecho de que tanto vendedores, como consumidores, no toman en cuenta que los productos cárnicos son productos perecederos y, como tal, su vida de anaquel es corta. Ingenuamente, el problema se agrava cuando la gente busca comprar lo que consideran que es lo más fresco y recurren a la compra de “Carne Caliente”. En tiempos prehispánicos, ante la falta de métodos seguros de conservación de la carne, ésta se consumía en tiempos muy próximos a la muerte de los animales, on lo cual se prevenían infecciones gastrointestinales. Esto ya no es necesario puesto que existe la refrigeración. Lamentablemente, hoy en día seguimos viendo a gente que para asegurar la frescura de la carne en los mercados, busca la “carne caliente”, que es aquella proveniente de animales que normalmente tienen menos de 20 horas de haber muerto y que no fue sometida a un proceso de refrigerado. La carne caliente no ha terminado su proceso de conversión de músculo a carne, por lo que tiende a ser dura, con sabor a sangre y normalmente con cargas microbianas excesivamente elevadas, lo que se empeora por las pobres condiciones higiénicas de los establecimientos que la comercializan, y por el hecho de que mucha gente selecciona su carne luego de tocarla con la mano y así verificar que la carne no está fría. Hoy en día, la comercialización de carne caliente es una aberración que debería estar prohibida por las autoridades sanitarias, como lo está en muchos países del mundo. Hoy en día, se cuenta con excelentes técnicas de enfriado de la canal, que evitan el crecimiento microbiano y por ende las enfermedades. Se requiere un cambio cultural en la gente para que deje de ser común el que los cárnicos no se refrigeren, o lo hagan a temperaturas inadecuadas; que se dejen de exponer carnes y embutidos en mercados municipales o carnicerías fuera del refrigerador, donde la gente los manosea; dejar de efectuar el corte mediante la rebanadora de uso múltiple (posible contaminación cruzada), evitar que el carnicero sea también el cajero; además todo se empeora cuando vemos que el consumidor maneja los productos cárnicos sin refrigeración durante varias horas, lo congela y descongela, y lo consume varios días después. 8 Figura 3. Carne de pollo vendida en condiciones desfavorables para preservar su calidad y prolongar vida de anaquel. Pone en riesgo la salud de los consumidores. Otro abuso típico al que se someten las carnes, es cuando se emplean como ingredientes en lugares de comida rápida sin inspección (tortas y tacos de la esquina) que se venden en la vía pública, ya que permanecen por horas a temperatura ambiente antes de su consumo; sin dejar de lado, la gran cantidad de contaminación sólida que cae sobre su superficie. Estos abusos, y la falta de respeto a la carne y a la cadena de frío, derivados en parte de la falta de conocimiento, de la inconsciencia, la irresponsabilidad, la falta de seguimiento al sentido común y a la normatividad, son causa de innumerables pérdidas económicas para el país, no solo por el desperdicio de carne deteriorada, sino por el ausentismo laboral y estudiantil, los gastos asociados a infecciones, la resistencia microbiana a antibióticos, etc. Algunas recomendaciones típicas de vida útil de productos cárnicos (Rodríguez, 2003) que se han producido con un buen nivel de higiene y una adecuada cadena de frío para aplicar en casa son: 9 Mediante Refrigeración convencional (0 - 5 ºC): Pescado fresco (limpio) y carne picada o molida: 2 a 3 días Carne de pollo fresca: 2 días Carne de cerdo fresca y empacada: 4 días, hasta 30 días si se mantuvo en excelentes condiciones de higiene Carne y pescado cocidos: 4-6 días Carne cruda bien conservada y empacada: 4 a 25 días dependiendo de la higiene y su origen. Carne cruda, empacada al vacío: dos a seis semanas, dependiendo de los procesos, la higiene y calidad. Productos cárnicos procesados y empacados: dependiendo de su fecha de caducidad. Mediante congelación convencional (-18 ºC): Carnes de vacuno: hasta 10 meses Pollos, Cerdo, Cordero: hasta 6 meses Carne molida: hasta 2 meses Pescados magros: hasta 6 meses Pescados grasos: hasta 3 meses o más (depende del pescado) Mariscos: hasta 3 meses. 4. Las características iniciales de la carne, dictan la vida de anaquel La calidad de la carne es un término complejo, muy ligado en algunos consumidores a la cantidad de grasa presente en el corte; sin embargo, el término va más allá y comprende aspectos nutricionales, sensoriales, tecnológicos y sanitarios, entre otros; siendo el foco central, las características organolépticas de aroma, color, sabor, jugosidad, suavidad que son los de mayor influencia en la experiencia por parte de los consumidores (Lawrie, 1981; Mitsumoto et al., 1998, Brondum, 2000; Hui et al., 2006). No existe un valor absoluto, sino que es la suma de atributos que se conocen cuando el producto se consume. 10 La calidad de la carne, es el resultado de una miríada de factores, los cuales ejercen su efecto desde el momento en que empieza la crianza del animal, con la selección de los individuos con las mejores cualidades, lo que dependerá del propósito específico de su producción, ya sea ganado para carne, leche, etc. (cuadro 1); del uso de dietas nutritivas y adecuadas al tipo de animal, lo que permite mejorar los rendimientos, e influye importantemente en la calidad nutrimental del producto a obtener; la salud animal y trato humanitario durante la estadía en granja y posteriormente, cuando los animales son transportados y faenados en el rastro. Durante todo el proceso hay que cuidar el bienestar del animal, ya que alteraciones por estrés, demeritarán la calidad obtenida durante la crianza. El proceso de matanza y faenado del animal, es un punto de alto riesgo, donde todo lo antes logrado, puede perderse en cuestión de minutos (Mitsumoto et al., 1998, Cheah et al., 1995, Hertog-Meischke et al., 1997, Faustman et al., 1998, García et al., 2005). Cuadro 1. Diferentes clasificaciones de carne, según su origen, contenido de grasa y color. Categorías Carne Vacuna Carne Ovina/Caprina Por origen Carne Porcina Origen Res, ternera, novillo, vaca, buey, búfalo, etc. Cordero, borrego, cabrito, chivo, cabra. Lechón, cerdo, marrana, verraco. Pollo de engorda, Gallina, pato, Carne de Ave faisán, pavo, ganso, codorniz, perdiz, paloma. Otras Carnes Venado, conejo, cuyo, caballo, avestruz Rojas Según el color Blancas Negras 11 Res, cerdo, ternera, buey, caballo y ovino. Conejo y Carne de ave (excepto avestruz). Animales de caza, Avestruz La matanza, se debe realizar sin estrés ni sufrimiento por parte del animal, por lo que antes de morir, los animales son insensibilizados, de modo que no perciban las sucesos a su alrededor. Si los animales sufren, se desencadenan alteraciones en el metabolismo post-mortem del músculo, lo que se traduce en defectos fisicoquímicos en la carne, particularmente, por la disminución rápida del pH, lo que se traduce en mermas por escurrimiento de agua y carne pálida, en su mayoría en cerdos (Karakaya et al., 2005, Lawrie, 1981; Hui et al., 2006). Dependiendo de la especie animal, la sangre representa entre el 6 y 8% de su peso vivo. Por lo que luego de la muerte, es necesario un adecuado y completo desangrado, ya que la presencia de sangre en la carne, da mal aspecto y reduce la vida de anaquel, pues representa un medio muy favorable para el crecimiento de microorganismos (McMeekin et al., 1997, Mitsumoto et al., 1998). Después de haber desangrado al animal, siguen los procesos de remoción de la piel y eviscerado. La presencia de contaminantes, principalmente bacterias patógenas ocurre al poner en contacto la canal con la cara externa de la piel o con el contenido intestinal. Hay que tener especial cuidado durante el retiro de vísceras, para que estas no se rompan o se desborden, a fin de evitar una diseminación del contenido sobre la canal, debido a que éste tiene gran cantidad de microorganismos que alteran rápidamente la calidad de la carne. De haberse realizado los procesos de faenado en un ambiente de adecuada higiene, se tiene una canal con una carga microbiana moderada. De lo contrario, para reducir riesgos sanitarios, se recurre a herramientas de sanitización y lavado, lo que ayuda a reducir al mínimo la contaminación microbiana adquirida en esta etapa. Esto incluye desde el uso de agua clorada, el uso de ácidos orgánicos (láctico, acético, propiónico) y algunos inorgánicos (HCl), hasta procesos muy complicados de enfriado ultra-rápido, e incluso de pasteurización de canales. Finalmente, las canales deben ser enfriadas rápidamente, dependiendo del rastro esta práctica es muy variable. Las velocidades con que cae la temperatura, varían mucho entre especies y objetivos de comercialización y van desde minutos para llegar a temperaturas cercanas a 0 grados en pollos, hasta más de dos días en otras especies. La velocidad de caída en la temperatura es relevante para reducir la actividad metabólica aún existente en los músculos y en la flora microbiana presente (Lawrie, 1981). 12 El no tener un adecuado enfriamiento de la canal puede propiciar defectos en la carne, incrementando por ejemplo la frecuencia de carne PSE en cerdos. Una vez obtenidas las canales con adecuada temperatura de refrigeración e higiene, estas son enviadas a establecimientos de despiece (obrador o tablajería) o directamente a carnicerías, si lo antes descrito ha sido cuidado, se puede decir que la canal obtenida tiene excelente calidad, por lo tanto las posibilidades de tener una larga vida de anaquel son mayores. Durante el transporte de la canal, es importante cuidar que la cadena de frío se siga manteniendo, ya que las variaciones en temperatura pueden modificar los parámetros fisicoquímicos y microbiológicos de la carne, y por ende acortar la vida de anaquel. Es muy difícil producir un producto de alta calidad, pero es muy fácil deteriorar la calidad de la carne y su vida útil si no se tienen en todo momento los cuidados adecuados, que incluyen el evitar la contaminación microbiológica, física, química, abusos de temperatura y exposición a factores ambientales deteriorantes (luz solar, etc.). Por otro lado, en la industria existen diversos protocolos para recibir la materia prima (carne) que se va a utilizar (Lawrie, 1981). La materia prima con adecuada calificación de calidad y adecuado procesamiento, tendrá una larga vida en anaquel; entre las características a considerar claves en la adecuada aceptación de materia prima cárnica se encuentran: el color (primer indicio de calidad y frescura del producto), el grado de maduración (se encuentra relacionado con la estabilidad de las fibras musculares y la interacción de olores de la carne) y la capacidad de retención de agua (es un indicativo de lo sucedido desde transportación del animal, pasando por la matanza y enfriamiento, relacionado con la estabilidad de las fibras musculares y con la velocidad y amplitud de la caída del pH de la carne después del sacrificio). la carga microbiana inicial (la cual estará relacionada con todo el proceso de sacrificio y faenado, lavado de canales y mantenimiento de la cadena de frío). 13 Una de las mejores prácticas para poder controlar la vida de anaquel, consiste en realizar análisis microbiológicos a la materia prima (las canales o cortes primarios), que parte de la premisa de que una baja carga microbiana inicial, es la clave para una larga vida de anaquel. 4.1. Defectos de calidad en la carne Como se mencionó en la sección anterior, el proceso de sacrificio y disminución de la temperatura en la canal, es determinante para generar o no defectos en la carne. Además, para elaborar productos cárnicos de calidad u ofrecer un corte de carne fresca de calidad, debe utilizarse materia prima en las mejores condiciones, que sea útil y no sufra alteraciones durante los diferentes procesos que se va a someter. Un indicador de calidad al momento de elegir la carne es el grado de suavidad (terneza). La terneza de la carne está relacionada con factores genéticos, nutricionales, de manejo, de maduración, entre otros (Aberle, 2002; Berge et al., 2003, García et al., 2005, Karakaya et al., 2005, Texeira et al., 2005). Es relevante además, la velocidad y magnitud de cambio del pH de la carne durante las primeras 6 horas post-mortem, ya que esto afectará la capacidad de retención de agua de la carne y por consiguiente la suavidad y el color. Una caída muy leve del pH, con mínima producción de ácido láctico en la fibra muscular después de la muerte, provoca la condición DFD; por otro lado una caída excesivamente rápida del pH (más ácido) provocará la condición PSE. Carnes DFD (del inglés: dark=oscura, firm=firme, dry=seca) Son carnes que presentan un pH superior a 6.1 y retienen mucha agua, por lo tanto son extremadamente susceptibles al desarrollo microbiano; son carnes de color oscuro, textura firme y una apariencia seca debido a su elevada retención de agua. Un pH mayor a 6.2 puede dar origen a problemas tecnológicos, siendo un problema típico en la obtención de carne vacuna. Se asocia a estrés crónico en el animal, como los dietados excesivos que acaban con las reservas musculares de glucógeno y por ende no hay capacidad de producción de ácido láctico, es muy común en bovinos (Lawrie, 1981; Hui et al., 2006). 14 Figura 4. Carne DFD (arriba) vs carne normal (abajo). Carnes PSE (del inglés pale=pálida, soft=suave, exudative=exudativa) En este caso, ya sea por factores genéticos, por exceso de estrés y maltrato a los cerdos, las reservas de glucógeno muscular se transforman aceleradamente en ácido láctico, provocando un descenso rápido del pH, lo cual se agrava cuando persisten temperaturas elevadas después de la muerte de los animales (arriba de 30 ºC). Este ambiente ácido, acerca a las proteínas miofibrilares a su punto isoeléctrico por lo que se tiene una menor capacidad de retención de agua. Este es un problema que se observa sobre todo en aves y cerdos (Lawrie, 1981; Christensen, 2003; Hui et al., 2006). Figura 5. Carne PSE (izq.) vs carne normal (der.). 15 Además de los defectos DFD y PSE, las carnes pueden tener otras alteraciones (Aberle, 2002), que impidan su uso por ejemplo: 1.- Olor y sabor, causado por determinados tipo de dieta: La carne de cerdos alimentados con gran cantidad de harina de pescado o residuos de lino, huele y sabe frecuentemente a pescado, o bien a rancio. Es frecuente que estas alteraciones solo se distingan después de hervir la carne. En los casos más extremos, el olor es claramente desagradable, y el tejido graso exhibe color gris o amarillo y una textura blanda. Dietas altas en aceites de mala calidad o en exceso, darán problemas de color de grasa y de grasa muy líquida. 2.- Olor y sabor a medicinas, desinfectantes y similares: Algunas substancias pueden transmitir su olor y sabor a la carne. Entre otras, se encuentran especialmente el alcanfor, el petróleo, el éter, el pinol, etc. La carne de los animales sacrificados también toma diversos olores y los conserva por mucho tiempo, las alteraciones del olor y sabor pueden ser muy acentuadas. A diferencia de los anteriores, los químicos para reducir la carga microbiana (ácidos láctico, propiónico, acético) tienen un efecto bacteriostático, la mayoría de estos olores desaparece rápidamente por ser compuestos muy volátiles (Beales, 2004; Bradley et al., 2011). 