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CAPÍTULO VIII
Dinámica mitocondrial y sus implicaciones en la desregulación
metabólica y en la neurodegeneración
 Antonio Zorzano, Jessica Segalés, María Isabel Hernández-Álvarez y Eleonora
Sorianello
Institute for Research in Biomedicine (IRB Barcelona) C/Baldiri Reixac 10, 08028 Barcelona, Spain; Departament de
Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona, Av. Diagonal 645, 08028 Barcelona,
Spain; CIBER de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM, Instituto de Salud Carlos III, España.
edicion@ranf.com
RESUMEN
La dinámica mitocondrial es un concepto que incluye el movimiento de mitocondrias a lo largo del
citoesqueleto, la regulación de la arquitectura mitocondrial, y su conectividad entre ellas, mediada
por sucesos de fusión y fisión. Recientemente, nos hemos dado cuenta de la importancia que tiene
la dinámica mitocondrial en en la fisiología celular, tras la identificación de los genes responsables
de la fusión y de la fisión mitocondriales. Además, en la última década se han identificado
mutaciones en genes que codifican para proteínas implicadas en la fusión mitocondrial tales como
MFN2 y OPA1, y que provocan enfermedades neurodegenerativas (Charcot-Marie Tooth de tipo
2A y atrofia óptica autosómica dominante). Además, la alteración en la actividad de proteínas de
fusión o fisión mitocondrial modula el metabolismo muscular. En este capítulo revisaremos los
principales hallazgos obtenidos en el campo de la dinámica mitocondrial en células de mamífero y
sus implicaciones en el metabolismo celular y en la neurodegeneración.
CAPÍTULO VIII 155 INTRODUCCIÓN
Las mitocondrias fueron descritas por primera vez a mediados de 1800 como
compartimientos granulares citoplasmáticos provistos de su propia membrana. A finales del
siglo XIX estos orgánulos fueron llamados mitocondrias, que procede de la fusión de las
palabras griegas “mitos” y “chondros”, es decir, hilos y granos, respectivamente. A pesar de
esto, las mitocondrias fueron consideradas durante décadas como orgánulos independientes
y aislados entre sí. A principios del siglo XX, y gracias a los avances en microscopía de
campo claro y en el cultivo celular, se reveló que las mitocondrias muestran morfologías
distintas, probablemente debido a su naturaleza dinámica (1). No fue sino hasta la década
de 1960 cuando se describió la primera evidencia de fusión mitocondrial sobre la base de la
demostración de la recombinación y complementación del ADN mitocondrial en la
levadura (2). Más tarde, hubo nuevas descripciones de procesos de fusión mitocondrial y de
formación de la red mitocondrial también en células de mamíferos (3-5). En la década de
1990, el desarrollo de sondas o de proteínas fluorescentes dirigidas a la mitocondria han
permitido la visualización de la dinámica mitocondrial en varios modelos celulares, desde la
levadura hasta los hepatocitos (6-8). Este dinamismo no sólo se refiere al movimiento de las
mitocondrias a lo largo del citoesqueleto, sino también a cambios en la forma mitocondrial,
que son controlados por la fusión y la fisión eventos. En 1997 se descubrió el primer gen que
participa en la fusión de las mitocondrias en Drosophila melanogaster (9). En la última
década, se han identificado distintos genes que participan en la fusión y fisión
mitocondriales, inicialmente descritos en la levadura y a continuación en células de
mamíferos (10). A pesar de los grandes avances conseguidos en el estudio de la dinámica
mitocondrial en los últimos años, los mecanismos que regulan los procesos de fusión y
fisión aún no se comprenden en su totalidad. La importancia fisiológica de la dinámica
mitocondrial en los tejidos de los mamíferos no se entiende bien, y los factores que
determinan las diferencias en la morfología mitocondrial y la dinámica entre los distintos
tipos de células aún deben ser definidos. En esta revisión se resumen los conocimientos
actuales de la fusión y la fisión mitocondrial en mamíferos, y su participación en el
metabolismo mitocondrial y en la neurodegeneración.
156 CAPÍTULO VIII LA MAQUINARIA DE FUSIÓN MITOCONDRIAL
Las mitocondrias forman redes tubulares o ramificadas, que se someten a un
equilibrio dinámico y regulado gracias a la actividad de los procesos de fusión y de fisión
mitocondriales (8, 11). La fusión mitocondrial es necesaria para facilitar la intercomplementación del ADN mitocondrial y también como parte de una respuesta al estrés
celular (12, 13). Para asegurar el mantenimiento de compartimentación mitocondrial, tanto
la membrana mitocondrial interna como la externa necesitan fusionarse (14). Las
principales proteínas implicadas en la fusión mitocondrial son las GTPasas de la membrana
mitocondrial externa: Mitofusinas (Mfn1 y Mfn2) (15, 16) y la GTPasa de atrofia óptica
(OPA1) de la membrana mitocondrial interna (17, 18).
Las Mitofusina 1 y 2 son proteínas ancladas en la membrana mitocondrial externa y
se ha demostrado que regulan la arquitectura de la red mitocondrial mediante la
inmovilización y la fusión de las mitocondrias vecinas (15, 19-21). Saccharomyces cerevisiae
muestra un solo gen ortólogo de Mfn y que recibe el nombre de FZO (de “fuzzy onion” o
cebolla borrosa). Las funciones de Mfn1 y Mfn2 se solapan al menos en parte, ya que Mfn1
puede rescatar parcialmente mutantes de Mfn2 mediante la formación de heterodímeros con
Mfn2 (22). Aunque los genes Mfn1 y Mfn2 presentan una expresión relativamente ubicua,
los dos genes muestran diferentes niveles de expresión de ARNm en diferentes tejidos. Así,
se detectan tránscritos de Mfn1, en niveles similares, en una variedad de tejidos humanos y
son muy abundantes en el corazón; en cambio, los niveles de ARNm para Mfn2 son muy
abundantes en el corazón y el tejido muscular, y se encuentran en niveles más bajos en
muchos otros tejidos (23).
