TEMA 6 Polimorfismos genéticos humanos. Su importancia en farmacología y toxicología. Asociación con cáncer. Bases Bioquímicas de la Toxicología Clínica Ramiro Jover Los medicamentos son metabolizados (biotransformados) en nuestro organismo El hígado es el órgano más importante en la metabolización 1 Metabolismo de medicamentos en el hígado Los FÁRMACOS llegan al hígado por la vena porta HEPATOCITOS Los METABOLITOS salen por la vena cava inferior o por la bilis Los medicamentos se metabolizan en los hepatocitos METABOLITOS ESTABLES FARMACO 2 FASE I XENOBIOTICOS ELIMINACION FASE II Metabolismo de Fármacos - Fase I y Fase II Xenobiótico Fase I Metabolito Fase II Hidroxilación Epoxidación Desalquilación Desaminación S- y N-oxidación + polar + reactivo Glucuronidación Glucosilación Metilación Acetilación Conjugación con Sulfato Conjugación con GSH Conjugación con AAs CYP & MEH Citotoxicidad DETOXIFICACION 3 Metabolismo de fármacos - Fase I y Fase II 5 4 6 3 NH NH NH Cl Cl Cl Cl Conj. Sulfato 3' 4' Cl Cl CYP - 2C9 5' COOH COOH COOH OH -O O S O O Metabolización del diclofenac (ruta principal) Metabolismo de xenobióticos - bioactivación Estimación del número de xenobióticos • Pesticidas 1500 • Medicamentos 6000 • Aditivos de alimentos - con valor nutricional 2500 - conservantes 3000 • Productos industriales 50000 Xenobiotic M Detoxification Elimination P450 Bioactivation Cytotoxicity Genotoxicity “Up to 80% of all human cancers are thought to arise from exposure to environmental agents” (Doll & Peto, 1981) 4 XENOBIOTIC BIOTRANSFORMATION Reactive metabolite Stable metabolite GSH CONJUGATION DEPLETION Detoxification Redox cycling Oxidative stress Lipid peroxidation Alteration of Ca2+ homeostasis Covalent binding Metabolic alterations ELIMINATION APOPTOSIS NECROSIS IMMUNE RESPONSE & GENOTOXICITY 5 Metabolismo de xenobióticos - bioactivación Estimación del número de xenobióticos • Pesticidas 1500 • Medicamentos 6000 • Aditivos de alimentos - con valor nutricional 2500 - conservantes 3000 • Productos industriales 50000 M Xenobiotic Detoxification Elimination P450 Bioactivation “Up to 80% of all human cancers are thought to arise from exposure to environmental agents” (Doll & Peto, 1981) Cytotoxicity Genotoxicity Funciones del citocromo P450 (CYP) en el metabolismo Fármacos Hormonas esteroides Ácidos grasos Bioactivación. Carcinogénesis química. Xenobióticos CYP Vitaminas Liposolubles AyD Sales biliares 6 Citocromo P450 (CYP) - Componentes del sistema NADPH eCitoplasma e- Citocromo P450 reductasa Fe FMN FAD Citocromo b5 P450 Retículo endoplásmico RH + O2 + NADPH+ H+ ROH + H2O + NADP+ CYPs - Isoenzimas y nomenclatura Familias > 40% 1 Subfamilias 1A1 1B1 > 55% 1A2 2 3 4 3A4 3A5 3A7 4A9 5 7 8 11 17 19 21 24 27 21A2 4B1 4A11 4F2 4F3 11A1 11B1 11B2 2A6 2B6 2C8 2D6 2E1 2F1 2C9 2C18 2C19 7 CYPs - Abundancia relativa y especificidad Diclofenac Tolbutamide S-Warfarin Phenytoin SUBSTRATOS Coumarin Fadrozole 2A6 Mephenytoin Diazepam 2C8- 9 3A4- 5 1A2 Sulphaphenazole Ketoconazole Furafylline 2C19 INHIBIDORES Nifedipine