3.- Olor sexual, es aquel derivado de sustancias que naturalmente produce un animal para atraer a las hembras, o marcar territorio (feromonas como el escatol y la androstenona), las producen normalmente los machos sin castrar de cerdos, borregos, cabras, etc. En general su concentración aumenta con la edad. En cerdos, los machos se castran quirúrgicamente en edades tempranas (3 días de nacidos) o inmunológicamente 8 semanas antes de llegar a su peso de mercado, ya que de no hacerlo, la carne tendrá olor a orines y sudor. 4.- Contaminación de la carne: Al realizar la matanza de los animales existen múltiples factores que pueden contaminar la carne. La falta de cuidado e higiene por parte de los operadores es un punto relevante, ya que por descuido puede ocurrir contaminación con contenido gastrointestinal o con líquido biliar; igual ocurre si el animal tuviera abscesos (lesiones crónicas), si no se trabaja con cuidado, puede haber contaminación de la carne y desarrollo de olores desagradables. 16 En los rastros está estrictamente prohibido el proceso de animales que no llegaron vivos a la matanza, ya que no se podrían inspeccionar, además la carne estaría llena de sangre, y si el eviscerado de los animales no se lleva a cabo inmediatamente después de su muerte, ingresan en la carne microorganismos deteriorantes (de la putrefacción) procedentes del canal intestinal y se produce la coloración verde grisácea del intestino y de las paredes abdominales, a veces con reblandecimiento del hígado y riñones (Aberle, 2002). 4.2. La grasa en la carne Sensorial y nutricionalmente, la grasa juega un papel relevante en la calidad de los productos cárnicos (Figura 6). Es un componente muy dinámico, que puede variar en su composición en función de la especie animal y del alimento que reciba; además, se puede alterar mediante reacciones de oxidación, lo que repercute en las propiedades nutricionales y sensoriales (Aberle, 2002; Hui et al., 2006, Lawrie, 1981). La grasa puede tener diversos perfiles de ácidos grasos, los cuales influyen en la nutrición y salud de los consumidores. Según diferentes fuentes de información nutricional a lo largo del mundo, los humanos deben de consumir diariamente entre un 30 y 34% de sus calorías, a partir de grasas y aceites y el resto a partir de proteínas y carbohidratos. Al formar una parte importante de nuestra nutrición, debemos de tener en cuenta el perfil de ácidos grasos que conforman nuestros alimentos y la relación que guardan entre ellos, por ejemplo, ¿Qué porcentaje de ácidos grasos saturados, insaturados o poliinsaturados las componen? y ¿Qué relación se tiene entre los diferentes aceites que la componen?, además, de la relación entre omega 3 y omega 6, la cual es relevante para entender la patología de algunas enfermedades cardiovasculares, o inmunológicas. Lo ideal es mantener una relación omega 6:3 de 2:1; consumir grasas con alto contenido de ácido graso oleico y limitar el consumo de grasas saturadas (Palmquist, 2009). En la actualidad se busca que los animales depositen grasas benéficas para la salud, pero que esta grasa no pierda o disminuya sus propiedades funcionales de procesamiento. La conservación de la grasa es importante, ya que su oxidación resulta en una disminución de sus cualidades nutricionales y de la vida de anaquel del producto (Buege y Aust, 1978). 17 Figura 6. Un adecuado almacenamiento, reducirá el riesgo de las reacciones de oxidación de la grasa en cortes con elevado contenido de grasa intramuscular. 4.2.1. La rancidez en la carne (Oxidación de lípidos) La oxidación de los compuestos lipídicos de un alimento, es una de las reacciones que modifica en forma más importante la calidad de la carne, ya que aún teniendo cuidado de no contaminar el alimento con microorganismos, este fenómeno ocurre por reacciones químicas en muchos de los casos de forma espontánea. El proceso de oxidación, es lo que da la característica de rancidez, la cual puede ser positiva o negativa, puesto que ayuda a hacer más fuertes los sabores y olores, mejorando o empeorando un alimento (Buege y Aust, 1978; Faustman, 1990; Lawrie, 1981). La rancidez es iniciada por radicales libres del oxígeno o por el ataque del oxígeno molecular a radicales libres pre-formados en los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA’s de sus siglas en Inglés) que constituyen a las grasas y aceites (Figura 7). Los ácidos grasos más susceptibles a reacciones de oxidación son los PUFA’s, los cuales se asocian principalmente a lípidos de las membranas, las cuales envuelven a las células o a los organelos como las mitocondrias (Morrissey et al., 1998, Renerre et al., 1996). Estas reacciones de oxidación dependerán de factores intrínsecos y extrínsecos a la carne. 18 Los factores intrínsecos incluyen principalmente los sistemas de alimentación a los que fueron sometidos los animales en vida, lo cual tiene un efecto en el tipo de grasa (perfil lipídico y grado de rancidez), así como la presencia y concentración de antioxidantes como son principalmente el nivel de vitamina E, C, de carotenoides; así como de minerales antioxidantes como el selenio o pro oxidantes como el cobre y el hierro (Chea et al., 1995, Zerby et al., 1999, O’Grady et al., 1998, Mitsumoto et al., 1998, Liu et al., 1996, Hertog-Meischke et al., 1997). Los factores extrínsecos se asocian con los sistemas de protección en la carme (sistemas de empaque y antioxidantes exógenos o añadidos), presencia de fuentes y tipo de luz, así como el manejo de temperaturas de conservación (Gobantes et al., 2001, Gruen, 2008). La oxidación de la fracción lipídica en el músculo depende de la cantidad e interacción con iniciadores de la cadena de oxidación (Figura 7), como son: el Oxígeno reactivo (O•) y metales de transición (Fe2+ y Cu2+). Dentro de la cadena de oxidación, la reducción del Oxígeno por un electrón rinde diversos compuestos: un radical anión superóxido (O2-), peróxido de Hidrógeno (H2O2) y un radical Hidroxilo (OH-), los cuales participan en la cadena de oxidación de la grasa y de pigmentos musculares (como la hemoglobina y mioglobina). El radical superóxido puede ser producto de varias reacciones tales como la oxidación de la oximioglobina hasta metamioglobina. En condiciones ácidas, el radical superóxido puede ser protonado a un radical peroxil (HOO•) que es el agente oxidante más potente, siendo capaz de penetrar la bicapa de membrana lipídica con mayor facilidad que otros agentes pro-oxidantes (Lawrie, 1981; Mancini y Hunt, 2005; Hui et al., 2006, Coma, 2006; Buege y Aust, 1978). Una manera de determinar la oxidación es por medio de la cuantificación de compuestos resultantes de la oxidación de lípidos (óxidos, aldehídos y cetonas), esta prueba es conocida como índice de TBARS (thiobarbituric acid reactive substances; sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico) y sus resultados se expresan como miligramos de Malonaldehído/Kg de carne. 19 Figura 7. Cadena de reacciones de oxidación de lípidos. 4.3. El color en la carne El color que percibimos en la carne es el resultado de una fuente de luz que puede variar en color (blanca, roja, luz de día, etc.), que interactúa con pigmentos que tienen la capacidad de absorber fracciones de luz, de modo que lo que se refleja es el color que nosotros percibimos mediante la retina (Mancini y Hunt, 2005), que es un detector que comunica los estímulos al cerebro quien percibe e interpreta lo que la muestra refleja (la luz que no fue absorbida por la muestra). El color y la apariencia de la carne se encuentran dentro de los principales atributos de calidad que influyen en la decisión de compra del consumidor. De hecho para los consumidores mexicanos, es el principal referente al momento de seleccionar un corte de carne. Estos juicios son muy variados entre consumidores, se basan en ideas preconcebidas y experiencias personales, que resultan en que consideremos una carne como segura, fresca, jugosa o inadecuada para su consumo. Intuitivamente, el consumidor es capaz de percibir los cambios en el color, los cuales pueden estar asociados a alteraciones químicas a nivel superficial, a la composición química del alimento, a la creación de nuevos compuestos en la superficie, al desarrollo microbiano, o simplemente a modificaciones en el contenido de agua (poca o alta capacidad de retención de agua; o deshidratación de la carne por congelamiento). 20 Sea la que fuese la causa, el color de la carne es tan relevante para el consumidor, que si no cumple los estándares preconcebidos, la compra no se lleva a cabo. Esto justifica los esfuerzos que se llevan a cabo para tratar de preservar por el mayor tiempo posible las características del color de la carne fresca. El principal pigmento de la carne, es la mioglobina, la cual cambia de color en función de su estado de oxidación. Así, el color de la carne no es fijo y se puede modificar por la interconversión de las tres diferentes formas de la molécula de mioglobina (Figura 8 y 10). Al realizar un corte transversal a las fibras musculares, la mioglobina interactúa principalmente con los gases de la atmósfera, ya sea oxígeno, monóxido o dióxido de carbono (Silliker et al., 1997), lo que puede resultar en diferentes porciones de las diferentes especies de mioglobina (Mancini y Hunt, 2005): 4 Sin O2 2b 1 Muy bajo O2 3 2a ATM O2 Rx 1 (Oxigenación): Dmb + O2 OMb Rx 2a (Oxidación): OMb + [consumo de oxígeno o baja presión parcial O2 ] - e MMb Rx 2b (Oxidación): [ DMb - ion hidroxil - ion hidrógeno complejo ] + O2 MMb + O2 Rx 3 (Reducción): MMb + consumo de oxígeno + reducción de metamioglobina Dmb Rx 4 (CarboxiMb): DMb + monóxido de carbono COMb Figura 8. Diferentes formas y reacciones de la mioglobina en la carne (Adaptado de Mancini y Hunt, 2005). 21 Cuando la carne es fresca o recién cortada la proporción de Deoximioglobina (DMb Fe2+) es alta y esto confiere a la carne (i.e., de res) un color rojo púrpura, debido a que la mioglobina se encuentra en estado reducido, ya que no hay oxígeno fijado a la molécula. Después de condiciones aerobias, el Oxígeno (O2) se une a la molécula de DMb para producir Oximioglobina (OMb Fe2+) y generar un color rojo cereza brillante. Esta reacción ocurre en los primeros 3-5 milímetros de la superficie de la carne, que son los que están en contacto con el oxígeno. Después de una exposición prolongada al medio ambiente, la OMb se oxida a su forma de metamioglobina (MMb Fe3+) generando un color café-rojizo que es poco deseable. Es interesante que la carne puede responder en ciclos finitos de cambio del estado de la mioglobina, lo que provoca que una carne se vea de uno u otro color, por ejemplo de rojo brillante a morado y luego a rojo brillante, según los cambios que se tengan en la presencia de gases, haciendo énfasis en que cambios asociados a otro factor como desarrollo microbiano no serán reversibles los cambios en color. Una forma más de la DMb es la Carboximioglobina (COMb Fe2+), que se genera en presencia de monóxido de carbono y resulta en una coloración roja, semejante a la OMb (Cornforth y Hunt, 2008; Mancini y Hunt, 2005). Esta práctica no es adecuada, debido a que es una reacción irreversible y podría enmascarar la descomposición y en la mayoría de la Unión Europea y E.U.A., está prohibido el consumo de alimentos tratados con este gas (Figura 9). Como se mencionó anteriormente, los microorganismos también pueden propiciar cambio en el color, generando principalmente pigmentaciones verdosas, la molécula producida se llama Sulfomioglobina (SMb), característica de la presencia de desarrollo microbiano, por la reacción del SH2 producido por los microorganismos y el oxígeno atmosférico, la SMb se puede llegar a oxidar hasta Metasulfomioglobina (MSMb) que dará un color rojo. La interpretación del color, se hace en función de tres características esenciales que son el tono o nombre del color (amarillo, azul, rojo, verde); la saturación (croma) que nos indica la intensidad del color; y la luminosidad que indica la claridad que tiene el color (AMSA, 1991). Esto pude ser descrito de manera objetiva, mediante el uso de equipos especiales que estudian los componentes del color, estos se dividen en colorímetros y espectrofotómetros. 22 Los colorímetros evalúan la luz mediante el uso de filtros de tres o cuatro colores, mientras que los espectrofotómetros proyectan un haz de luz monocromática sobre la muestra y miden la cantidad de luz que es absorbida en diferentes longitudes de onda, permitiendo incluso generar curvas espectrales. Figura 9. Coloración de carne de res generada por el uso de monóxido de carbono (izq.) con respecto a no usarlo (der.) foto obtenida de: http://elnuevodespertar.wordpress.com. Una vez realizadas las mediciones, los resultados se pueden expresar numéricamente (Liu et al., 1996, Mancini y Hunt, 2005; Wulf et al., 1997 y 1999). Para esto, existen numerosas escalas o sistemas, siendo el más común el CIE-L*a*b*. Donde L* es la luminosidad, a* es una escala que va del rojo (a*+) al verde (a*-) y el parámetro b* de amarillo (b*+) a azul (b*-). Con estos valores se calcula además el valor del ángulo de Hue (tono o ángulo de viraje) y la saturación del color (croma). Los cuales se definen por las siguientes expresiones matemáticas: ܾכ ܥൌ ඥܽ כଶ ܾ כଶ ݄ ൌ ି݊ܽݐଵ ൨ ሾ݃ݏ݀ܽݎሿ ܽכ 23 O2 Mioglobina Fe ++ Rojo-Púrpura Oximioglobina Fe ++ Rosa-Rojizo Brillante _ _ NO3 / NO2 OX/RED Nitrosomioglobina Fe++ Rojo oscuro Metamioglobina Fe+++ Café Pardo CALOR CALOR Nitrosohemocromo Fe ++ Rosa claro Metamioglobina Desnaturalizada Fe+++ Gris-Café Productos Curados-cocidos Carne Fresca Figura 10. Diferentes coloraciones en pierna de cerdo asociadas a las diversas formas de la mioglobina. En la actualidad, dependiendo del país o región, existen diversas escalas de color, donde las escalas de color pueden tener diferentes puntuaciones y patrones de color. Por ello, se ha buscado relacionar el color con alguna otra propiedad fisicoquímica o de textura. Algunos investigadores, en su afán por encontrar ecuaciones que incluyan variables sencillas de determinar, han llegado a usar los valores de color para estimar el pH (Ecuación 1) en el músculo de canales bovinas (Wulf et al., 1999) y fuerza al corte (Ecuación 2) en el Longissimus tenderness en la misma especie (Wulf et al., 1997). Estas ecuaciones son de gran ayuda para estimar rápidamente en campo; si bien, existen ecuaciones con otras variables diferentes a los parámetros de color, que pueden incrementar el coeficiente de determinación. ሺͳ݊×݅ܿܽݑܿܧሻ ܪൌ ͺǤͶ െ ͲǤͷͳሺܾ כሻ ͲǤʹʹܾ כଶ ܴ ଶ ൌ ͲǤͷܴܵ ܦൌ ͲǤͳͷ ሺʹ݊×݅ܿܽݑܿܧሻ ݁ݐݎ݈ܿܽܽݖܨൌ ͶǤͷ െ ͲǤͲͳሺכ ܮሻ ͲǤͳʹሺܽ כሻ െ ͲǤ͵ͷሺܾ כሻܴ ଶ 24 En el espectro de reflectancia de cualquier cuerpo colorido, hay regiones (longitudes de onda) donde hay una mayor respuesta de acuerdo a los colores del objeto. Las diferentes moléculas de mioglobina ejercen señales máximas a diferentes longitudes. La siguiente figura explica las absorciones de luz según la molécula mayoritaria. La estimación de las cantidades de las tres moléculas de oximioglobina, ayuda a hacer inferencias del estado de oxidación de la carne a nivel superficial (Mancini y Hunt, 2005). Por ello, varios grupos de investigación han evaluado el suministro de compuestos en dietas, principalmente vitaminas, para mejorar la estabilidad del color, principalmente retrasando la aparición de las formas de oximioglobina en la carne almacenada (Zerby et al., 1999, O’Grady et al., 1998, Mitsumoto et al., 1998, Liu et al., 1996). En general, las siguientes relaciones se pueden utilizar para estimar la proporción de pigmentos en función de la absorción de energía en diferentes longitudes de onda (Mancini y Hunt, 2005; AMSA, 1991). ݇ ݇ ܾܯܦൌ ൬ ͶͶ൰ Ȁ ൬ ͷʹͷ൰ ݏ ݏ ݇ ݇ ܾܯܯൌ ൬ ͷʹ൰ Ȁ ൬ ͷʹͷ൰ ݏ ݏ ݇ ݇ ܱ ܾܯൌ ൬ ͳͲ൰ Ȁ ൬ ͷʹͷ൰ ݏ ݏ Para estudiar más a fondo estos conceptos y la metodología específica para la evaluación del color, se refiere al lector a la publicación del folleto técnico “Manual de Análisis de Calidad en Muestras de Carne” por el Dr. Diego Braña Varela y colaboradores (2011) publicado por el INIFAP dentro del Macro proyecto “Indicadores de Calidad en la Cadena de Producción de Carne Fresca en México”, o a la guía de evaluación de color de la carne publicada por AMSA (Hunt et al., 1991). 