Mfn1
La Mfn1, una proteína con actividad GTPasa, se encuentra en la membrana
mitocondrial externa y muestra dos dominios transmembrana localizados hacia el extremo
C-terminal de la proteína, cerca de un dominio héptada repetitiva (HR2) (23) (Figura 1).
Este dominio héptada repetitiva media el primer paso de la fusión mitocondrial, el cual
consiste en la interacción e inmovilización de dos mitocondrias adyacentes a través de la
formación de un dímero antiparalelo entre dos moléculas de Mfn1 (24). Estos complejos
diméricos pueden ser homotípicos (Mfn1-Mfn1 o Mfn2 Mfn2) o heterotípicos (Mfn1-Mfn2)
(15, 24) (Figura 1). La tasa de de fusión mitocondrial depende de los dímeros homo- o
heterotípicos; Mfn1 muestra una mayor actividad GTPasa en comparación con Mfn2 (16).
CAPÍTULO VIII 157 En este sentido, las mitocondrias que expresan Mfn1 muestran una eficiencia mayor de
interacción e inmovilización de mitocondrias, que aquellas que expresan Mfn2 (16). La
región N-terminal de la proteína Mfn1 contiene el dominio de unión a GTP y otro dominio
héptada repetitivo (HR1) (23, 24). Una alta sobreexpresión de Mfn1 en humanos causa una
agregación perinuclear de las mitocondrias (23), que es independiente de la actividad de
fusión de Mfn1. Por lo tanto, la sobreexpresión de una forma mutante de Mfn1 exenta de
actividad GTPasa también causa agregación mitocondrial (23).
La identificación de isoformas de “splicing” alternativo para Mfn1, que se detectan
en cáncer de pulmón (25), o el hecho de que la variación en los niveles de proteína entre
tejidos no siempre son equivalentes a los niveles de ARNm, sugiere que Mfn1 muestra una
regulación post-transcripcional o postraduccional (23). Sin embargo, los mecanismos
moleculares relevantes en esta regulación se desconocen.
La proteína MIB (o “mitofusin binding protein”) es un miembro de la familia de
enzimas deshidrogenasas/reductasas de cadena media. La mayoría de los MIB se localiza
en el citoplasma, pero una pequeña cantidad está asociada a las mitocondrias (26). La
sobreexpresión de MIB en células HeLa induce la fragmentación mitocondrial, lo que se
previene por la co-expresión de Mfn1, y ello sugiere una interacción funcional de MIB con
proteínas Mfn. Por otro lado, la pérdida de función de MIB da lugar a la detención del
crecimiento de las células HeLa y a la inducción de una extensa red mitocondrial (26). Se ha
demostrado la existencia de una interacción directa entre Mfn1-2 y MIB mediante estudios
de co-inmunoprecipitación. Los mecanismos por los que MIB regula la actividad de Mfn1
o Mfn2 aún no se conocen (26).
Mfn2
Mfn2 es una proteína integral de membrana mitocondrial externa con los extremos
N-terminal y C-terminal expuestos en el citosol (20). Mfn2 contiene un dominio héptada
repetitiva (HR2) localizado en la región C-terminal de la proteína (20, 21), y la actividad
GTPasa localizada a N-terminal es crucial para su actividad de fusión mitocondrial (15, 27)
(Figura 1). Sin embargo, y de manera similar a lo reportado para Mfn1, la actividad
GTPasa de Mfn2 no es necesaria para la formación de agregados perinucleares
mitocondriales causados por la sobreexpresión de Mfn2 (20, 21, 23, 28). Este mecanismo de
agregación puede ser causado por la inmovilización mediada por el dominio HR2 de Mfn2
(23, 24).
158 CAPÍTULO VIII Mfn2 es esencial para el desarrollo embrionario, y se ha descrito que los ratones
Mfn2 “knockout” (KO) mueren hacia la mitad de la vida fetal debido a defectos de la
placenta (15). Cuando el defecto de la placenta se previene, los ratones KO de Mfn2
desarrollan una degeneración cerebelosa intensa (29).
Figura 1.- Maquinaria de fusión mitocondrial
A) Esquema de las proteínas Mfn1, Mfn2, y OPA1. Las 3 proteínas contienen dominios
GTPasa y regiones héptada repetitivas (HR). Los dominios de transmembrana (TM) de
las mitofusinas son inusualmente largas y contienen residuos cargados que se piensa
permiten un giro en forma de U en la membrane mitochondrial externa, de manera que
casi toda la proteína se orienta al citosol. OPA1 comprende una secuencia N-terminal de
importe mitocondrial, regions hidrofóbicas héptada repetitivas (HR), un dominio
GTPasa, y un dominio central. OPA1 media la fusión de las membranas mitocondriales
internas.
B) Inmovilización mitocondrial por Mitofusinas. Las interacciones homotípicas entre
moléculas de Mfn1 o heterotípicas entre moléculas de Mfn1 y Mfn2, que tienen lugar
entre mitocondrias adyacentes, son mediadas por la región HR2, y conducen a la unión
de las membranas externas. La proteína OPA1, localizada en el espacio intermembrana y
asociada a la membrane interna, es el mejor candidato como efector de la fusión de la
membrana mitocondrial interna.