Erythromycin Phenacetin Bufuralol Cyclosporine Caffeine Sparteine Chlorzoxazone Cortisol Theophylline Debrisoquine Alcohols 2D6 2E1 Quinidine ¿Tenemos todos el mismo patrón isoenzimático de CYPs? Variabilidad interindividual : Causas succinil Co-A + glicina ALA sintetasa Gen-CYP ácido d-aminolevulínico ALA deshidratasa mRNA porfobilinógeno PBG desaminasa Porfirias Co++, Pb++ POLIMORFISMOS Inductores químicos Señales inflamatorias Hormonas Dieta, etc. Citocromo P450 apoproteína protoporfirina IX Fe Ferroquelatasa HEMO CYP Inhibidores 8 Variabilidad interindividual: consecuencias Efecto tóxico 2D CYP 6 LENTO Efecto terapéutico 2D6 CYP NORMAL Fallo terapéutico CYP 2D6 RAPIDO 9 Variabilidad interindividual : Consecuencias Benzo-a pyrene Benzo-apyrene B-a -pepoxide GSTM1 CYP1A1 M CYP1A1 +++ activo GSTM1 null genotype Benzo-a -pyreneSG Benzo-apyrene-SG El benzo-a-pireno se elimina El benzo-a-pireno se convierte en un epóxido reactivo que no se elimina POLIMORFISMO Genetic variations (difference in DNA sequence) occurring in more than 1% of a population. The term defines monogenetic traits that exist in the normal population in at least two phenotypes, for example the ABO blood groups. In the context of pharmacology, genetic polymorphism of drug metabolising enzymes gives rise to distinct subgroups in the population that differ in their ability to perform a certain drug biotransformation. 10 POLIMORFISMOÆ Variación genética Æ Cambio en la secuencia del DNA Æ Mutaciones Las mutaciones, o variaciones en la expresión de los genes, pueden ocurrir con relativa facilidad en las distintas fases del flujo de información genética (replicación-transcripción-traducción) Causas Factores endógenos: Errores en la maquinaria molecular. Factores ambientales: Radiaciones ultravioleta, alteraciones químicas producidas por sustancias tóxicas, etc. Tipos de mutaciones puntuales : Sustitución: Adición (Inserción) Deleción - Silenciosas - De cambio de sentido - Sin sentido - Desplazamiento de la pauta de lectura El código genético 11 Mutaciones del DNA. Puntuales Silenciosas De cambio de sentido Sin sentido Mutaciones del DNA. Delección, adición y cambio en la pauta de lectura 12 Mutaciones del DNA. Alteración en corte y empalme (splicing) Introducción de mutaciones puntuales por acción de sulfonato de etilmentano (EMS), un agente mutagénico de uso común. Sustitución G Æ A 13 POLIMORFISMOS FENOTIPACIÓN Y GENOTIPACIÓN MÉTODOS de FENOTIPACIÓN • Medida directa de la actividad en tejido (biopsia hepática). • Métodos ex vivo. Medida de actividad en cultivo de linfocitos. • Métodos in vivo. Medida de un metabolito, relación metabólica (Sustrato / Producto), o velocidad de eliminación, de un fármaco modelo: CYP1A2 Æ Cafeína (?) CYP2C9 Æ Tolbutamida, warfarina CYP2C19ÆS-mefenitoina, omeprazol CYP2D6 Æ Dextrometorfan CYP2E1 Æ Cloroxazona 14 Fenotipo polimórfico: Hidroxilación de debrisoquina Debrisoquine CYP 4-Hydroxydebrisoquine Genotipación. Detección de mutaciones puntuales. RFLP 15 RFLP (Southern blot analysis) Genotipación. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) 16 Citocromos P450 polimórficos con relevancia en el metabolismo de xenobióticos CYPs humanos implicados en el metabolismo de carcinógenos 17 CYPs humanos implicados en el metabolismo de carcinógenos CYP1A1 Hidrocarburos aromáticos policíclicos (benzo(a)pireno & dimetilbenzantraceno) CYP1A2 Nitrosaminas, aminas heterocíclicas CYP2A6 Nitrosaminas, aflatoxina B1 CYP2D6 NNK (nitrosamina derivado en humo tabaco) CYP2E1 Benzeno, tetracloruro de carbono, cloruro de vinilo CYP3A4/5 Aflatoxina B1, benzo(a)pireno, 6-aminocriseno Polimorfismo del CYP2D6 Polimorfismo de la debrisoquina / esparteina El 7% de la población presenta un metabolismo deficiente Herencia autosomal recesiva Influye en la metabolización de mas de 25 fármacos de uso común: β-bloqueantes, antiarrítmicos, antidepresivos tricíclicos, antipsicóticos, analgésicos, antihistamínicos, etc Number of people Debrisoquine CYP2D6 4-Hydroxydebrisoquine Extensive metabolizers Poor metabolizers Debrisoquine / 4-hydroxydebrisoquine 18 Polimorfismo del CYP2D6 CYP2D6 allele Detrimental mutation 2D6-A A A2637 deleted 2D6-B B Consequence Frequency in Caucasian 5-10 G1934 Æ A Reading frame disruption Defect splicing 2D6-D D Gene deletion No-enzyme 10-15 2D6-E E A3023 Æ C 1-5 2D6-T T T1795 deleted His324Æ Pro nonfunctional prot. Reading frame disruption 70-80 5-10 Polimorfismo del CYP2D6 Cys N 2D6-wt wt signal anchor C (497) SRS1 SRS2 SRS3 SRS4 N 2D6-T T 2D6-E E SRS5 SRS6 C (152) SRS1 Pro (324) Cys N C (497) SRS1 SRS2 SRS3 SRS4 SRS5 SRS6 19 Polimorfismo del CYP2D6 y cáncer de pulmón NNK (4- (metilnitrosamina)- 1- (3 - piridil)- 1- butanona) Nitrosamina identificada en el humo del tabaco (Crespi et al. 1991) Es activada (bioactivada) por CYP2D6 Menos aductos DNA - nitrosamina en metabolizadores pobres 2D6 Metabolizador pobre Æ fenotipo protector Nicotina es sustrato del CYP2D6. Nicotina Æ cotinina Mas nicotina en el plasma de metabolizadores pobres 2D6 Menos necesidad (mayor duración efecto) Æ menos cigarrillos Æ Menos riesgo de cancer Metabolizador pobre Æ fenotipo protector Ah R p9 Hs 0 Hs p9 0 AhR Arnt AhR P AhR TCDD Arnt Polimorfismos del CYP1A1 y del receptor AhR P Cytochrome Endoplasmic P450 1A1 Reticulum Enhancer Promoter TFIIX TBP TATA mRNA Nuclear RNA 20 Polimorfismo del CYP1A1 CYP1A1 Polimorfismo del CYP1A1: Estudios fenotípicos Actividad: hidroxilación de hidrocarburos aromáticos (benzo(a)pireno Æ 3-hidroxi-benzo(a)pireno) Tejido: linfocitos periféricos inducidos con -3 MCo TCDD En estudios poblacionales la actividad CYP1A1 muestra una distribución trimodal Æ Fenotipos: Baja, media y alta actividad / inducibilidad Asociación fenotipos 1A1 con carcinoma bronquial Æ Alta actividad % Controles: 10.9 % Pacientes: 30.6 Baja actividad 42.2 5.0 21 Polimorfismo del CYP1A1: Estudios genotípicos Ile / Val(462) polymorphic site Exon 1 2 3 4 5 6 7 MspI polymorphic site AA-MspI polymorphic site Alelos Genotipo Fenotipo Controles Cáncer pulmón m2 MspI + m2/m2 Alta Inducción 10.6 22.9 Val 462 Val/Val Alta