5. Relevancia de la nutrición animal en la vida de anaquel de la carne Debido a las tendencias del consumo por alimentos más sanos y buscando reducir pérdidas tanto por oxidación como por la falta de estabilidad en color de la carne, tanto nutriólogos como tecnólogos en alimentos, se han dado a la tarea de buscar alternativas que ayuden a disminuir estas pérdidas. 25 Esto ha resultado en modificaciones en los procesos de obtención de la carne, las cuales incluyen factores intrínsecos a la carne (raza, edad a la matanza, alimentación de los animales, etc.), así como aquellos asociados a procesos industriales, siendo los más relevantes los procesos de matanza y despiece por el riesgo asociado a la contaminación de la carne. Posteriormente, los esfuerzos se enfocan a mantener una baja carga microbiana, así como condiciones ambientales que reduzcan el riesgo de oxidación. La forma en que se alimentan los animales influye directamente en el contenido de antioxidantes presentes en la carne, por ejemplo, la alimentación de rumiantes basada en pastos y no en grano, resulta en un incremento sustancial de tocoferoles, carotenos e incluso de vitamina C. Pero es principalmente el contenido de vitamina E (α-tocoferol) en la grasa y la carne, el que tiene la mayor actividad antioxidante lo que permite prolongar la vida de anaquel en la carne (Zerby et al., 1999). La suplementación de vitamina E, no solo mejora la consistencia del color de la carne, en parte porque aumenta la estabilidad oxidativa de la mioglobina, sino que además a nivel de membrana celular evita la oxidación de las lipoproteínas, logrando aumentar su estabilidad, lo que resulta en menores escurrimientos y mermas de peso (Cheah et al., 1995, Faustman et al., 1998, Hertog-Meischke et al., 1997). En ganado bovino, la suplementación con α-tocoferol impacta importantemente en el color y la textura, mientras que en cerdos el impacto solo es relevante en la estabilidad del color (Liu et al., 1996, Cheah et al., 1995). Otro compuesto con capacidad antioxidante, es la vitamina C, el cual puede ser producido en el intestino de los animales, a diferencia de los tocoferoles, esta es una vitamina hidrosoluble, que si bien es capaz de actividad antioxidante en la interface de la membrana, es relevante su actividad contra la oxidación de las proteínas con porciones lipídicas a nivel intracelular (Morrissey et al., 1998). Otro tipo de suplementos nutricionales comúnmente utilizados por su acción antioxidante son algunos metales, como el Mg2+, Mn2+ y Se+, que se incluyen en las premezclas minerales directamente en la dieta o mediante el uso de bloques de sales minerales para el ganado, que además de ser parte estructural como cofactores de enzimas antioxidantes funcionan como activadores de enzimas calcio-dependientes para mejorar propiedades de textura. En estos compuestos, es relevante reconocer la fuente del mineral, su biodisponibilidad e impacto en el ambiente (Morrissey et al., 1998, Renerre et al., 1996, Gruen, 2008). 26 Definitivamente, los compuestos que actualmente están teniendo más auge en el área de investigación, son los llamados extractos naturistas, muchos de ellos derivados de plantas, árboles e incluso forrajes, los cuales tienen gran cantidad de compuestos polifenólicos con actividad antioxidante, entre ellos se encuentran los ácidos fenólicos, taninos, proantocianidinas, cianidinas, etc., pero algunos de ellos tienen la desventaja de reducir la digestibilidad de los nutrientes de la dieta y por ende su uso es limitado. Quedan también los derivados de aceites esenciales de plantas como el romero, salvia, orégano, etc., los cuales se ha encontrado que pudieran tener una actividad más relevante al ser aplicados directamente en la carne en vez de en el alimento de los animales (Gruen, 2008). En la siguiente sección, se discuten formas diferentes de preservar la carne. En adición a los esfuerzos realizados durante la producción animal, existen desarrollos tecnológicos que permitirán prolongar la vida de anaquel de la carne, desde otras vías, la más fehaciente es la tecnología de empaques que incrementa considerablemente la vida de anaquel, a continuación se hará una breve revisión de estas metodologías. 6. Alternativas de empaque en la preservación de la carne En la actualidad existen diversas formas de empacar la carne o productos cárnicos. Esto es el resultado de una constante evolución, que busca mejorar su función principal: “contener y preservar”. Diversos grupos de investigación en colaboración con la industria de empaques, se han dado a la tarea de resolver los problemas de productores y procesadores de carne. En esta búsqueda de mejores y más nuevas tecnologías, al igual que sucedió con el uso de la refrigeración y el congelado, la industria de la carne fue de las primeras en aplicar las tecnologías de envasado con atmósferas modificadas (EAM) para incrementar la duración de sus productos (Davies, 1995; Sivertsvik et al., 2002, Brody, 2001 y 2003). El empaque al vacío, es una forma de modificar la atmósfera con la que está en contacto la carne, en este caso, limitando su contacto con el aire (Luño et al., 1998). Es una tecnología ya tradicional, que se aplica comúnmente en piezas de gran tamaño, como son los cortes primarios, secundarios, o los cuartos completos de las canales, donde por lo regular se completa su etapa de maduración (para mejorar suavidad, aroma y sabor). 27 Bajo las condiciones de anaerobiosis del empacado al vacío, se inhibe la proliferación de la gran mayoría de microorganismos patógenos y deteriorantes aerobios, así como la oxidación lipídica, además de facilitar el almacenamiento y transporte de la carne (Labuza y Taoukis, 1992). Después de que las piezas han llegado a su destino, estás se proporcionan y se envasan en atmósfera modificadas (Coma, 2006). La elección de una tecnología de envasado u otra viene condicionada por la apariencia y tamaño que se desee presentar al consumidor, el valor del producto, el tipo de carne y las condiciones bioquímicas; por ejemplo, cuando el pH final de la carne es bajo, el riesgo de desarrollo microbiano es menor; entonces, puede optarse por el vacío convencional o el vacío mediante termoformado conocido como "segunda piel". En cambio, en carnes con pH’s más altos se recomienda el uso de EAM que contengan dióxido de carbono por su acción antimicrobiana, ya que la carne con pH alto es un medio favorable del desarrollo bacteriano y por ende, al desarrollo de malos olores en el empaque al vacío (Bell y Labuza, 1994; Brody, 2003; Faustman et al., 1998, García y Gago, 2006). La composición de la atmósfera protectora destinada al envasado de carne fresca, tiene un efecto directo sobre el color. Las carnes rojas mantienen este color si existe una alta proporción de oxígeno en el contenedor. En caso contrario, adquieren tonalidades pardas y grisáceas, que no son calificativos propios de descomposición (Faustman et al., 1998). Esta alteración del color no se considera importante cuando se trata de piezas grandes puesto que estas presentaciones no se destinan para venta al menudeo. Una vez que la carne se corta y es expuesta al oxígeno, normalmente recuperará su color natural, gracias a la interacción entre la mioglobina y los gases presentes. Si la carne se ha conservado adecuadamente, y los pigmentos no se han comenzado a degradar, la mioglobina deberá reaccionar haciendo que se recupere el color característico con la exposición al oxígeno una vez abierto el empaque (Cornforth y Hunt, 2008; Coma, 2006). La idea de los EAM, es que el contenido del espacio libre entre el producto y el empaque, se modifique por la sustracción y adición de gases diferentes al atmosférico. El “recambio con gas”, consiste en inyectar un gas al interior del envase para reemplazar el aire existente, cuando la mayor parte del aire ha sido desplazado, se cierra el envase. Normalmente se busca una concentración de oxígeno residual entre el 2 al 5% del volumen total, las máquinas más usadas para esta técnica son las termoformadoras. Hay que tener en consideración que si la concentración de CO2 es alta, la carne fresca puede exudar considerablemente y el exceso de agua contribuirá al desarrollo microbiano. 28 Para evitar que el líquido se encuentre libre, se colocan películas absorbentes en el fondo de las bandejas o se aplica una segunda membrana protectora (García y Gago, 2006, Gobantes et al., 2001, Marth, 1998; Silliker et al., 1997). Las principales modificaciones en el color de la carne, se logran mediante el cambio en la concentración de diferentes gases (Oxígeno, CO2, CO, Nitrógeno, etc.), dependiendo del producto, del tipo y forma de empacado será el tiempo de prevalencia del color. La carne se debe envasar con materiales de baja permeabilidad al oxígeno y a la humedad, esto con el fin de evitar las reacciones de oxidación por contacto grasa-oxígeno y de deshidratación por intercambio de materia con el aire de refrigeración (Rodríguez, 2003). Cuadro 2. Composición de las atmósferas modificadas recomendadas para distintos productos cárnicos. Producto Carne fresca Composición de la AM Temperatura de (%) almacenamiento (ºC) 65-80 O2 / 20-35 CO2 / 0-4 6-8 días 0-4 Hasta 4 semanas 20-40 CO2 / Resto N2 0-4 4-6 semanas 0-20 CO2 / Resto N2 10-15 Varios meses Vida útil Resto N2 Embutidos frescos Embutidos 5-30 O2 / 20-30 CO2 / Resto N2 cocidos Embutidos curados Carne de ave 20-70 O2 / 30-50 CO2 / 0-4 Hasta 2 semanas Resto N2 Existen múltiples combinaciones de gases, pero en lo general para generar un color adecuado, posiblemente la fórmula que ha tenido más impacto es la combinación (80% O2: 20% CO2), donde el oxígeno sirve para favorecer la presencia de OMb y el bióxido de carbono para inhibir el crecimiento bacteriano (Sørheim et al., 2004). En este tipo de empaque, la cantidad de aire o gases presentes es mínimo, así que aunque, el oxígeno promueve la coloración de la mioglobina, y de que también podría incrementar la oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados y fosfolípidos; deteriorando el color y sabor, la cantidad que normalmente se añade, es tan pequeña, que rápidamente se comienza a difundir entre la carne (Rodríguez, 2003; Sørheim et al., 2001). 29 6.1. Ambientes con atmósferas controladas El almacenamiento en atmósfera controlada, se basa en el almacenamiento en espacios herméticos y refrigerados (HR 90-95%), por ejemplo en cámaras de conservación o de refrigeración, donde se crea una atmósfera diferente que es continuamente controlada y regulada para que se mantenga constante (presión y composición), retrasando así los procesos de pérdida de calidad. Los efectos benéficos del gas perduran por corto tiempo, perdiéndose al cambiar la atmósfera en que está la carne (Silliker et al., 1997, Luño et al., 1998). La composición gaseosa óptima depende de la carne, sin embargo, las características generales de cada gas se deben tener presentes para formular la composición idónea de uso (Cuadro 3). Cuadro 3. Características de los gases usados en la preservación de la carne. Gas Propiedades Físicas Nitrógeno Oxígeno Dióxido de Carbono Incoloro, inodoro e Incoloro, inodoro e Incoloro, inodoro y insípido insípido ligero sabor ácido Bacteriostático, Detiene el Ventajas Insoluble en agua y metabolismo en grasas, evita frutas y vegetales, oxidaciones, inhibe mantiene el color en anaerobios, evita carne fresca, colapso del envase favoreciendo la OMbinhibe anaerobios fungiestático, mayor acción a bajas temperaturas, debido a la formación de H2CO3 (ácido orgánico). Inhibe enzimas descarboxilantes y carboxilantes. Desventajas Oxida grasas (enranciamiento) Soluble en agua y grasas, difusión rápida a través del empaque. 30 6.2. Empacado en atmosferas modificadas El envasado en atmósfera modificada consiste en la extracción del aire contenido en el envase y la inyección del gas o combinación de gases según los requerimientos del producto (CO2, O2 y N2). El aumento de la vida útil de los alimentos mediante EAM es debido a la inhibición de fenómenos microbiológicos, químicos y enzimáticos relacionados con la concentración de oxígeno (Brody, 2003; Coma, 2006; Davies, 1995; Cornforth y Hunt, 2008). Si se envasan alimentos con una actividad metabólica alta, como la carne fresca, es preciso utilizar materiales de permeabilidad selectiva; en caso contrario, su vida útil se reducirá considerablemente. La estructura de los materiales de permeabilidad selectiva está compuesta de diversos polímeros que permiten el intercambio de gases entre el espacio libre del envase y la atmósfera exterior (Eilert, 2005). El desarrollo de películas flexibles impermeables al oxígeno y otros avances tecnológicos facilitaron el envasado de alimentos destinados a la venta al menudeo y, actualmente, una gran variedad de productos frescos y procesados se comercializan en EAM (Coma, 2006). Figura 11. Incremento de la vida de anaquel por atmósferas modificadas, por efecto bacteriostático. La fase Lag tiene un mayor periodo de tiempo en aparecer cuando se protege mediante EAM, dependiendo del tipo de respiración del microorganismo. 