CAPÍTULO VIII 159 De acuerdo con los datos de Brito y Scorrano, Mfn2 también juega un papel
importante en la interacción entre el retículo endoplásmico (RE) y las mitocondrias (30). En
fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) carentes de Mfn2, las regiones de contacto entre
la mitocondria y el retículo endoplasmático (ER), que se considera forman subdominios
especializados de las ER llamados membranas asociadas a mitocondrias (MAM), se
reducen de manera significativa. Además, las células “knockout” de Mfn2 muestran una red
fragmentada del ER (30).
Algunas evidencias, indican que tanto Mfn1 como Mfn2 se regulan por el sistema de
proteasoma, de manera que inhibidores del proteasoma conducen a un aumento de su
expresión (31). La proteína ortóloga en levadura Fzo1 experimenta ubiquitinación (32, 33)
(31, 34). Mdm30 es una proteína con un motivo “F-box” que en levadura que reconoce a
Fzo como su substrato (32). Mdm30 regula la fusión mitocondrial de la levadura a través de
ubiquitinación de Fzo1, con su consiguiente degradación por el proteasoma (32). No se han
descrito homólogo de mamíferos de Mdm30 en la actualidad. Sin embargo, estudios
recientes han identificado tanto a Mfn de Drosophila como a Mfn1 y Mfn2 de mamiferos
como substratos de la ubiquitina ligasa E3, Parkin (35-37). Parkin promueve mitofagia a
través de la ubiquitinación de proteínas mitocondriales (38, 39). La disfunción de Parkin es
una causa importante de la enfermedad de Parkinson, y la consiguiente acumulación de las
mitocondrias dañadas por un defecto en la mitofagia puede conducir a un augmento de la
muerte celular (38, 39). La ubiquitinación de Mfn1 y Mfn2 por Parkin pueden conducir a
las mitocondrias hacia su degradación por mitofagia, mediante la degradación selectiva de
Mfn1/2, seguido de la inhibición de la fusión mitocondrial y la segregación de las
mitocondrias dañadas (35, 36).
OPA1
La proteína Mgm1 de la familia de las dinaminas fue identificada inicialmente en
levadura como un actor implicado en el mantenimiento de la red mitocondrial, una función
que es coherente con su localización en el espacio entre la membrana y su asociación con la
membrana mitocondrial interna (40) (Figura 1). La proteína ortóloga de Mgm1 en
mamíferos es OPA1, y es también esencial para la fusión mitocondrial (17, 41). OPA1 se
localiza en la membrana mitocondrial interna y en el espacio intermembrana. OPA1 ha sido
también detectada en las crestas mediante estudios de microscopía electrónica (42-44), y una
pequeña fracción de OPA1 constituída por las denominadas isoformas cortas, se asocia a la
membrana mitocondrial externa (44).
160 CAPÍTULO VIII Se conoce la existencia de distintas isoformas de OPA1. Estas isoformas están
además reguladas por la actividad de proteasas mitocondriales que reconocen a OPA1 en
sitios de corte específicos en respuesta a la pérdida del potencial de membrana mitocondrial,
la pérdida de ADN mitocondrial o a la inducción de apoptosis (18, 45, 46). Se han
identificado una serie de proteasas que pueden procesar OPA1 en diferentes puntos de la
molécula, y que regulan el equilibrio entre las isoformas largas y cortas de OPA1. Esto
puede estar vinculado a dos fenómenos no excluyentes: a) una alteración de OPA1 modifica
el potencial de membrana mitocondrial, el cual a su vez es requerido para el proceso de
fusión (47, 48), y b) OPA1 se ha mostrado que interactúa con Mfn1 (17) y con Mfn2 (49).
Recientemente, se ha descrito que la actividad de pro-fusión de OPA1 es crucial en el
proceso de control de calidad de las mitocondrias, a través del proceso llamado de “kissand-run” y que implica la fusión transitoria entre mitocondrias (50). Las mitocondrias que
muestran una actividad baja de OPA1 y, en consecuencia, una capacidad de fusión reducida
y bajo potencial de membrana mitocondrial, tendrá asimismo una reducida capacidad de
“kiss-and-run” y por lo tanto, se someterá a degradación por autofagia (51). Además, un
exceso de actividad de fusión OPA1, aunque de forma transitoria puede proteger para
algunos tipos de estrés celulares (13), provocará un proceso de senescencia, en presencia de
una excesiva producción de especies reactivas de oxígeno y de daño del genoma
mitocondrial (52). Por último, datos recientes apuntan a una nueva e importante vía
reguladora de fusión-fisión mitocondrial que involucra a la proteína serina-treonina quinasa
Pink y a la ubiquitina ligasa Parkin. Ambas proteínas están involucradas en formas
recesivas de la enfermedad de Parkinson. Pink y Parkin regulan negativamente OPA1 con
lo que promueven la fragmentación de las mitocondrias (53). Estos datos sugieren que el
control estricto de la OPA1 pro-fusión de la actividad es crucial para el mantenimiento de la
red mitocondrial y un estado saludable de las células.
LA MAQUINARIA DE FISIÓN MITOCONDRIAL
El proceso de fisión mitocondrial es necesario para incorporar las mitocondrias viejas
o dañadas de la célula a través de un proceso de autofagia llamado mitofagia (54). La
velocidad de fisión también aumenta notablemente cuando las células se comprometen en el
proceso de apoptosis, sin que tenga lugar un aumento compensatorio en la tasa de fusión
(55). Alteraciones en la maquinaria de fisión causan una mayor generación de especies
CAPÍTULO VIII 161 reactivas de oxígeno, una mayor susceptibilidad de las células a inducir apoptosis, una
capacidad diferente para generar ATP, y una población heterogénea de mitocondrias con
una distribución no uniforme del ADNmt (56).