Actividad 4.7 12.5 Enzimas de Fase II implicadas en carcinógenesis GSTs NATs Sulfotransferasas Otras enzimas implicadas en el metabolismo de carcinógenos Alcohol deshidrogenasa Aldehido deshidrogenasa Microsomal epoxido hidrolasa Mieloperoxidasa NAD(P)H:quinona oxidoreductasa 22 Glutation - S -transferasas GST S (centro electrófilo) + GSH - - ---------- >S - SG • Multifamilia de enzimas citsólicos mayoritariamente hepáticos. • Presente en la mayoría de seres vivos. • Protección contra compuestos nocivos. SUSTRATOS: • Endógenos: Productos del estrés oxidativo Peroxidación lipídica Æ cumene hydroperoxide, 4-hidroxinonenal Oxidación del DNA Æ Propenales básicos de timina y uracilo • Exógenos: Carcinógenos ambientales HAP bioactivados por P450 ( epóxidos, trans-4-fenil-3-buten-2-ona, benzo(a)pireno-diolepoxido) acroleina (humo tabaco), agentes metilantes (cloruro de metilo) pesticidas, disolventes industriales (oxido de etileno). Conjugación con glutation y su metabolismo GSH (γ-Glu -- Cys --Gly) 23 Glutation-S-transferasas humanas Familias alpha mu GSTM1 Isoenzimas GSTA1 GSTA2 GSTM2 GSTM3 GSTM4 theta M1*2 (57%) M1*A M1*B GSTT1 M3*1 pi GSTP1 T1*1 T1*2 (20%) GSTT2 M3*2 GSTM5 Glutation - S -transferasas humanas : Polimorfismos y cáncer Cutaneous basal cell carcinoma (BCC): UV Æ ROS Æ mutations GSTM1, GSTM3 y GSTT1 conjugan compuestos resultantes del estrés oxidativo inducido por UV. GST se expresa en la epidermis y en la lamina basal de la piel (que incluye las stem cells) Número promedio de BBCs SI NO Skin type 1 2.99 2.12 +GSTM1*2 (null) 4.57 2.00 +GSTM3*1 (AA) 3.57 2.08 24 - acetil- transferasas (NATs) N Sustrato + Ac- NAT CoA--------------------> S - acetilado SUSTRATOS: Endógenos: Aminas aromáticas endógenas como serotonina. Transferencia de grupos acetilo entre arilaminas endógenas (sin Ac-CoA). Son denominadas: Arilamina N-acetiltransferasas Exógenos: Carcinógenos ambientales (Procesos industriales y combustion tabaco o alimentos). Aminas e hidrazinas aromáticas y heterocíclicas. - acetil- transferasas humanas: variantes alélicas N NAT1 (7 alelos) Genes NAT2 (15 alelos) 1*4 1*10 1*14 1*11 1*15 wt Alternat polyA Arg187Gln Val149Ile Arg187Stop (Ç level) rapid (È affinity) slow (Ç Vmax) rapid (no NAT1) slow 2*4 2*5A 2*6A 2*7A 2*14A wt Ile114Thr Arg197Gln Gly286Glu Arg64Gln (È NAT2) slow (È stability) slow (È stability) slow (È stability) slow 25 - acetil- transferasas humanas y cáncer N Cáncer Genotipo Colon: Bell et al. (1995) Controles Enfermos Rápido Pulmón: Bouchardy et al. (1998) Controles Enfermos Lento Hígado: Agúndez et al. (1996) Controles Enfermos Lento NAT1 % (n) OR NAT2 % (n) OR 29 (112) 1.0 44 (202) 1.9 56 (170) 1.0 66 (148) 1.9 54 (258) 1.0 68 (100) 1.8 ESTUDIOS EPIDEMIOLÓGICOS. Medidas de asociación. ODDS de que nazca un niño: nº niños 51 / nº niñas 49 = 1.04 RISK de que nazca un niño: nº niños 51 / (tot 100) = 0.51 ODDS RATIO: ODDS control = 1.04 ODDS india = 1.70 (63/37) OR= 1.70 / 1.04 =1.63 RELATIVE RISK RISK control = 0.51 RISK india = 0.63 (63/100) RR= 0.63 / 0.51 =1.24 26