31 Un gas de particular uso en EAM, es el monóxido de carbono (CO) que en algunos alimentos como la carne fresca modifica el color, pero tiene limitaciones prácticas (toxicidad y mezclas potencialmente explosivas con el aire) y legales, por lo que se usa poco, particularmente por que hace que la carne mantenga su color, aún en estado de descomposición (Cornforth y Hunt, 2008; Sørheim et al., 2001 y 2004). Para que las tecnologías sean aplicadas correctamente, se necesita contar con el material de empaque adecuado, no es común usar empaques para un mismo propósito. La función principal del envase, es preservar el ambiente gaseoso creado en su interior y formar una barrera con el medio ambiente (Luño et al., 1998). Los materiales seleccionados para su fabricación deben presentar determinadas propiedades de barrera al paso de los gases y la humedad. Además, es deseable que reúnan otras características desde el punto de vista técnico, comercial, legal y medioambiental. Los envases más empleados en el EAM se fabrican con materiales poliméricos y se dividen en dos categorías: flexibles y rígidos, los primeros son bolsas con diferentes propiedades mecánicas y de permeabilidad a gases y los segundos emplean bandeja y bolsa protectora, (Labuza et al; 1992, Silliker et al., 1997, Sørheim et al., 2001 y 2004). Es difícil que un único material polimérico posea todas las características deseables. Por este motivo, la mayoría de las películas se fabrican con laminados de dos a cinco tipos de polímeros o resinas (Labuza et al., 1992, Gobantes et al., 2001, Suppakul et al., 2003). Las ventajas de este envasado son: Incremento significativo de la vida útil Menores pérdidas de peso por evaporación Eliminación del goteo y de los olores desagradables 32 Figura 12. Envase flexible con atmósfera modificada (arriba), tomada de: http://www.dupontevents.com/, y envase rígido con atmósfera modificada (abajo) tomada de http://www.envapack.com. 6.3. Envasado al Vacío “segunda piel” Desde que surgió el envasado al vacío convencional, los centros de investigación han buscado nuevas alternativas, preservando el fundamento de esta técnica, llegando al desarrollo de lo denominado “segunda piel” o VSP (vacuum skin packaging en inglés). En esta técnica, el material de envasado (bolsa o recubrimiento) se calienta antes de situarse sobre el alimento, similar a los termoformados (Gobantes et al., 2001, García y Gago, 2005). Por efecto del calor la bolsa se retrae, adaptándose al contorno del producto, previniendo la formación de burbujas de aire y arrugas. Al ser un sistema derivado del envasado al vacío convencional; muchas de las ventajas descritas para él son aplicables al VSP (inhibición de microorganismos aerobios, inhibición de reacciones de oxidación, pérdida de humedad, retención de volátiles, etc.). 33 Además, el empleo del VSP ofrece beneficios adicionales al sistema de envasado al vacío convencional como son: - Proporciona una apariencia mucho más atractiva al producto. El material de envasado se ajusta al contorno del alimento, incluso cuando éste es irregular, sin formar arrugas ni burbujas de aire y sin alterar la coloración en los productos. - Evita los problemas de exudado (García y Gago, 2005). En cortes primarios de res, se ha encontrado que incrementa hasta el doble el tiempo de almacenamiento de la carne y que el usar diversos filtros de luz en el empaque propicia la conservación del color de la carne (Brody, 2003). Para la conservación de pequeñas aves o piezas de aves grandes, mantiene la frescura (color, jugosidad y sabor) por más de 1.9 veces con respecto al vació convencional. En filetes de pescado fresco conservados en refrigeración se ha visto que el VSP incrementa el tiempo de vida al doble con respecto al vacío convencional y 2.5 veces comparado con el envasado permeable al oxígeno (Gobantes et al., 2001, García y Gago, 2006). El principal inconveniente del VSP frente al envasado al vacío convencional es su mayor costo (Eilert, 2005; Coma, 2006). Estudios, en productos cárnicos de baja Aw, (Aw = actividad de agua, definida como la cantidad de agua que está libre y disponible para reacciones químicas) la preservación a temperatura ambiente se incrementa al doble mediante el uso de VSP, ya que el tiempo funcional del empaque es mayor con respecto al vacío común (Gobantes et al., 2001). Figura 13. Envasado al vacío “segunda piel” de pechuga de pavo ahumada. 34 6.4. Envases activos e inteligentes La industria y consumidores exigen que el envase cumpla totalmente las funciones de proteger al alimento en su integridad, calidad y frescura, así como que estén libres de cualquier riesgo para el usuario (Rokka et al., 2004). Con el fin de otorgar esta seguridad y coadyuvar a elevar su desempeño, se han innovado y desarrollado los envases activos e inteligentes (Labuza et al., 1992, Restrepo y Montoya, 2010, Suppakul et al., 2003): Envase activo (EA), Aquellos donde se cambian las condiciones del envase o del medio con el fin de extender la vida de anaquel, incrementar la seguridad sanitaria y mantener las propiedades sensoriales, mientras conserva la calidad del alimento, en este tipo de empaques, el envase libera compuestos o condiciones al alimento para preservarlo. Pueden existir empaques con liberadores de gases, antioxidantes y antimicrobianos (Suppakul et al., 2003). Envase inteligente (EI), se encarga de monitorear las condiciones en las que se encuentra el alimento envasado con el fin de proveer información al consumidor acerca de su calidad durante las etapas de almacenamiento, transporte y exhibición para venta; funcionan mediante etiquetas indicadoras del estado del alimento y empaque (Suppakul et al., 2003). En la selección de EA están involucradas varias características del alimento, que pueden jugar un importante papel en la evaluación de la vida de anaquel (Suppakul et al., 2003, Coma, 2006; Malcata, 1990), tales como: procesos fisiológicos (i.e., maduración), procesos químicos (i.e., oxidación), procesos físicos (i.e., deshidratación), aspectos microbiológicos (i.e., descomposición por microorganismos) e infestación (i.e., por insectos). Los sistemas se pueden clasificar como “absorbedores” que remueven los compuestos indeseables (i.e., oxígeno, exceso de agua, etileno, dióxido de carbono, etc.) y “liberadores” que adicionan compuestos al alimento envasado (dióxido de carbono, antioxidantes, antimicrobianos, etc.). 35 Por otro lado, si bien existen muchos tipos de EI, sólo unos pocos se encuentran en el mercado. Entre ellos tenemos (Brody, 2001 y 2003; Coma, 2006, Restrepo y Montoya, 2010): 1) Indicadores tiempo-temperatura, que muestran una dependencia tiempo-temperatura medible, a través de un cambio irreversible en el dispositivo asociado a un cambio de calidad del producto, son etiquetas internas del envase que monitorean el factor temperatura con el tiempo. 2) Indicadores de fuga (Leak-indicators-LI), aportan información sobre la composición del espacio libre del sistema producto-empaque y de la integridad del envase, indicando la pérdida de presión o la absorción de oxígeno, usan azul de metileno como indicador. 3) Indicadores de grado de frescura, basados en la detección de compuestos volátiles producidos durante la alteración de alimentos (dióxido de carbono, aminas, amoniaco y sulfuro de hidrógeno). 4) Indicadores de desarrollo bacteriano, los cuales se activan por el consumo de algún nutriente, o si la población de microorganismos rebasa los niveles permitidos. Existen otros sistemas indicadores como son los de color, de golpes y de autenticidad. Recientemente, se han diseñado envases inteligentes que incorporan en las películas infinidad de moléculas que al estar en presencia de agentes deteriorantes en el producto, generan una señal visual que alerta al consumidor (Gobantes et al., 2001 y García y Gago, 2006). 6.5. Recubrimientos y películas comestibles Una vertiente de los EA, son los recubrimientos comestibles o películas biodegradables, estos se utilizan en gran diversidad de productos alimenticios, tales como frutas, hortalizas, carnes, pescados, productos de panificación, productos lácteos, etc., con el fin de preservar sus características nutricionales y sensoriales y prolongar su vida útil. Las patentes de películas biodegradables surgieron en el año 1950. Los EA podrían tener actividad antioxidante y ser clasificados en 2 grupos: 1) los que contienen un agente antioxidante que migra hacia la superficie del alimento, y 2) los que actúan sólo en la superficie del alimento sin que el agente migre (Suppakul et al., 2003). 36 La aplicación de recubrimientos y películas a los alimentos, ofrecen las siguientes ventajas: reducen la pérdida de humedad, previenen la formación de exudado, pueden retardar la oxidación de lípidos y reducen la absorción de compuestos volátiles que deterioran el sabor. La funcionalidad y desempeño de las películas biodegradables, dependen de las propiedades de barrera y mecánicas (solubilidad, permeabilidad, flexibilidad, transparencia, porcentaje de elongación, etc.) derivadas de la composición de la matriz polimérica, del proceso de formación y del método de aplicación; por lo que es posible aplicarlas para aumentar la integridad del alimento, la apariencia y para prevenir las reacciones de rancidez (Rojas-Graü et al., 2006). Las proteínas y polisacáridos son los más utilizados para la elaboración de películas para la industria cárnica. Ambas pueden ser razonablemente efectivas como barreras a gases (O2 y CO2), pero su permeabilidad al vapor de agua es relativamente elevada. Los recubrimientos son parecidos a las películas biodegradables que se adhieren a la superficie del alimento creando una microatmósfera en torno a él, por lo normal, pobre en oxígeno. La forma de aplicación de los empaques o recubrimientos comestibles puede ser variable, los alimentos pueden cubrirse ya sea con las películas o bien, ser sumergidos en emulsiones para generar el recubrimiento. Mientras que los primeros se aplican con mayor facilidad, las emulsiones generan una cobertura con mejores propiedades de barrera frente a la humedad. Las propiedades de barrera de los recubrimientos comestibles dependen de los compuestos empleados en su fabricación. Los más frecuentes son polisacáridos, lípidos y proteínas o combinaciones de ellos. En general, ofrecen protección frente a los gases y la humedad, evitan la pérdida de aromas y la deshidratación de los productos y, en muchos casos, mejoran su textura y apariencia (Krochta y Miller, 1997; Krochta y De MulderJohnson, 1997). Los recubrimientos basados en polisacáridos se obtienen de celulosas modificadas, pectinas, derivados del almidón, carragenatos, quitosano, etc. Estas delgadas capas permiten el intercambio gaseoso con el medio exterior, por lo que son adecuadas para productos metabólicamente activos o que requieran pequeñas condiciones de oxigenación; sin embargo, tienen como principal desventaja, la elevada permeabilidad al vapor de agua. 37 Una alternativa para disminuir la permeabilidad, es la elaboración de películas lipídicas a partir de aceites vegetales, diglicéridos, triglicéridos y ceras. Es imprescindible utilizar una matriz que sirva de soporte para estas moléculas puesto que por sí solas originan estructuras demasiado frágiles. Para estas matrices se usan celulosas modificadas (hidroxipropilmetilcelulosa, etilcelulosa, metilcelulosa), quitosano y proteínas del suero de leche (Krochta y Miller, 1997). Las películas de naturaleza proteica se fabrican con caseína, albúmina de huevo, proteínas de soya, zeína, gluten de trigo, colágeno y gelatina, principalmente (Krochta y De Mulder-Johnson, 1997). Comparadas con las de celulosa, la capacidad de los recubrimientos de proteínas para proteger el producto del vapor de agua es inferior; además, se debe considerar el efecto del agente de entrecruzamiento y plastificantes (glicerol, polietilenglicol) que podrían incrementar la resistencia mecánica de estos materiales. Otra ventaja de estos empaques, es que se pueden añadir otras sustancias de interés, ya sea para aumentar la vida de anaquel, o las características del cárnico. Se pueden añadir compuestos antimicrobianos, antioxidantes y saborizantes que contribuyen a mantener la calidad e incrementar su vida útil, mediante la liberación gradual durante el tiempo y la afinidad empaque-alimento. Cabe señalar, que los recubrimientos comestibles pueden favorecer el desarrollo de patógenos anaerobios y las reacciones fermentativas, debido a que existe una cantidad de oxígeno muy limitada entre la cobertura y la superficie del alimento, dependiendo del tipo de matriz usada (Suppakul et al., 2003). El crecimiento de microbios anaerobios, se evita con la elección del material de recubrimiento más adecuado y la introducción de agentes antimicrobianos que inhiban el crecimiento microbiano. Por ejemplo, en el caso de productos cárnicos emulsionados (salchichas), donde debido al gran contenido de grasa y a su rápido deterioro, es necesario tener un control extra; se han realizado estudios buscando inhibir reacciones de oxidación y de desarrollo antimicrobiano, mediante la incorporación de bacteriocinas o antioxidantes a la matriz (Samelis et al., 2000). 38 En otros estudios, con pequeñas piezas de carne en diferentes especies, se ha encontrado la disminución de la carga bacteriana de L. monocytogenes, Salmonella spp., y Brochotrix thermosphacta, a través de recubrimientos de aislado de proteína de suero de leche, zeína o almidones modificados con la incorporación de bacteriocinas, inhibiendo también la aparición de concentraciones elevadas de metabolitos secundarios de patógenos y deteriorantes, alargando considerablemente la vida en anaquel del producto (Baranyi et al., 1995, Bradley et al., 2011, Gibson et al., 1988, Houtsma et al., 1996, Moore y Sheldon, 2003 a y b; Rokka et al., 2004, Rozum y Maurer, 1997; Russell et al., 1996). Figura 14. Película comestible, elaborada a partir de polímeros naturales (Almidones). 6.6. Puntos a considerar para evaluar la eficiencia de empaques Debido a que los sistemas de empaque están diseñados de diversas formas, ya sea, para liberar ingredientes activos en los alimentos con el fin de aumentar su vida útil o para mejorar su calidad, para monitorear la calidad o para crear un ambiente adecuado; es absolutamente necesario revisar los aspectos básicos del fundamento principal del empaque y verificar la capacidad que tiene de extender la vida de anaquel y eficiencia del sistema de envasado, y en particular: 39 1.- Determinar el posible riesgo sanitario del sistema en caso de fallar. Por lo regular, este punto consiste en determinar los límites permisibles de presencia/ausencia de microorganismos, así como, ¿cuál es la carga microbiana considerada como un riesgo para la salud del consumidor? Se realiza mediante el monitoreo de la flora previamente cuantificada durante el tiempo y diversos tipos de almacenamiento, mediante técnicas comunes de microbiología experimental, probando diferentes proporciones de inóculo. 2.- Determinar la estabilidad del empaque. Se basa en la exposición del material de empaque a diversas condiciones adversas, para determinar la estabilidad asociada a su estructura, además de hacer pruebas mecánicas y de permeabilidad para garantizar la función principal del empaque, que es contener y preservar. 3.- Determinar el efecto de los compuestos activos en la flora microbiana del producto. Consiste en probar el efecto bactericida o bacteriostáticos de los compuestos a ser incorporados en el empaque, mediante estudios in vitro y posteriormente in situ de la exposición a contaminaciones mixtas o preseleccionadas sobre el producto, variando las condiciones de almacenamiento, generando tiempos de adecuada función que permitan inhibir el desarrollo microbiano, sin demeritar las cualidades del producto. 