La importancia fisiológica de la fisión mitocondrial se manifestó tras la identificación
inicial de la proteína Drp1 (miembro de la familia de las dinaminas) y Fis1 (57-58) ().
Recientemente, se ha identificado un nuevo factor de fisión mitocondrial (Mff), el cual
media la fisión mitocondrial y la peroxisomal de una manera similar a Fis1 y Drp1. Mff
también se encuentra en la membrana mitocondrial externa, pero no en los mismos
complejos que Fis1, lo que sugiere un papel independiente (59) (Figura 2).
Drp1
Drp1 y su ortólogo en levadura Dnm1, comparten características estructurales
comunes a la familia de las dinaminas, lo que incluye un dominio con actividad GTPasa,
un dominio efector de GTPasa (GED) y un dominio central (60, 61). Drp1 se encuentra
principalmente en el citosol y con el fin de facilitar la escisión de la doble membrana
mitocondrial, se ensambla en complejos multiméricos en forma de anillo en los sitios de
fisión mitocondrial; a continuación, éstos anillos se constriñen por la hidrólisis del GTP lo
que promueve la división mitocondrial (61-66) (Figura 2). Debido a que Drp1 carece de un
dominio de homología a pleckstrina que está implicado en la unión da membranas, el
reclutamiento y el ensamblaje de Drp1 en la membrana mitocondrial externa requiere de la
participación de proteínas receptoras de membrana (61, 64, 67-69).
El ratón “knockout” para Drp1 muestra letalidad embrionaria. Los embriones
muestran daño en el desarrollo del hígado y del corazón, un aumento en la apoptosis
neuronal en la corteza cerebral profunda, y una alterada formación de sinapsis (57, 58).
Además, las mutaciones en la proteína Drp1 retrasan la liberación de citocromo c asociada
a la apoptosis, lo que sugiere que la liberación del citocromo c de apoptosis está
estrechamente relacionada con la fisión mitocondrial (57, 58).
Los mecanismos implicados en la activación y translocación de Drp1 a las
mitocondrias pueden tener que ver con fenómenos de S-nitrosilación, sumoilación,
ubiquitinación, o fosforilación de residuos de serina en el dominio GED. Drp1 puede ser
activado por S-nitrosilación, una modificación post-traduccional que aumenta su actividad
de fisión mediante la inducción de su actividad GTPasa y dimerización (70). Se ha
observado S-nitrosilación de Drp1 y fragmentación de la red mitocondrial en respuesta a la
162 CAPÍTULO VIII expresión celular de la proteína ß-amiloide (Aß), un mediador clave de la enfermedad de
Alzheimer. Se ha propuesto que la formación de oligómeros de Aß conduce a estrés nitrooxidativo lo que conduce a producción de SNO-Drp1 (70).
Figura 2.- Maquinaria de fisión mitocondrial
A) Esquema de las proteínas Drp1, Fis1 y Mff. Drp1 tiene dominios típicos de la familia
de las dinaminas-GTPasas, lo que incluye un dominio GTPasa, un dominio central, y un
dominio efector GTPasa (GED). Drp1 se localiza en el citosol. Fis1 es una proteína de
bajo peso molecular presente en la membrana mitocondrial externa cuyo extremo Nterminal se orienta al citosol, y con un dominio transmembrana localizado en el extremo
C-terminal (TM). El dominio citosólico forma un haz compuesto por 6 hélices que
incluye dos repeticiones de tipo “tetratricopeptide” (TPR). Mff está anclada en la
membrana mitochondrial externa por un segmento transmembrana localizado en el
extremo C-terminal; también contiene 2 repeticiones cortas en la mitad N-terminal y un
dominio “coiled-coil” justo a N-terminal del segmento TM orientado al citosol.
Drp1 se recluta a la mitocondria y media la fisión mitocondrial mediante 2 mecanismos
que se ilustran en los paneles B y C.
B) Fis1 reside en la membrana mitocondrial externa y se localiza de manera uniforme; la
mayor parte de la proteína se orienta al citosol. C) Mff se localiza principalmente en
zonas precisas de la mitocondria donde actúa a modo de lugar de unión de Drp1. En
ambos casos, Drp1 constriñe el túbulo mitocondrial con el objeto de inducir la fisión de
las membranas.
CAPÍTULO VIII 163 Existen evidencias experimentales, que demuestran que la sumoilación es un proceso
mediante el cual se puede activar Drp1 (71). SUMO-1 y su enzima de conjugación Ubc9
inducen la fisión mitocondrial mediante la estabilización de Drp1 (72). Contrariamente, la
proteasa específica de SUMO/sentrin, SENP5, reduce los niveles de Drp1, lo cual previene
la fisión mitocondrial (73). Además, se ha sugerido que MARCH V, que es una ubiquitina
ligasa E3 mitocondrial, podría estar implicada en la translocación de Drp1 a la mitocondria,
sin que ello afecte su estabilidad (74).
La regulación de la actividad de Drp1, en respuesta a cambios en el nivel de
fosforilación ha sido tema debate, en especial, el residuo específico de Drp1 implicado (57).
Por un lado, se ha demostrado que durante la mitosis, el dominio GED de Drp1 de rata se
fosforila en el residuo de Ser585 (correspondientes a Ser616 en la variante de “splicing” 1 de
Drp1) por la proteína quinasa CDK1 dependiente de ciclina B, lo que da lugar a una fisión
mitocondrial transitoria, y por tanto a una distribución correcta de las mitocondrias en las
células hijas (75). También se ha descrito que el óxido nítrico induce la fisión mitocondrial
por fosforilación de Drp1 en el residuo de Ser616 (76). Otros autores han demostrado que el
tratamiento con óxido nítrico induce la S-nitrosilación de Drp1 en el residuo de Cys644, lo
que provoca un aumento de la actividad GTPasa y la dimerización de Drp1 (70, 77).