4.- Determinar la adecuada interacción empaque-tiempo-alimento. Tiene como finalidad, medir los parámetros de calidad del producto durante el tiempo, bajo las condiciones de empaque seleccionadas, es el primer paso que empieza a aportar datos propios de la vida de anaquel del producto. 5.- Correlacionar deterioro microbiano con percepción sensorial y química. Actualmente, el tener solo información instrumental sesga la generación de conclusiones del buen funcionamiento de un empaque, pero, quien dicta el veredicto final del producto es el consumidor, por ello, es necesario evaluar el efecto empaque sobre la percepción sensorial de consumidores y relacionarla con los parámetros químicos analizados mediante técnicas de laboratorio. Estudios previos, han indicado que la población Mexicana, tiene indiferencia en la percepción de calidad de carne de cerdo almacenada hasta por siete días con respecto a carne fresca, mediante paneles de jueces debidamente entrenados, se puede llegar a percibir estas diferencias que un consumidor no notaría. 40 6.- Determinar las propiedades de difusividad de compuestos protectores del empaque, en función de la matriz de soporte. Es la evaluación de los fenómenos de difusividad que están relacionados con la naturaleza del alimento y del empaque, ya que diferentes polaridades difícilmente tendrán una adecuada difusividad, y se encuentran ligados con los equilibrios fisicoquímicos entre pH, humedad y temperatura. 7.- Evaluar globalmente todos los factores relacionados con la capacidad de extender la vida de anaquel del sistema a probar. Consiste en generar y recabar datos microbiológicos, fisicoquímicos, de estabilidad y aceptación por consumidores a fin de generar un veredicto global del empaque evaluado, posiblemente el llegar a este punto se requiera de mucho tiempo de inversión, pero será menor comparado con la implementación de otro empaque para su producto. (García y Gago, 2006, Gobantes et al., 2003, Shimoni et al., 2001; Shimoni y Labuza, 2005) Figura 15. Uso de etiquetas en los envases para monitorear la frescura en carne (Empaques Inteligentes), foto obtenida de http://www.revistapym.com.co/destacados/empaques-como-estrategias-mercadeo-5ejemplos-empaques-creativos. 41 7. ¿Cómo predecir la vida de anaquel de la carne? En la práctica comercial y de desarrollo de nuevos productos, se han establecido cinco principales formas de determinar la vida de anaquel de un producto: valores encontrados en la literatura (biblioteca de datos), devolución o rechazos (durante la distribución), pruebas de distribución en condiciones extremas, reportes al departamento de quejascalidad y pruebas de vida en anaquel (aceleradas). Diversos autores, tienen como base estos puntos, y otros más concuerdan en que el primer punto es identificar los parámetros que indique que el producto llegó al fin de la vida de anaquel. Estos incluyen propiedades estructurales y mecánicas de los alimentos, propiedades extrínsecas tales como empaque, temperatura, atmósfera gaseosa, etc., y características intrínsecas como el pH, Aw, HR, disponibilidad de nutrientes, desarrollo microbiano, potencial redox, color, apariencia y factores relativos al proceso de elaboración, mantenimiento y manipulación final (Arinder y Borch, 1999; Baranyi y Roberts, 1994; Beales, 2004; Brody, 2003; Buchanan, 1993; Bradley et al., 2011, Gibson et al., 1987 y 1988). Una vez que los parámetros son obtenidos, es importante establecer los límites, niveles o concentraciones que generen productos inaceptables; para así establecer una calificación final sobre la exactitud de la predicción (Houtsma et al., 1996, Karakaya et al., 2005, Moore y Sheldon, 2003b). 7.1. Biblioteca de Datos Las industrias de alimentos, durante el desarrollo de nuevos productos, llevan un control estricto de sus pruebas; sin embargo, los datos generados con ciertas especificaciones, no pueden ser aplicados a productos desarrollados en condiciones completamente diferentes, lo que puede llegar a ser un grave problema. Aunque la empresa solo produzca salchichas, no puede pensar que todas serán iguales; sin embargo, la adecuada clasificación de datos, puede ayudar a estimar la vida útil de un nuevo producto basado en las referencias almacenadas. El problema de esta metodología es que generalmente, los datos son muy limitados y la mayoría son de alimentos específicos y producidos en condiciones diversas. Por supuesto, dentro de una compañía el departamento de desarrollo puede usar sus propios datos para la predicción de la vida de anaquel de un nuevo producto, dando buenas estimaciones sin realizar pruebas. 42 Esta herramienta, normalmente es la primera que se utiliza para sondear los posibles resultados durante el diseño del empaque y estimación de la vida en anaquel de un producto (García y Gago, 2006, Labuza et al., 1992, Shimoni y Labuza, 2005, Gutiérrez, 2011). 7.2. Durante la distribución En cualquier industria con adecuada logística y sistemas de gestión de calidad, se pueden usar las bases de datos referentes a los tiempos y temperaturas registrados durante la distribución de sus productos fuera de la fábrica, para aplicarlos a un nuevo producto. Esto no requiere de ninguna comprobación, si se está generando un nuevo producto, ayudaría a determinar el tiempo durante la distribución. Se basa en obtener datos reales del tiempo de almacenamiento y de estabilidad del producto en el hogar del consumidor, mediante encuestas telefónicas o personales y así hacer un modelado del tiempo de vida del producto bajo condiciones de abuso y obtener una mejor estimación. Si no existe ningún producto similar, este método no puede usarse; en este caso, también pueden ser los datos comparables con datos de la literatura o de informes internos de la industria (Almonacid-Merino y Torres, 1993; Berge et al., 2003, Gutiérrez, 2011). 7.3. Pruebas de distribución en condiciones extremas Cuando ya se ha avanzado o se tienen indicios de la vida de anaquel de un producto, o bien si este ya se encuentra en el mercado, se puede usar un método de prueba de distribución en condiciones extremas. Esta forma de estimación se basa, en que el producto debe ser adquirido del supermercado y almacenado en el laboratorio bajo las mismas condiciones de uso que en el hogar (es necesario, hacer un sondeo de las condiciones de almacenamiento en el hogar, así como monitorear la variabilidad de temperaturas de los refrigeradores en casa), donde se harán las determinaciones pertinentes de calidad. 43 Cabe señalar, que es de gran cuidado considerar el tiempo que lleva el producto fuera de la planta de proceso, previo a la compra en el supermercado. Por ello, existe muy poco reportado en la literatura, aunque este método ha sido usado por diversos grupos de investigación o industrias. Cuando se requiere establecer las cualidades de un nuevo producto, esto se realiza comparando los ya existentes con el prototipo a fin de mejorar las características y aportar un producto de calidad Almonacid-Merino y Torres, 1993; Fernández y Peck, 1997). 7.4. Departamento Quejas-Calidad En el departamento de quejas, devoluciones y control de calidad, se genera mucha información acerca de los productos comercializados, lo cual puede ser una fuente interesante de información, que no requiere de mucha inversión. Los datos recabados se usan como base para determinar si está ocurriendo algún problema de conservación del alimento, además de saber si la variación fue aislada, de lote o bien de formulación. La información es alimentada en una base de datos, donde se incluyen todos los por menores acerca del reclamo y la calidad del producto, con la posibilidad de recoger el producto y hacer un análisis fisicoquímico-microbiológico del problema (Rodríguez, 2003). De esta información, se puede obtener una idea del abuso de temperatura, de posibles defectos en el producto, del modo y la causa del deterioro. Normalmente, se tiene registrado que por cada visita hay otros 50-60 casos que han encontrado modificaciones en el alimento y que no reportan lo sucedido. La industria infiere que los clientes insatisfechos representan una proyección de tres años en el volumen de venta perdido; a partir de este número se puede determinar el costo de los ingredientes, proceso y empaques o si los cambios de la distribución serían económicamente factibles para mejorar la vida útil. Este acercamiento global puede usarse junto con cualquiera de los tres métodos descritos anteriormente (Gutiérrez, 2011). 7.5. Vida en Anaquel Se utiliza para este procedimiento técnicas probabilísticas, suponiendo que los tiempos de vida de los productos, se comportan de acuerdo a una distribución normal. 44 Se deben de estimar los parámetros de dicha distribución (media y desviación estándar), con los cuales se puede inferir estadísticamente sobre el tiempo de vida. Para poder estudiar adecuadamente la vida en anaquel, se deberá hacer una búsqueda exhaustiva sobre el alimento en otra fuente de datos, con el fin de definir las posibles alteraciones que puedan acontecer durante el almacenamiento y la forma adecuada de determinar estas variaciones. Sin embargo, bajo condiciones normales, las pruebas tienden a ser muy largas, por ello se busca reducir el tiempo de prueba, mediante equipos que permiten controlar y reducir el tiempo equivalente en el anaquel, aunque por el costo, algunas de estas metodologías son poco factibles, por lo que se puede recurrir al uso de pruebas aceleradas (Labuza y Fu, 1993; Labuza et al., 1992, Luño et al., 1998). 7.6. Pruebas Aceleradas Estos estudios se realizan sometiendo al alimento a condiciones de almacenamiento que aceleran las reacciones de deterioro, estas condiciones pueden ser de temperatura, presiones parciales de oxígeno, o contenidos de humedad altos. Este tipo de técnicas, llegan a ser costosas debido al equipo. Si bien existen equipos muy austeros, los hay muy sofisticados, en ambos existen diversas sensibilidades a mantener las condiciones de almacenamiento. El seguimiento del deterioro del alimento a las temperaturas seleccionadas, se realiza determinando parámetros fisicoquímicos, microbiológicos o sensoriales correspondientes a cada caso, que permitan explicar los cambios durante el almacén (Li y Torres, 1993). El uso y procesado de los datos generará una adecuada estimación de la vida de anaquel; para esto, lo más adecuado son los modelos matemáticos que describen el efecto de la condición seleccionada, para luego estimar la durabilidad en las condiciones normales de almacenamiento. La idea de éste tipo de pruebas aceleradas, es almacenar el producto empacado bajo alguna condición desfavorable, y analizar periódicamente la carne, hasta que llegue al final de su vida en anaquel y así estimar la vida útil del producto bajo verdaderas condiciones de distribución (Kennedy et al., 2004). 45 Figura 16. Comparación de los colores en carne de res molida cocida de acuerdo al estado de oxidación de la mioglobina en la carne cruda, foto tomada de http://www.beefresearch.org (arriba) y efecto del tiempo sobre las características de carne molida de res empacada en película permeable al oxígeno (abajo). Este método no tiene problemas técnicos, pero debe tenerse cuidado al interpretar los resultados obtenidos y su extrapolación a otras condiciones. Por ejemplo, cuando se prueba el sistema producto-empaque, el empaque también controla la vida útil; pero si se escoge un nuevo empaque con propiedades diferentes, el modelaje anterior no puede ser usado, por ello, todas las pruebas deberán ser bajo las mismas condiciones en que se realizó el estudio. Si las condiciones de pruebas aceleradas son establecidas previamente, y se usan los diseños apropiados, entonces se puede predecir la vida útil para cualquier alimento. El diseño de una prueba acelerada requiere del uso de recursos de otras ciencias y deberán ser aplicadas con mucha cautela (García y Gago, 2006; Marth, 1998). 46 Figura 17. Modificación de la apariencia de carne de res empacada al vacío bajo dos diferentes condiciones de temperatura. Para predecir la vida de anaquel de un producto cárnico o carne fresca, es necesario considerar algunos puntos para hacer más eficiente el modelo obtenido (Restrepo y Montoya, 2010): 1.- Identificar y/o seleccionar la variable que afecte en mayor medida la calidad del producto. La variable puede ser la rancidez, producción de aminas biogénicas, cambios en el color, sabor o textura, inclusive la aparición de microorganismos en la superficie. 2.- Estandarizar las metodologías para determinar las variables previamente seleccionadas, para ello se emplearán técnicas aceptadas por organismos reguladores o bien, técnicas que tengan una adecuada comparación con respecto a estándares de reacción. 3.- Analizar la cinética de la reacción asociada a la variable seleccionada, esta dependerá en gran medida de factores extrínsecos. Hay que relacionar los límites de calidad establecidos tanto por el consumidor como por la legislación alimentaria (NOM’s y NMX’s). 47 4.- Someter a estrés el producto, bajo condiciones de almacenamiento controladas y monitoreadas a cierto periodo de tiempo, para ser comparables con controles tanto positivos como negativos de almacenamiento, en este punto la previa estandarización de técnicas tiene gran peso, ya que se reducirá al mínimo el error asociado a proceso. 5.- Utilización de modelos matemáticos, pruebas in situ y pruebas aceleradas para posteriormente predecir bajo condiciones menos severas. Al haber llenado las bases de datos y haber corrido los estadísticos pertinentes, se generarán los modelos, una vez obtenidas las condiciones adecuadas es conveniente aterrizarlas a condiciones reales (Rodríguez, 2003). En términos generales, la pérdida de calidad de los alimentos se representa mediante diversas ecuaciones, la más común es la siguiente, que representa una diferencial (un cambio) con respecto al tiempo: ݇ܣ ݀ ܣൌ ݀Ʌ En donde A es la variable de calidad en estudio, Ʌ el tiempo, k es la constante dependiente de la temperatura y la actividad del agua (Aw) y n es el orden de reacción, que define si la tasa de cambio del alimento o variable A en el tiempo depende o no de la cantidad de este atributo. Si la ecuación se refiere a pérdidas lleva un signo negativo, pero si expresa la aparición de productos no deseados es positiva (Labuza y Roboth, 1982). 