Por otro lado, la fosforilación de la proteína quinasa A (PKA) en el residuo de serina
Ser637 (en la variante de “splicing” 1 de Drp1 humana) (78) o Ser656 (en la variante de
“splicing” 1 de Drp1 de rata) (79), que se encuentra en el extremo NH2-terminal de la GED,
conduce a la inhibición de la fisión mitocondrial y a la muerte celular por apoptosis. La
desfosforilación de la Ser637 o de la Ser656 por la proteína fosfatasa, calcineurina, resulta
en la translocación de Drp1 a la mitocondria y la activación de la fisión mitocondrial (79,
80). También ha demostrado que la fosforilación del residuo de Ser600 de la isoforma 3 de
Drp1 (equivalente a la Ser637 en la variante de “splicing” 1 de Drp1 humana) por la
proteina quinasa dependiente de Ca2+/calmodulina promueve la fisión mitocondrial,
posiblemente debido a una mayor afinidad entre Drp1 y Fis1 (81).
Fis 1
El reclutamiento de la proteína de levadura Dnm1 desde el citosol a la membrana
mitocondrial externa, se produce a través de asociación con la proteína Fis1, lo que resulta
en la formación de un complejo de fisión y en la escisión de las membranas mitocondriales
(65, 68, 82, 83). Esta interacción se produce con la participación de la proteína adaptadora
Mdv1, que tiene un papel en el co-ensamblaje de Dnm1 en estructuras helicoidales (64, 67).
164 CAPÍTULO VIII Fis1 contiene cuatro repeticiones de tipo “tetratrico-peptide” (TPR), que son cruciales para
la interacción con Mdv1, que a su vez, facilitan la unión y el ensamblaje de Dnm1 (84).
Mientras que Mdv1 interactúa con Dnm1 y Fis1 para facilitar la fisión de membranas
mitocondriales, pero su función parece limitarse a levadura (82, 85).
En mamíferos, Fis1 es una pequeña proteína de 17,2 kDa que se expresa
ubicuamente y se detecta en toda la red mitocondrial (Figura 2). Fis1 está anclada en la
membrana mitocondrial externa a través de su extremo C-terminal, que contiene una hélice
alfa, un dominio transmembrana, y una cola C-terminal expuesta al espacio
intermembrana. La parte N-terminal de la proteína contiene cuatro regiones distintas con
cinco hélices alfa (86, 87); la primera hélice alfa de Fis1 parece ser crítica para la
oligomerización y su actividad de fisión (88). Las siguientes cuatro hélices alfa constituyen
dos repeticiones de tipo “tetratrico-peptide” (TPR1 y TPR2), y aunque no son necesarias
para la oligomerización de Fis1, están implicados en las interacciones proteína-proteína
necesaria para la fisión (88). La sobreexpresión de Fis1 causa fragmentación mitocondrial,
mientras que la pérdida de función de Fis1 resulta en la formación de una red mitocondrial
altamente fusionada indicando que la fisión se bloquea en condiciones en las que los
eventos de fusión se mantienen (68, 82, 83, 89). Se ha observado que Drp1 se recluta en
células con expresión silenciada para Fis1 (71, 90), lo que sugiere la participación de otras
proteínas en la fisión mitocondrial de mamíferos.
Mff
El Factor de fisión mitocondrial (Mff) (59, 69), está anclado en la membrana
mitocondrial externa y se ha propuesto que tiene un papel en la fisión mitocondrial de
manera independiente a Fis1(69) (Figura 2). Mff no se expresa en la levadura, y representa
un nuevo componente de la maquinaria de la fisión mitocondrial de mamíferos. Mff se
localiza en puntos específicos de las mitocondrias, y la sobreexpresión de Mff causa la
translocación de Drp1 citosólico a las mitocondrias, y promueve la fisión mitocondrial. Por
el contrario, la pérdida de función de Mff resulta en una reducción de Drp1 en la superficie
de las mitocondrias y en un alargamiento de la red mitocondrial (69).
Otras proteínas de fisión
La proteína GDAP1 (“Ganglioside-induced differenciation-associated protein 1”), se
encuentra en la membrana mitocondrial externa. Aunque la función de la proteína GDAP1
no se entiende bien, parece jugar un papel en el control de la forma de las mitocondrias
CAPÍTULO VIII 165 mediante la promoción de la fisión mitocondrial (91). Su sobreexpresión, causa la
fragmentación de las mitocondrias, y su pérdida de función da lugar a un incremento en la
fusión de la red mitocondrial (92). Se han descrito, más de 20 mutaciones en el gen GDAP1
como causantes de la neuropatía Charcot-Marie-Tooth de tipo 4A o de tipo 2K (91, 93),
dando lugar a desmielinización axonal, y a formas intermedias de neuropatía periférica
sensorial y motora (94).
MTP18 se encuentra en la membrana mitocondrial interna y su sobreexpresión da
lugar a fragmentación mitocondrial. La pérdida de función de MTP18 por interferencia de
ARN (ARNi) promueve una alta fusión mitocondrial y la liberación de citocromo c (95). La
inducción de fragmentación mitocondrial por MTP18 depende de la expresión de Drp1, lo
que sugiere un papel de esta proteína en las acciones mitocondriales de Drp1 (95).
MiD49 y MiD51 son proteínas homólogas que presentan un 65% de identidad y su
extremo N-terminal está anclado en la membrana mitocondrial externa (96, 97). MiD49/51
forma focos y anillos alrededor de las mitocondrias, de manera similar a Drp1. MiD49/51
directamente recluta Drp1 a la superficie mitocondrial, mientras que su pérdida de función
reduce la asociación mitocondrial de Drp1, lo que conduce a aumentada fusión. La
sobreexpresión de MiD49/51 parece secuestrar a Drp1 fuera del entorno mitocondrial de
manera que causa fusiones tubulares que interaccionan con actina (96). Experimentos de
co-inmunoprecipitación han demostrado que MiD49 interactúa con Drp1. Sin embargo, los
mecanismos precisos de acción de esta proteína aún no han sido esclarecidos (96).
DINÁMICA MITOCONDRIAL Y METABOLISMO CELULAR
Diferentes estudios, demuestran que la dinámica mitocondrial juega un importante
papel en la función de las mitocondrias, regulando distintos procesos fisiológicos como la
fosforilación oxidativa, el ciclo celular o la apoptosis. El grupo de Skulachev fue el primero
en proponer un papel funcional a las redes mitocondriales observadas en células musculares.
En estudios anteriores a la identificación de las proteínas de fusión y fisión mitocondrial,
Skulachev y colaboradores demostraron que los filamentos mitocondriales presentaban
continuidad de la matriz y que esto era importante para el mantenimiento del potencial de
membrana mitocondrial (98, 99). Sobre la base de estas observaciones, Skulachev propuso
la hipótesis de que los filamentos mitocondriales podrían actuar como cables transmisores
de energía. Así, en células como las fibras musculares, estos filamentos mitocondriales
166 CAPÍTULO VIII permitirían la transmisión del potencial de membrana mitocondrial desde las mitocondrias
localizadas en la periferia de la célula a las mitocondrias internas, con menor disponibilidad
de oxígeno (99).
En los últimos años, se ha demostrado que alteraciones en la actividad de las
proteínas de dinámica mitocondrial afectan al metabolismo energético. En este sentido, se
han obtenido datos relevantes mediante la manipulación de la expresión de Mfn2 en
distintos modelos celulares. Así, fibroblastos 10T1/2 transfectados con una secuencia
antisentido de Mfn2 muestran una disminución en la oxidación de glucosa y una reducción
similar del consumo de oxígeno mitocondrial (19).
La represión de Mfn2 en células musculares L6E9, mediante la transducción con
adenovirus antisentido, produce un perfil metabólico parecido, causando una disminución
en la tasa de oxidación de glucosa (19, 100). En estas condiciones, la captación de glucosa y
la producción de lactato se encuentran claramente incrementadas en las células musculares
con menor expresión de Mfn2, mientras que la incorporación de glucosa al glucógeno se ve
reducida significativamente (100).
La represión de Mfn2 en miotubos L6E9 también disminuye la tasa de oxidación de
piruvato y de palmitato, y está asociada a una reducción del potencial de membrana
mitocondrial en presencia de varios sustratos (100). Estas alteraciones en la oxidación de
sustratos inducidas por la pérdida de función de Mfn2 no son consecuencia de una
disminución de la masa mitocondrial.
En conjunto, estos datos indican que la represión de Mfn2 en células de mamífero
produce alteraciones en el metabolismo mitocondrial, caracterizadas por una menor
oxidación de diferentes sustratos y una disminución del consumo de oxígeno celular y del
potencial de membrana mitocondrial (Figura 3). Estos resultados van en el mismo sentido
que los observados en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) con mutaciones de
pérdida de función en ambas mitofusinas, Mfn1 y Mfn2. Estas células presentan pérdida de
potencial de membrana mitocondrial, consumo de oxígeno endógeno reducido e
incapacidad para incrementar la respiración en respuesta al ionóforo 2,4-dinitrofenol (12).
También, se han detectado alteraciones metabólicas en fibroblastos de pacientes con
determinadas mutaciones en el gen que codifica la proteína Mfn2. Así, fibroblastos que
presentan las mutaciones R364Q o A166T muestran un aumento del consumo de oxígeno
basal y de la respiración insensible a oligomicina, así como una disminución del potencial
de membrana mitocondrial (101). Los mutantes mencionados presentan una tasa de síntesis
CAPÍTULO VIII 167 de ATP similar a los controles pero una menor eficiencia de acoplamiento entre la cadena
respiratoria y la síntesis de ATP (ratio ATP/O). Estos cambios ocurren en condiciones en
las que la masa mitocondrial no se encuentra alterada y la actividad de los complejos de la
cadena respiratoria es normal (101). Por otro lado, se han descrito otras mutaciones de
Mfn2 como M21V, T105M, I213T o V273G que no presentan efectos a nivel del
metabolismo mitocondrial (Amiott et al, 2008; Loiseau et al, 2007). En la actualidad se
desconocen los mecanismos por los que determinadas mutaciones en Mfn2 causan
alteraciones metabólicas en fibroblastos humanos.
Figura 3.- Modelo de la función de la proteína de fusión mitocondrial Mfn2
sobre el metabolismo celular
El esquema resume la información conocida actualmente sobre los efectos
metabólicos de la pérdida de función de Mfn2 y de la sobreexpresión de una
forma de Mfn2 truncada por el extremo C-terminal (Mfn2Δ602–757) en células
en cultivo.
168 CAPÍTULO VIII Alteraciones en la expresión de OPA1, también afectan al metabolismo
mitocondrial. En este sentido, la represión de OPA1 en células MEF mediante ARNi
provoca una reducción en el potencial de membrana mitocondrial, una marcada
disminución de la respiración basal y una incapacidad para incrementar el consumo de
oxígeno en presencia del desacoplante 2,4-dinitrofenol (12).