7.6.1. Prueba acelerada Q10 El principio de una prueba acelerada puede ser aplicado en la llamada prueba Q10 para determinar la vida de anaquel de un producto. Q10 es un factor de aceleración o proporcionalidad por el que se multiplica la constante de velocidad de una reacción (k), cuando se incrementa en 10ºC la temperatura a la que se realiza la prueba. Permite calcular la vida útil real a partir de datos obtenidos de forma acelerada (Labuza y Fu, 1993). ܳଵ ൌ ݇ ்ାଵ Τ݇ܶ 48 La tasa Q10 es qué tan rápido se llega a los límites críticos de las variables de respuesta que califican la vida de anaquel cuando la temperatura de almacenamiento es incrementada en comparación con las muestras control. Si la temperatura ideal de almacenamiento de un producto es 2ºC, para calcular la vida de anaquel ahora almacenado a 12ºC, se evalúa usando la siguiente ecuación: ͳͲ ܳଵ ൌ ሺܴଶ Τܴଵ ሻሺ ሻ ܶଶ െ ܶଵ Aplicando esto, supongamos que un procesador elabora una producto cárnico empacado en película permeable al oxígeno, el cual pierde su color después de 60 días de refrigeración (2ºC) y tiene una vida de anaquel establecida a 90 días (R1=1/90). El producto ahora empacado al vacío podría ser almacenado a 12ºC y nuevamente evaluado hasta que el producto pierda su color. Si esto sucede a los 60 días (R2=1/60), la tasa Q10 es de 1.9 (Q10=((1/60)/(1/90))(10/(12-2) = 1.9). Por lo tanto, si se elabora nuevamente el mismo producto con los mismos ingredientes, posiblemente también pierda el color después de 60 días de almacenamiento a 12ºC, pero si es empacada al vació, la vida de anaquel puede ser estimada hasta 114 días a 2ºC, puesto que Q10 = 1.9*60 días = 114 días. La prueba Q10 es un excelente método para determinar la vida de anaquel de un producto alimenticio, sin embargo hay que tomar en consideración que si se aumenta la temperatura esta puede conducir a un riesgo de inocuidad, por lo tanto, existe la posibilidad de cambiar el tipo de empaque. Retomando, el color puede ser un factor finalizador de la vida útil del producto a 2ºC, pero el crecimiento microbiano tendría mayor peso al ser almacenada a 12ºC. Es importante asegurarse que los niveles de los parámetros de estudio (color, oxidación, microbiológicos) no cambien para un producto conforme aumenta la temperatura de almacenamiento. En ese caso, sería posible hacer cambios más pequeños en la temperatura de almacenamiento y conducir más estudios de vida de anaquel acelerada (Labuza y Fu, 1993). 49 7.7. Clasificación de los modelos predictivos Para poder analizar los datos de las pruebas aceleradas, se han desarrollado diversos métodos para estimar la vida de anaquel. Estos modelos dan la mayor relevancia a la microbiología, principalmente por sus implicaciones en inocuidad, y sus obvias consecuencias sobre el consumidor y el producto (Whiting y Buchanan, 2001). Por supuesto, no se pueden dejar de lado desde el punto comercial, otros parámetros que son muy relevantes como la rancidez (variable pocas veces reportada), el color y la textura. Tomando en consideración el aspecto microbiano, se describen a continuación algunas herramientas estadísticas (McMeekin et al., 1993 y 1997; Ross, 1996). 7.7.1. La carne y la microbiología predictiva La carne es un excelente medio de cultivo para toda clase de microorganismos, por ser una matriz compleja, altamente nutritiva, biodisponible y con condiciones favorables de pH muy cercanos a la neutralidad (5.5-6.5). Esto representa condiciones ideales para que, muchas bacterias y hongos sean capaces de crecer; lamentablemente, esto incluye a microorganismos patógenos y deteriorantes. Es por ello que desde el momento del sacrificio, hasta la llegada del producto al consumidor final, deben mantenerse las características organolépticas y de sanidad de la carne (Ratkowsky et al., 1982 McMeekin et al., 1993, Moore y Sheldon, 2003b). Antes de abordar las herramientas para estimar la vida de anaquel a través de los microorganismos, es conveniente recordar como es el ciclo de crecimiento de una población de microorganismos, el cual consta de cuatro fases: latencia (Lag en Inglés), exponencial, estacionaria y muerte. Para que un producto sea preservado por largo tiempo, desde el punto de vista microbiológico se puede actuar en dos diferentes formas, eliminar la carga bacteriana o disminuir su velocidad de crecimiento que sea cercana a cero en la fase de latencia. La mayor cantidad de bacterias deteriorantes son mesófilas (pues crecen entre 15 - 37ºC). Por esto, es importante enfriar rápidamente la canal de los animales recién faenados, para reducir la temperatura del animal que está entre 38 – 42ºC a menos de 8ºC para minimizar la velocidad de crecimiento. 50 El mal manejo de la temperatura, que principalmente implica fallas en la cadena de refrigeración, favorece el crecimiento microbiano, y es la principal causa de origen de enfermedades transmitidas por alimentos, debido a que se asocia con el crecimiento de bacterias patógenas, las cuales alcanzan niveles que causan enfermedades o intoxicaciones (Ratkowsky et al., 1982). Uno de los factores más importantes en la vida de anaquel es la carga inicial de bacterias en la carne. Dependiendo de qué tan grande sea la carga inicial, será la población final que se alcance en una carne durante su vida útil. Las bacterias se reproducen exponencialmente, por lo que una población inicial alta, resultará en menor tiempo para alcanzar los niveles en que la carne se descomponga (Zwietering et al., 1990 y 1991). La flora microbiana de la carne está conformada de bacterias Gram positivas (micrococos, bacterias lácticas, Shewanella putrefaciens y Brochotrix thermosphacta) y Gram negativas (Pseudomonas spp. y enterobacterias). Otros grupos presentes en menor medida son las bacterias saprófitas Gram positivas (Kurthia y algunos estafilococos no toxigénicos). Los microorganismos patógenos y toxinogénicos provienen por lo general del tracto gastrointestinal de los animales faenados, de animales enfermos o de contaminación cruzada debida a los operarios (Tirado et al., 2005). El género Pseudomona, se caracteriza por producir metabolitos como amoniaco, aminas biogénicas, SH2, etc., cuando la población llega a >107 ufc/g; la concentración de aminas biogénicas llega a usarse como indicador de la calidad de los productos cárnicos y existe técnicas por HPLC ya establecidas que permiten la determinación (Arinder y Borch, 1999; Lebert et al., 2000). Las BAL (bacterias acidolácticas), pertenecientes a la familia Micrococcaceae producen ácido láctico (llegando a pH <5.3) y péptidos bioactivos llamados bacteriocinas, cuando la población en el alimento llega a ≥109 ufc/g; se tiene la ventaja de que este grupo crece más lentamente a bajas temperaturas y condiciones anaerobias, siendo un competidor fuerte con la flora filogenéticamente semejante. La inhibición de cierto tipo de bacterias aerobias Gram-negativas llega a aumentar la calidad de los productos, una alternativa es la inoculación de BAL, obtenidas de productos semejantes, para que puedan desarrollarse más rápidamente y se adapten al medio (Samelis et al., 2000, Tirado et al., 2005). 51 Las bacterias causantes de deterioro son en su mayoría psicrófilas (pueden crecer a temperaturas entre 0 y 4°C) con una velocidad de crecimiento baja, la cual es incrementada cuando se producen abusos de temperatura en algún punto de la cadena de frío (Tirado et al., 2005). El crecimiento comienza típicamente con el consumo de carbohidratos (glucosa) y oxígeno superficial, los principales grupos bacterianos son Pseudomonas spp. y Brochothrix thermosphacta. La fuente de carbohidratos es muy baja en la carne, y si la población microbiana sobrepasa 8 Log, se favorecerá el consumo de compuestos nitrogenados (aminoácidos), con el desarrollo de aromas rancios asociados a la oxidación de ácidos grasos de cadena medianamente larga y la generación de metabolitos secundarios como son las aminas biogénicas (Rokka et al., 2004, Baranyi et al., 1995) Salmonella spp, S. aureus, L. monocytogenes, Y. enterocolitica, S. flexineri y E. coli O157:H7 son microorganismos frecuentes en productos de origen animal refrigerados, la mayoría pueden tener tolerancia a sales y crecer muy fácilmente; aunque los productos cárnicos tiene sales en su composición, el efecto protector de estas no es suficiente para inhibir el desarrollo de los microorganismos en la materia prima (Tirado et al., 2005, Buchanan y Klawitter, 1992; Buchanan et al., 1993b y 1994). Se ha determinado, que para que exista un cuadro de enfermedad (infección intestinal) en un adulto, la carga mínima para Salmonella spp es de 10 células en 100 g de carne, aunque a bajas temperaturas se vuelve un competidor débil. L. monocytogenes es también un microorganismo con el que se debe tener sumo cuidado, ya que a partir de 100 células puede causar septicemia, meningitis y encefalitis, es una bacteria que tiene un rápido crecimiento a bajas temperaturas y es relativamente tolerante a factores como el NaCl y valores de pH reducidos. Sin embargo, la exposición a estrés de la bacteria la vuelve tolerante a dichos factores y puede inducir resistencia aún a los antimicrobianos empleados (Tirado et al., 2005, Buchanan y Klawitter, 1990). Y. enterocolitica es un microorganismo común en aves y cerdos, suele crecer lentamente a bajas temperaturas y se han asociado infecciones con el ser humano, aunque no se sabe exactamente la dosis de acción. C. perfringens y B. cereus pueden sobrevivir aun después de tratamientos térmicos, debido a que tienen la capacidad de formar esporas de resistencia que permanecen latentes durante el tratamiento y se activan aún a bajas temperaturas (SmithSimpson y Schaffner, 2005, Amezquita et al., 2005). 52 Los investigadores de la microbiología predictiva (MP) se han enfocado a modelar el efecto de la fluctuación de temperatura a la que se almacenan los alimentos, sobre las primeras dos fases de desarrollo microbiano, bajo la premisa de que si la población microbiana alcanza la fase estacionaria, el producto está deteriorado o presenta riesgos para la salud del consumidor (Buchanan, 1993; Ross, 1996; McMeekin et al., 1993; Baranyi y Roberts, 1995). Si se conoce el comportamiento de la flora bacteriana durante una operación de procesado o en un producto cárnico, se podría estimar la supervivencia y/o crecimiento de un microorganismo de interés. Estas estimaciones, se basan en la relación matemática que existe entre la velocidad de crecimiento microbiana y las condiciones ambientales (Baranyi y Roberts, 1995). Esto significa que se puede estimar la calidad y seguridad alimentaria, si se conoce la carga microbiana inicial y se monitorean las condiciones de almacenamiento (temperatura, atmósfera gaseosa, etc.), o las propiedades intrínsecas del alimento (Aw, pH, fuerza iónica, solubilidad y polaridad) y posteriormente, se aplica una base de modelos predictivos. El crecimiento, supervivencia e inactivación de los microorganismos en los alimentos son respuestas reproducibles, es por ello que los modelos predictivos sirven para evaluar de forma combinada el efecto de factores ambientales que puedan alterarlos. En la figura 18, se observan curvas de desarrollo microbiano para Brochothrix thermosphacta, donde a 2ºC el desarrollo se inhibe, pero a medida que se incrementa la temperatura en el medio de cultivo, la densidad óptica de microorganismos aumenta incrementando la velocidad de desarrollo (Baranyi et al., 1995). Por lo tanto, la MP se convierte en una herramienta económica y rápida para satisfacer este objetivo. En consecuencia, se puede utilizar el modelo predictivo para establecer, si los posibles cambios durante el procesado afectarán la estabilidad y vida de anaquel del producto. La MP es una herramienta muy plástica, ya que además de modelar el efecto de la temperatura sobre productos cárnicos en las etapas de distribución y comercialización, también puede ser aplicada para predecir el crecimiento microbiano en la fase de enfriamiento después de un tratamiento térmico. Estudios con C. perfringens determinaron la cinética de inactivación con un modelo después de haberse llevado a cabo el tratamiento térmico y encontrarse el producto durante la fase de enfriamiento (Huang, 2003; Smith-Simpson y Schaffner, 2005). 53 0.40 Log OD (600 nm) Ciclos de 24 h a 2 °C y 24 h a 14 °C Experimental Predicción 95% intervalo de confianza Constante 14°C 0.10 Constante 8 °C Constante 2 °C No hay crecimiento 0.02 0 50 100 150 Tiempo (h) 200 250 300 Figura 18. Predicción y determinación experimental del crecimiento microbiano bajo fluctuaciones de temperatura (Brochothrix thermosphacta, Simpson et al., 1989). Los modelos usados en MP (cuadro 4), se sustentan en el uso de matemáticas avanzadas, y son en general, de naturaleza empírica pero con bases bien estructuradas, incluyen conceptos de crecimiento, disponibilidad de nutrientes, crecimiento en función de la densidad poblacional y del tipo de poblaciones, antimicrobianos, etcétera (McMeekin et al., 1993, Moore y Sheldon, 2003b). Sin embargo, para incorporar los factores externos, tales como temperatura, pH, o HR, es común obtener curvas de crecimiento para diferentes combinaciones de factores externos y luego realizar regresiones de los efectos de estos factores sobre los parámetros del modelo. Adicionalmente, se ha estimado la temperatura del alimento en su empaque en función de la temperatura de almacenamiento, para predecir el efecto de la temperatura de refrigeración sobre el crecimiento de los microorganismos. Estos requerirán la integración de modelos numéricos de transferencia de calor en conjunto con modelos secundarios y primarios, que se describirán más adelante (Amezquita et al., 2005). 54 Cuadro 4. Modelos más usados en la microbiología predictiva. Modelo Características Gompertz Curva sinusoidal asimétrica (fases latencia, exponencial y estacionaria). Existe una subestimación de la velocidad de crecimiento, requiere datos a lo largo de las fases; para ambientes con temperatura variable, sus parámetros deben ser trabajados con modelos secundarios. Log logistic Modelo primario. Incorpora el termino 1-N/Nmax, la velocidad de crecimiento decrece hasta ~0, genera una curva convexa. Carece de estudio en fase de latencia. Agregar términos que permitan modelar la fase latencia propicia menor calidad en los resultados. Ratkowsky Modelo secundario. Permite modelar la velocidad de crecimiento en función de la temperatura e incorporarla en un modelo primario. Sólo garantiza buena predicción en el rango de temperatura experimental. No hay consistencia en el crecimiento microbiano por variaciones en la temperatura. Baranyi Roberts y Modelo primario. Introduce una variable asociada al consumo de un nutriente limitante. La fase de latencia se expresa mediante una función del estado fisiológico de las células, permite la modelación de las fases de latencia y exponencial en forma continua. Predice el crecimiento bajo fluctuaciones de temperatura. Modelos Modelos secundarios y primarios, que permiten la modelación de varios factores de crecimiento en forma Polinominales simultánea y de forma más precisa, en general la curva es un ajuste de los datos por técnicas de regresión. Tiene naturaleza netamente empírica y falta de fundamentos mecanísticos. Transferencia de calor 55 Predice el crecimiento microbiano en función de la temperatura del alimento, incluye la transferencia de calor en modelos predictivos primarios y secundarios. 4°C 6°C 10°C 15°C 20°C 25°C Figura 19. Obtención de gráficos para microbiología predictiva, se observa experimentalmente que a medida que la temperatura se incrementa en microorganismos mesófilos, la velocidad de crecimiento aumenta. 