Además, se ha descrito un aumento significativo en la producción de especias
reactivas de oxígeno (ROS) en moscas deficientes en OPA1 (102,103). Los primeros datos
referentes a las consecuencias de mutaciones de OPA1 sobre el metabolismo energético,
demuestran que el músculo de pacientes con atrofia óptica autosómica dominante (ADOA)
presenta una disminución en la producción de ATP (104).
Además, fibroblastos de pacientes de ADOA con determinadas mutaciones en
OPA1 muestran una disminución de la actividad enzimática del complejo IV y un aumento
de la actividad del complejo V (105). También se ha descrito que fibroblastos procedentes de
pacientes con ciertas mutaciones en OPA1 presentan alteraciones en la síntesis de ATP
usando sustratos para el complejo I (106). En este estudio se demuestra, mediante
coinmunoprecipitación, la interacción entre OPA1, AIF y los complejos I, II y III,
sugiriendo un posible mecanismo por el que estas mutaciones en OPA1 causarían defectos a
nivel de la cadena respiratoria.
En cambio, otro trabajo señala la existencia de otras mutaciones en OPA1 que no
alteran la actividad mitocondrial ni la bioenergética celular (107). En un estudio muy
reciente, se ha demostrado que el ratón knockout de OPA1 específico de células β del
páncreas muestra hiperglucemia tanto en ayuno como en alimentación, y una menor
tolerancia a la glucosa que los ratones control (108). La ablación de OPA1 también altera la
secreción de insulina en islotes pancreáticos aislados. Además, la producción de ATP
estimulada por glucosa y la actividad del complejo IV se encuentran significativamente
reducidas en las células β deficientes en OPA1 (108).
Estudios recientes, demuestran que alteraciones en las proteínas de fisión
mitocondrial producen efectos sobre el metabolismo mitocondrial similares a los originados
por modificaciones en los componentes de fusión. La represión de Drp1 en células HeLa
mediante ARNi induce la aparición de mitocondrias fusionadas e interconectadas. Estas
alteraciones morfológicas vienen acompañadas de una disminución del consumo de
oxígeno, de la síntesis de ATP y del potencial de membrana mitocondrial, así como de un
incremento en los niveles de ROS y de daño oxidativo (56, 109).
CAPÍTULO VIII 169 La represión de Drp1 también provoca la pérdida de ADN mitocondrial y la
activación de la autofagia (56, 109). Actualmente, se ha demostrado que determinadas
mutaciones en Drp1 disminuyen la expresión de subunidades de los complejos OXPHOS y
del contenido de ATP en el corazón, causando una cardiomiopatía en ratones (110). La
sobreexpresión de una forma dominante negativa de Drp1 y la represión de Fis1 también
producen una reducción de la capacidad respiratoria de las células de insulinoma de rata
INS1 (51). Así, se puede concluir que la perturbación de la dinámica mitocondrial, bien
modificando las proteínas de fusión o bien las de fisión, altera la producción de energía por
parte de las mitocondrias en células de mamífero.
Los mecanismos mediante los cuales la alteración de la dinámica mitocondrial afecta
al metabolismo energético, no se conocen completamente. En varios estudios, se ha
analizado la expresión o la actividad de los complejos de la cadena respiratoria
mitocondrial. La represión de Mfn2 en miotubos L6E9 causa una marcada disminución en
la expresión de algunas subunidades de los complejos I, II, III y V (100). Paralelamente, la
actividad enzimática de los complejos I+III y III disminuye en las células con menor
expresión de Mfn2 (100). También se han detectado deficiencias en las actividades de los
complejos I, II y III en células MEF doble knockout para ambas mitofusinas (12). Estos
resultados indican que la pérdida de función de Mfn2 causa alteraciones específicas en la
expresión de algunas subunidades de los complejos de la cadena respiratoria, lo que
conlleva a una disminución en la actividad de dichos complejos. Células MEF deficientes
en OPA1 también muestran una menor actividad de los complejos I, II y III (12).
Otra cuestión relevante referente a los mecanismos implicados en la regulación del
metabolismo mitocondrial por parte de las proteínas de dinámica mitocondrial, es si la
ganancia de función ejerce también efectos biológicos. Este aspecto ha sido analizado
principalmente en el caso de Mfn2. La sobreexpresión de Mfn2 en células HeLa provoca la
agregación de las mitocondrias alrededor del núcleo, así como un aumento del potencial de
membrana mitocondrial y de la oxidación de glucosa (100).
Del mismo modo, la sobreexpresión de Mfn2 en mioblastos L6E9 incrementa la
expresión de diferentes subunidades de los complejos I, IV y V (100). Con el propósito de
determinar si los efectos inducidos por la sobreexpresión de Mfn2 sobre la actividad
mitocondrial dependen o no de su actividad de fusión, se han llevado a cabo estudios con
una forma de Mfn2 truncada por el extremo C-terminal (hMfn2Δ602–757), que no
mantiene la capacidad de promover fusión mitocondrial. La sobreexpresión de hMfn2Δ
602–757 en células HeLa no altera la morfología de la red mitocondrial pero estimula la
170 CAPÍTULO VIII oxidación de glucosa e incrementa el potencial de membrana mitocondrial (100). En
resumen, los datos existentes indican que la ganancia de función de Mfn2 activa el
metabolismo mitocondrial y aumenta la expresión de subunidades de los complejos del
sistema OXPHOS. Los efectos estimuladores de Mfn2 sobre el metabolismo mitocondrial
no son totalmente dependientes de su actividad de fusión mitocondrial, aunque los
mecanismos específicos implicados aún se desconocen.