7.7.2. Modelos ciné ticos y probabilísticos Los estudios de vida útil se basan en la teoría cinética (Labuza y Riboth, 1982; Labuza y Fu, 1993), por la cual la velocidad de decaimiento de una propiedad o atributo del alimento se expresa: ܸ ൌ േ ݀ܣ ൌ ݇ሺܣ ሻ ݀ݐ Donde, V = velocidad de reacción, A = atributo de calidad que estamos midiendo, t = tiempo de vida comercial transcurrido, k = constante de velocidad de reacción, A0 = concentración inicial del atributo y n = orden de la reacción (Baranyi y Roberts, 1995; Buchanan, 1993). La mayoría de las reacciones de deterioro estudiadas en los alimentos se han caracterizado de orden aparente 0 ó 1, a continuación se muestran los ejemplos correspondientes o los diferentes órdenes de reacción (Bell y Labuza, 1994): • Orden cero: En este caso, la velocidad de la reacción no depende del valor de la propiedad del alimento, por lo tanto, el atributo de calidad varía de forma lineal con el tiempo. 56 Por lo regular, estas reacciones se dan por diversas moléculas a nivel de superficie. Algunos procesos de degradación se muestran después de la ecuación de orden cero. ܣൌ ܣ െ ݇ ݐݐ כൌ ܣെ బ - Oxidación de lípidos (enranciamiento) en carne o producto cárnico. - Modificación del color en la carne o productos cárnicos. • Primer orden: Normalmente se basa en los cambios con respecto al tiempo, ya que la velocidad de la reacción depende de la concentración de la propiedad del alimento (el atributo de calidad varía de forma exponencial con el tiempo). Algunos procesos de degradación se muestran después de la ecuación de primer orden. ܣൌ ܣ ݁ ି௧ ݐൌ ܣ݊ܮെ ܣ݊ܮ ݇ - Pérdida de valor nutritivo (vitaminas), como del complejo B, siendo la carne la principal fuente. - Desarrollo/muerte microbiana, debido a antimicrobianos o por las condiciones de elaboración del producto cárnico, efecto directo del empaque. - Pérdida de color por oxidación, directamente sobre la oxidación de pigmentos o grasa. - Pérdida de textura en tratamientos térmicos, modificaciones a productos procesados, como jamones cocidos. • Segundo orden: En este tipo de reacciones, se pueden estudiar hasta dos variables de respuesta, haciéndola más real a las condiciones del producto, ya que cuando existe un cambio no solo afecta un parámetro de calidad sino muchos. La velocidad de la reacción depende del cuadrado de la concentración de la propiedad o del producto de dos de las propiedades del alimento (PA, PB). േ 57 ݀ܳ ൌ ݇ሺܲ ܲ כ ሻ ݀ݐ - La degradación de vitaminas y pigmentos (depende de la concentración de minerales y oxígeno en el alimento), solo en conjunto dos o más variables podrían generar ecuaciones de segundo orden. Los modelos de predicción microbiológica, pueden ser derivados de teorías mecánicas o de la teoría de probabilidades, lo cual definirá el fundamento matemático de cada modelo que terminará siendo cinético o probabilístico. La elección y su aplicación específica, está ampliamente determinada por el tipo de microorganismo y la variable respuesta. a. Modelos cinéticos: Los modelos cinéticos predicen la magnitud y velocidad de crecimiento de un organismo. Relacionan las propiedades extrínsecas que afectan el desarrollo de una población bacteriana. Pueden utilizarse para predecir cambios en el número de microorganismos con respecto al tiempo, incluso el efecto de una variable sobre el crecimiento (Baranyi et al., 1996). En la internet, existen diversas páginas que tienen acceso a modelos cinéticos microbiológicos, también pueden ser agrupados dentro de los modelos terciarios (Dalgaard et al., 2002). Cuadro 5. Modelos usados en la MP a travé s de internet. Modelo ComBase Características Convierte los datos en respuestas microbianas dependiendo de las condiciones de almacenamiento del alimento. http://www.combase.cc/ Programa de Modelado de Patógenos (PMP) Compendio de modelos que se pueden utilizar para predecir el crecimiento y la inactivación de las bacterias patógenas, en diversos alimentos y condiciones de almacenamiento. http://www.ars.usda.gov/Services/docs.htm?docid=6786 Growth Predictor Conjunto de modelos para predecir el crecimiento de los microorganismos en función de factores extrínsecos (temperatura, pH y Aw). Algunos modelos incluyen como factor adicional, la concentración de dióxido de carbono o de ácido acético. http://ifr.ac.uk/Safety/growthPredictor/ Perfringens Predictor Simulación del crecimiento de C. perfringens durante el enfriamiento de carnes. http://ifr.ac.uk/Safety/growthPredictor/ 58 b. Modelos probabilísticos: Calcula la posibilidad de que un fenómeno o evento en particular pueda ocurrir bajo ciertas condiciones. Los modelos de probabilidad también se basan en la relación de crecimiento y propiedades extrínsecas ambientales, es decir en la posibilidad de encontrar ciertos microorganismos y que estos crezcan y produzcan sus metabolitos en un periodo de tiempo determinado, toman como base el desarrollo de microorganismos esporulados (C. botulinum). Cuando se estime la probabilidad del evento, esta servirá como punto de decisión para finalmente establecer las condiciones del producto, durante el procesado y almacenamiento. Los modelos probabilísticos son los más apropiados cuando se requiere monitorear la aparición de compuestos secundarios del metabolismo microbiano (aminas y toxinas, principalmente) que tienen impacto sobre la salud de los consumidores (Buchanan et al., 1997). También se ha propuesto el uso de modelos cinéticos para generar modelos probabilístico, debido a esto, se han planteado modelos de regresión para determinar la probabilidad de crecimiento bacteriano a varias condiciones (pH, temperatura, sal y nitrito de sodio). El uso de ambos modelos tiene como finalidad incrementar la robustez de los modelos de la MP. Los modelos, dependiendo de dónde provengan los resultados y las herramientas empleadas para generarlos, ya sean cinéticos o probabilísticos, pueden ser agrupados en primarios, secundarios y terciarios (Labuza y Fu, 1993; Arinder y Borch, 1999; Baranyi et al., 1993b, Baranyi y Roberts, 1995). Los modelos “Primarios”, describen los cambios en el número de bacterias en función del tiempo. La metodología común es usar la microbiología experimental básica como el recuento de células viables (vertido en placa o número más probable) y la formación de compuestos secundarios (por técnicas espectrofotométricas); para generar los suficientes datos del crecimiento microbiano: tiempo de regeneración, duración de la fase Lag, velocidad de crecimiento y densidad de la población. Si la curva de crecimiento de un género de bacterias se monitorea registrando los recuentos de colonias durante el tiempo, los datos se pueden trazar usando un modelo primario. Esto puede generar información sobre los microorganismos como tiempo generacional, duración de la fase, tasa de crecimiento exponencial y densidad poblacional máxima (Buchanan et al., 1993b, Ross, 1996; Zwietering et al., 1990 y 1991). 59 7.7.2.1. Modelo de Gompertz La función de Gompertz describe los datos de crecimiento bajo condiciones experimentales mediante una relación matemática. Se asume que la velocidad de crecimiento disminuye con el tamaño de la población, debido a la falta de nutrientes en el medio. La ecuación es una función doble exponencial basada en cuatro parámetros que se describen en una curva sigmoidea asimétrica (Buchanan et al., 1997). En este tipo de representación se puede observar un crecimiento muy lento en dos etapas, al inicio y al final de la curva, debido a la propia naturaleza de los microorganismos, entonces, si se monitorean y definen con precisión estas etapas de la curva, se puede caracterizar a diferentes microorganismos en diversos ambientes (Baranyi et al., 1996, Berger, 1981; Buchanan, 1993a; Vainionpää et al., 2004). ܰ݃ܮൌ ܣ ି ݁ܥ షಳሺషಾሻ Los términos de la ecuación son: Log N que es logaritmo decimal del número de microorganismos al tiempo t, A es el valor asintótico cuando el tiempo decrece indefinidamente, C representa el incremento en el logaritmo del número de microorganismos cuando el tiempo se incrementa indefinidamente (número de ciclos de crecimiento), B es la velocidad de crecimiento máxima relativa al tiempo M que es el tiempo requerido para alcanzar la máxima velocidad de crecimiento; posteriormente, la ecuación se ajustó para quedar como: ܻ௧ ൌ ܻ ି ݁ܥ షಳሺషಾሻ Donde Yt es el logaritmo de UFC/mL en el tiempo t, Y0 es el logaritmo del inóculo, C es el cambio en el número de células entre el inóculo y la fase estacionaria, B es la velocidad o tasa de crecimiento relativa, y es el tiempo al que se alcanza la velocidad máxima de crecimiento. La fase de adaptación o latencia y la velocidad de crecimiento exponencial se calculan a partir de las siguientes ecuaciones: ݊×݅ܿܽݐܽ݀ܽ݁ݏܽܨൌ ܯെͳ ܤ 60 ܸ݈݁ ݈ܽ݅ܿ݊݁݊ݔ݁ݐ݊݁݅݉݅ܿ݁ݎܿ݀ܽ݀݅ܿൌ ܥܤ ݁ Junto con la fase de adaptación y la densidad máxima de población, la velocidad o tasa máxima de crecimiento de la curva son los parámetros cinéticos más importantes. Esta última mide la pendiente de la curva de crecimiento cuando el microorganismo crece exponencialmente (Gutiérrez, 2011). Normalmente, este parámetro es estimado según la parte de la curva que sea lineal a través de la pendiente por regresión lineal. La pendiente de la parte de la curva que tienda a ser lineal será una relación de primer orden. Figura 20. Parámetros ciné ticos obtención de las curvas de crecimiento microbiano, mediante el modelo de Gompertz. Posteriormente, la ecuación de Gompertz fue modificada, para incluir tres parámetros de interés que en las anteriores ecuaciones daban por incluidos (Zwietering et al., 1990 y 1991): la velocidad de crecimiento (m) que dependerá del microorganismo, fase de adaptación () que se basa en la fase Lag y la máxima densidad de población (A) que será relacionada con la cantidad de nutrientes, la inclusión tuvo como finalidad incrementar la precisión de la estimación, buscando un mayor campo de predicción al incluir más parámetros y así obtener la siguiente ecuación: 61 ݕൌ ି ݁ܣ ሾഋȀಲሻሺഊషሻሿశభ Revisión bibliográfica microorganismo crece exponencialmente. Normalmente este parámetro es estimado decidiendo cuál es la parte de la curva que es aproximadamente lineal y posteriormente Donde A es la asíntota del recuento decimal cuando el tiempo desciende indefinidamente determinando la pendiente de ésta por regresión lineal (Zwietering y col., 1994a). La (1/UFC); “y” es el logaritmo del tamaño de la población; m es la tasa máxima específica pendiente de la parte de la curva propuesta a ser lineal es una relación de primer orden. de crecimiento; es la duración de la fase de adaptación, t es el tiempo. Hasta la fecha La representación de la ecuación de Gompertz (1) se puede observar en la Figura 1. las dos ecuaciones modificadas de Gompertz son las más ampliamente usadas, no se quiere decir, que no se hayan hecho más modificaciones, sino que son la base de los modelos que se desarrollaron subsecuentemente (Zwietering et al., 1994). 10 9 C 8,57 M 23,0 B 0,0935 8 Log N (ufc/ml) 7 B 6 C 5 4 Tiempo de generación ==Log (2)e/BC h hh Tiempo dede generación Log (2) (2)e/BC e/BC= =1.021 1.021 T iempo generación = Log = 1,5 Velocidad de crecimiento exponencial = 0.29 Velocidadde decrecimiento crecimientexponencial o exponencial = 0,20 Velocidad = 0.29 (log ufc/ml)/h (log ufc/ml)/h (log ufc/ml)/ h Duración de de fase de latencia = M=- M 1/B- = 12.3 h Duración fase de lat encia 1/B = 12,4 h Duración de fase de latencia = M - 1/B = 12.3 h 3 2 A 1 0 0 40 80 120 160 200 240 Tiempo (horas) Figura 21. Ejemplo de la aplicación de la ecuación de Gompertz al desarrollo Figura 1. Representación gráfica de la ecuación de Gompertz y sus parámetros cinéticos microbiano. Zwietering y col. (1990) compararon estadísticamente diferentes curvas 7.7.2.2. Modelo Logístico: sigmoidales (modelo logístico, ecuaciones de Gompertz, Richards, Schnute y Stannard) usando t-test y F-test. En la mayoría de(forma Gompertz mostró Es laelrepresentación gráfica más sencillade de los las casos curvas la deecuación crecimiento de S), se y es paraconajustar crecimiento microbiológicos, en como el mejor logística porquemodelo es simétrica respectolos a sudatos punto de de inflexión, de modo que se asume términos exactitud estadística y facilidad de uso. que lade tasa de crecimiento disminuye en función del tamaño de la población, entonces la tasa de cambio será descrita por la siguiente ecuación (Restrepo y Montoya, 2010): ܰ݃ܮൌ ܣܥ ͳ ݁ ିி௧ 16 62 Donde, log N es aplicado a la tasa de crecimiento del microorganismo en estudio, A es la asíntota inferior, C el cambio en el número de células, D es la pendiente de la curva ascendente y F es la velocidad de crecimiento al tiempo medio de la fase exponencial. Se hizo un estudio comparativo (Buchanan et al., 1997) del modelo logístico con la ecuación de Gompertz, en el que estudiando la misma cepa bacteriana, la predicción de Gompertz genera una curva en menor tiempo acortando la fase Lag con un desplazamiento significativo hacia la izquierda de iniciada la cinética (Figura 22). Figura 22. Representación comparativa del desplazamiento de ciné ticas de crecimiento microbiano usando la ecuación de Gompertz contra la Logística. Los modelos “Secundarios” describen la respuesta a una o más variables de un modelo primario, por efecto del tipo de cultivo o de las condiciones del producto (pH, Aw, temperatura). Se basan en estimar tiempos de generación para cada variable a partir de modelos primarios (McMeekin et al., 1993). Después, se hará uso de cálculos para que los datos colectados de la temperatura se apliquen a un modelo secundario. Cuando se incluyen otros factores, como metabolitos secundarios o compuestos de inhibición, se pueden emplear ecuaciones de regresión polinomial, las cuales son muy flexibles, con términos cuadráticos, cúbicos e interacciones, que al ser analizados estadísticamente tienen que explicar el fenómeno y ser significativos. 63 Por ejemplo, si el efecto de la temperatura en el crecimiento de cualquier microorganismo en carne fuera 15 y 40º en C, el crecimiento organismo generaría diversas curvas a Por ejemplo, si elestudiado efecto deentre la temperatura de cualquier microorganismo diversas en este rango temperatura (Labuzageneraría y Fu, 1993). en carnetemperaturas fuera estudiado entre 15 yde40º C, el organismo diversas curvas a diversas temperaturas en este rango de temperatura (Labuza y Fu, 1993). 7.7.2.3. Modelo de Arrhenius 7.7.2.3. Modelo de Arrhenius Proporciona datos de la constante de velocidad con respecto a la temperatura de crecimiento. basadeenlaque a mayores probabilidad que crezca un Proporciona Se datos constante de temperaturas, velocidad conla respecto a ladetemperatura de microorganismo es mayor, el crecimiento generará energía cinética y tendrá un crezca efecto en crecimiento. Se basa en que a mayores temperaturas, la probabilidad de que un la energía de activación decrecimiento las reacciones metabólicas para activar el un crecimiento microorganismo es mayor, el generará energía cinética y tendrá efecto en microbiano y Riboth, la energía (Labuza de activación de1982). las reacciones metabólicas para activar el crecimiento microbiano (Labuza y Riboth, 1982). La ecuación de Arrhenius fue derivada empíricamente basándose en consideraciones termodinámicas: La ecuación de Arrhenius fue derivada empíricamente basándose en consideraciones termodinámicas: ݇ ൌ ݇ ݁ ିாಲ Τோ் ݇ ൌ ݇ ݁ ିாಲ Τோ் Donde, K= constante de velocidad de crecimiento, K0 es la constante de la ecuación de Arrhenius, de activación, R la constante de de loslagases a lade T Donde, K= E constante de velocidad de crecimiento, K0 es universal la constante ecuación A la energía temperaturaEAdel sistema. deEnactivación, esta ecuación se recogen valoresdedelosk gases a diferentes Arrhenius, la energía R la constante universal a la T temperaturas del y sesistema. elabora una que enfrenta lnk contravalores 1/T. La de relación ellas temperatura En gráfica esta ecuación se recogen k a entre diferentes describe una ypendiente –Eque Sin embargo, el crecimiento microbiano es temperaturas se elaboracon unavalor gráfica lnk contra 1/T. La relación entre ellas A/R. enfrenta complejo sonpendiente frecuentescon las gráficas se presenta (con dos pendientes). describe yuna valor –Edonde embargo,linealidad el crecimiento microbiano es A/R. Sin Por este motivo, la ecuación puede donde ajustarse por debajo de la temperatura óptima complejo y son frecuentes lasnográficas se bien presenta linealidad (con dos pendientes). o por encima delalaecuación temperatura mínima para elbien crecimiento (Labuza et al., 1992). Las Por este motivo, no puede ajustarse por debajo de la temperatura óptima gráficas son únicamente exactas en un rango de temperatura el crecimiento o por encima de la temperatura mínima paralimitado el crecimiento (Labuzapara et al., 1992). Las microbiano. modeloexactas es muyen poco utilizado en sistemas alimentarios debido a que gráficas son Este únicamente un rango limitado de temperatura para el crecimiento implica medirEste energías de activación (Ratkowsky 1982). alimentarios debido a que microbiano. modelo es muy poco utilizado etenal., sistemas implica medir energías de activación (Ratkowsky et al., 1982). 7.7.2.4. Modelos de Superficie de Respuesta 7.7.2.4. Modelos de Superficie de Respuesta Las ecuaciones contienen términos lineales, cuadráticos y de interacción, Si la ecuación se más compleja, estará más flexionada a la y superficie multidimensional y Las hace ecuaciones contienen términos lineales, cuadráticos de interacción, Si la ecuación representará mejor los datosestará (Whiting y Buchanan, se hace más compleja, más flexionada2001). a la superficie multidimensional y representará mejor los datos (Whiting y Buchanan, 2001). 64 Están elaboradas a partir de una gran cantidad de datos experimentales y el efecto de una variable puede estar descrito por una ecuación cuadrática, si las otras son constantes. Un ejemplo de este tipo de modelos, para tres variables y de segundo grado, toma la siguiente forma: Ɋ= a+b(T)+c(T) 2 +d(pH)+e(pH) 2 +f(Aw)+g(Aw) 2 +h(T)(pH)+i(T)(Aw)+j(pH)(Aw) Donde: Ɋ es la velocidad de crecimiento; a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, coeficientes de regresión en función de T (temperatura), actividad agua (Aw) y pH. Como se puede observar, la ecuación tiene términos lineales, cuadráticos y de interacción. Cuanto más compleja es la ecuación, con interacciones o términos cuadráticos o cúbicos, más flexionada está la superficie multidimensional y más cercana a los datos reales. Estas ecuaciones pueden ser simplificadas eliminando términos que no son significativos estadísticamente. Debido a que la variación normalmente se incrementa al aumentar la velocidad, tasa de crecimiento o el tiempo, frecuentemente se emplean transformaciones logarítmicas, de raíz cuadrada u otras, con el fin de normalizar la varianza. Las ecuaciones polinomiales se han usado para elaborar modelos que describieran el efecto de hasta cinco variables (temperatura, concentración de NaCl, pH, atmósfera gaseosa y concentración de NaNO2) sobre la respuesta del crecimiento de patógenos o la generación de algún compuesto tóxico (McMeekin et al., 1993, Buchanan et al., 1993 a y b). Los modelos terciarios son la aplicación de uno o más modelos primarios y secundarios, incorporados en un software de computadora. Donde, se han incorporado varias variables integradoras (temperatura, Aw o pH) haciendo de la MP una herramienta poderosa para todas las áreas de la investigación e industria de alimentos, a continuación se muestra un resumen de los modelos y su clasificación (Buchanan et al., 1993 a y b, Whiting y Buchanan, 1993; Whiting, 1995). 65 Cuadro 6. Clasificación de algunos modelos utilizados en la estimación de la vida de anaquel. Modelos primarios Modelos secundarios Modelos Terciarios Función de Gompertz Modelo Belehradek PMP USDA Gompertz modificada Modelo Ratkowsky Micromodelo de alimentos Modelo logístico Modelo de Arrhenius Predictor de Pseudomonas Modelo Baranyi Modelo modificado de Arrhenius (Davey o Shoolfield) Modelo de primer orden Modelos probabilísticos Modelo de primer orden Valores Z modificado Modelo de declinación de Polinominales o Modelos de crecimiento de Whiting y superficie de respuesta Cygnarowicz Modelo lineal de tres fases Modelo de William- Landel Ferry 7.7.3. Modelos Mecanicistas Para poder generar los modelos mecanicistas, es necesario comprender y tener presente el metabolismo y comportamiento microbiano. Este tipo de modelos representarán los mecanismos con mayor exactitud y generarán predicciones a partir de hipótesis. Baranyi y Roberts (1994) indicaron que los modelos derivados de forma mecanicista serían más amigables y eficientes, ya que la cantidad y calidad de la información tendría más campo de acción, por lo tanto, los modelos mecanicistas llegarían a ser superiores a los modelos empíricos. No obstante, difícilmente se han desarrollado modelos mecanicistas completos que incorporen todas las variables intrínsecas y extrínsecas que afectan al crecimiento microbiano. Actualmente los modelos disponibles son empíricos o semi-mecanicistas. 66 7.8. Mé todos para estimar vida de anaquel mediante Análisis Sensorial Una forma rápida de determinar la vida de anaquel de un producto, es mediante el uso de un panel entrenado (n = dependerá de la capacidad de análisis del laboratorio, generalmente de 6 a 8 jueces, serán suficientes) para determinar si existen diferencias entre un control y un producto o entre diversos productos elaborados bajo ciertas condiciones y con diferentes tiempos de almacenamiento, el control puede ser un producto que se encuentre cercano al fin de su vida de anaquel (Rodríguez, 2003). En estudios de vida de anaquel, las pruebas descriptivas son las más usadas para determinar la intensidad de las características sensoriales de un producto e identificar los parámetros del fin de la vida de anaquel. Es con frecuencia el método óptimo para determinar la vida de anaquel, pero es muy importante que estos datos sean correlacionados con pruebas de percepción del producto por parte de los consumidores. De otra manera, el producto podría ser evaluado por el panel experto como caducado pero todavía ser aceptable para los consumidores. Otras pruebas sensoriales que son comúnmente usadas incluyen la llamada apareada simple, en donde el producto se compara con un control, y las pruebas triangulares. De estas, la apareada simple es preferida puesto que indica qué tan diferente es la muestra del control. Normalmente, los estudios de vida de anaquel se efectúan con condiciones normales y con abuso de temperaturas (i.e., 4 y 10 ºC temperatura de almacenamiento), o tipo de empaques de almacenamiento. Por lo general, se recomienda que las muestras de productos refrigerados sean tomadas de los diferentes lotes de producción o de cada bloque experimental para tomar en cuenta la variación asociada a proceso, y que las muestras sean evaluadas a diferentes tiempos durante el almacenamiento o hasta que los parámetros de respuesta establecidos alcancen un nivel inaceptable. Por ejemplo, un producto cárnico puede ser envasado bajo dos sistemas de empaque (al vacío o en bolsa permeable al oxígeno), por lo tanto, hay que plantear un diseño de muestreo a partir de jueces entrenados y técnicas de laboratorio, esto en función del tiempo que se tiene como meta para que el producto pierda sus cualidades en almacenamiento. Por lo que, a la par los datos de laboratorio se irán obteniendo y comparando con datos de evaluaciones sensoriales; en las cuales se puede incluir un control como muestra fresca para determinar la frescura sensorial. 67 A cada juez se le presentarán las muestras codificadas, que se evaluarán de acuerdo a una escala preestablecida. Cuando se evalúan muestras cárnicas, en diferentes empaques, lo adecuado es planear dos etapas: 1) evaluación del aspecto visual y olor al abrir el empaque, y 2) la evaluación del olor y sabor de la carne cocinada. En algunos casos, es recomendable incluir una 3) que evalúe la integridad de las fibras y su textura. A continuación se muestran dos técnicas muy empleadas: Prueba triangular: se empleará un mínimo de 20 consumidores (jueces no entrenados), con el objetivo de saber si los jueces detectan diferencias significativas en el sabor de las muestras (i.e., empacadas al vacío, empaque permeable al oxígeno, etc.). El análisis se realizará según el tiempo de almacenamiento. Para muestras de carne, la presentación de las muestras deberá de ser estandarizada (cubos de 3 cm3), colocadas en platos rotulados con tres dígitos (empleando programas o tablas de aleatorización para pruebas triangulares) y cuestionario correspondiente a las muestras. El método de cocción será seleccionado con anterioridad (i.e., horno de microondas o parrilla eléctrica). Prueba descriptiva: para este tipo de pruebas se necesita mínimo 5 jueces semientrenados, los cuales deberán ser adiestrados por lo menos en 4 sesiones previas al análisis y ser familiarizados con los atributos a evaluar, más 8 sesiones de entrenamiento en la escala a utilizar. Para profundizar en este tema, se recomienda la lectura del documento “Evaluación Sensorial de la Carne de Cabra y Cabrito”, el cual forma parte de la serie de manuales elaborados por el Macroproyecto “Indicadores de Calidad en la Cadena de Producción de Carne Fresca en México”, por la Dra. Rosa Hayde Alfaro y colaboradores. En él, se detallan con profundidad los fundamentos del análisis sensorial, las metodologías para el entrenamiento de jueces, los diferentes tipos de análisis de la información, las pruebas dúo-trío, las de intervalos, así como las pruebas afectivas (nivel de agrado, pruebas de aceptación, preferencia, etc.). 68 7.9. Validación de los modelos Antes de la aplicación de un modelo predictivo en una situación práctica, se debe demostrar que predicen con exactitud el comportamiento de microorganismos en los alimentos durante el procesado, almacenamiento y distribución; en esto consiste su validación (Whiting, 1995). La validación de un modelo matemático aunque difícil, es crucial para el modelado predictivo, y debe realizarse en condiciones de laboratorio, pero especialmente en productos alimenticios terminados. Cuando el sistema al que se aplica un modelo predictivo se hace más complejo, aumentando el error de las predicciones, entonces se tiene que tener cuidado con los coeficientes de correlación y de determinación, ya que al ser tratados como modelos lineales siempre son ajustados a una curva. El proceso de validación es un aspecto que aún no está totalmente definido en MP pero establece una comparación entre los parámetros cinéticos estimados (tasa de crecimiento, tiempo de generación, etc.) y lo observado para un mismo microorganismo (Ross, 1996, Dalgaard et al., 2002, Gibson et al., 1988, Buchanan et al., 1993). La validación de modelos predictivos se puede llevar a cabo con datos obtenidos bajo las mismas condiciones que las utilizadas para elaborar el modelo. Esto se denomina validación interna, y se realiza con el fin de determinar si el modelo puede describir suficientemente los nuevos datos experimentales (Rodríguez, 2003). Por otro lado, la validación externa utiliza datos nuevos, obtenidos a partir de pruebas microbiológicas de inoculación y obtención de datos respecto a la tasa de crecimiento microbiano (Rodríguez, 2003). Estos resultados, deberán ser comparados con lo que se reporta en la literatura para estimar la precisión de las predicciones dadas por el modelo. En esta validación externa, se incluye la validación matemática y del producto. La validación matemática cuantifica la precisión y exactitud del modelo, probado con datos experimentales nuevos (Zwietering et al., 1990, 1991 y 1994). Estos datos nuevos, que no se han usado para la elaboración del modelo, se deben de haber obtenido bajo condiciones de experimentación similares a las que se usaron para crear el modelo (Ross, 1996). 69 Únicamente cuando la etapa previa de validación matemática es exitosa, es posible establecer la validación del producto. Ésta consiste en comparar predicciones del desarrollo del microorganismo obtenidas en el laboratorio con observaciones del crecimiento en un alimento, y así determinar si las predicciones son lo suficientemente seguras para ser utilizadas, y finalmente, obtener una estimación de la vida en anaquel que podrá tener la carne fresca, producto cárnico o cualquier otro alimento. Los autores de este manual, esperan haber presentado un panorama, de lo extenso y grande que es el tema de vida de anaquel con un enfoque microbiano, de la gran variedad de herramientas que permitirían generar datos fehacientes sobre la vida útil de los alimentos y tener a la mano alternativas en la preservación de la carne. Cabe recalcar, que la mayoría de los modelos toman en consideración el desarrollo bacteriano, sin embargo se pueden tomar como variables de estimación cualquier otra variable que sea reproducible en laboratorio y que explique grandemente la variación en la calidad de la carne. Usted podría hacer una revisión más detallada sobre un modelo en específico, dentro de este texto hay diversos investigadores con gran cantidad de conceptos e información clave. La vida de anaquel y los modelos relacionados a esta, son un amplio tema, que con un pequeño manual no se podría explicar completamente. Consideramos que este tema es de suma importancia no solo en carne, sino en cualquier producto perecedero, por lo tanto, es de vital valor continuar con trabajos de este tipo que aumenten el conocimiento alrededor del texto. 70 8. Referencias 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 71 Aberle, ED. 2002. Principles of Meat Science 4ta Edition. Kendall Hunt Publishing Company. Capítulo 9. Storage and Preservation of Meat. Pág.181. Almonacid-Merino, SF, and Torres, JA. 1993. Mathematical models to evaluate temperature abuse effects during distribution of refrigerated solid foods. Journal of Food Engineering 20, 223-245. 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Su tiraje consta de 2000 ejemplares www.gobiernofederal.gob.mx www.sagarpa.gob.mx www.inifap.gob.mx www.uam.mx