Sobre la base de la información existente, proponemos que las proteínas de dinámica
mitocondrial afectan al metabolismo por dos vías distintas: (a) por un lado, la perturbación
tanto de la fusión como de la fisión mitocondrial altera la producción de energía en células
de mamífero, sugiriendo que la dinámica mitocondrial per se controla el metabolismo
energético y (b) por otro lado, Mfn2 parece tener un papel regulador específico del
metabolismo mitocondrial a través de cambios en la expresión de las subunidades de los
complejos OXPHOS (111). Se requieren más estudios para determinar cómo operan estas
dos vías in vivo y para analizar en detalle los mecanismos moleculares implicados.
La función mitocondrial se encuentra alterada en situaciones de resistencia a la
insulina tales como la obesidad y la diabetes de tipo 2 (112, 113). Existen evidencias de que
en estas condiciones la expresión de los genes de dinámica mitocondrial también está
desregulada (114,115). En este sentido, la expresión de Mfn2 se halla disminuida en
músculo esquelético de ratas obesas Zucker y en personas con obesidad (19, 116).
Paralelamente, se ha observado una reducción del 25% de la red mitocondrial en músculo
de ratas Zucker (19). Por otro lado, la derivación bilio-pancreática causa un incremento de
la expresión del mARN de Mfn2 en músculo esquelético de individuos con obesidad
mórbida (117). En estas condiciones de pérdida masiva de peso, se produce una importante
mejoría de la sensibilidad a la insulina (117).
Los pacientes con diabetes de tipo 2 también muestran una reducción en la expresión
de Mfn2 en músculo esquelético en relación a los sujetos control (116). No es probable que
esta disminución en la expresión de Mfn2 sea consecuencia de una reducida acción de la
insulina, ya que en individuos sanos, obesos o diabéticos de tipo 2 la expresión de Mfn2 no
se altera en respuesta a 3 horas de hiperinsulinemia al ser sometidos a un clamp. Además, la
incubación de células musculares con concentraciones supramáximas de insulina durante 48
horas tampoco afecta a la expresión de Mfn2 (116).
Los datos existentes indican que Mfn2 controla el metabolismo mitocondrial en
células en cultivo (Bach et al., 2003; Chen et al., 2005; Pich et al., 2005). La reducción en la
CAPÍTULO VIII 171 expresión de Mfn2 observada en las situaciones de obesidad y diabetes de tipo 2 nos permite
proponer que esta proteína juega un papel relevante en la disfunción metabólica que
caracteriza estas condiciones.
Además, se ha demostrado que los coactivadores transcripcionales PGC-1α y PGC1β inducen la expresión de Mfn2 mediante la interacción con el factor de transcripción
ERRα (118, 119). Este hecho, puede ser particularmente relevante ya que se ha descrito
que la expresión de ambos coactivadores, así como la de Mfn2, se halla reprimida en la
obesidad y la diabetes de tipo 2 (113, 120). Dado el relevante papel de PGC-1α y PGC-1β
en la biogénesis mitocondrial y el metabolismo celular, alteraciones en las vías PGC-1α
/Mfn2 y PGC-1β/Mfn2 podrían conferir susceptibilidad al desarrollo de resistencia a la
insulina y a la diabetes de tipo 2.
MUTACIONES EN GENES INVOLUCRADOS EN LA DINÁMICA
MITOCONDRIAL CAUSAN ENFERMEDADES
NEURODEGENERATIVAS
Las mitocondrias son organelos sumamente importantes en todos los tipos celulares,
pero lo son particularmente relevantes en el sistema nervioso. Ellas, son esenciales para la
producción de energía, la regulación del calcio, el mantenimiento del potencial de la
membrana plasmática, el plegamiento de proteínas mediante chaperonas, el transporte
axonal y dendrítico, y la liberación y recaptación de neurotransmisores en las sinapsis.
Durante muchos años se ha propuesto que la respiración mitocondrial es la responsable de
la disfunción neuronal. En la última década, numerosos estudios han aportado evidencias
adicionales implicando la dinámica mitocondrial en la patofisiología de las enfermedades
neuronales. En relación a ello, se ha demostrado que mutaciones en genes involucrados en
la dinámica mitocondrial causan desórdenes neuronales.
Mutaciones en OPA1: atrofia óptica autosómica dominante
La atrofia óptica autosómica dominante (AOAD), es la más frecuente de las
neuropatías ópticas hereditarias, con una incidencia de 1:12.000 a 1:50.000 habitantes.
AOAD es una enfermedad genéticamente heterogénea y cinco loci se han asociado a esta
patología (OPA1 a OPA5) (121). Esta enfermedad se caracteriza por una deficiencia de la
172 CAPÍTULO VIII visión en la infancia temprana, que se caracteriza por una pérdida moderada a severa de la
agudeza visual, palidez temporal del disco óptico, defectos en la visión de colores y
escotomas (zonas de pérdida de campo visual) cecocentrales (122-124). El examen
histopatológico de ojos de donantes sugiere que la patología fundamental de AOAD es una
degeneración primaria de las células ganglionares retinales seguida por una creciente atrofia
del nervio óptico (125, 126).
Se han identificado 117 mutaciones del gen de OPA, las cuales son básicamente
familia-específicos (127) (http://lbbma.univ-angers.fr/eOPA1). Las mutaciones de OPA1
involucran principalmente sustituciones y también deleciones e inserciones (121, 128). Casi
el 50% de las mutaciones causa una terminación prematura de la proteína OPA1. La
mayoría de las mutaciones han sido observadas en el dominio GTPasa y probablemente
supriman la actividad de fusión mitocondrial. Se han detectado mutaciones adicionales en
la región NH2-terminal de OPA1 abarcando la secuencia de importación mitocondrial, las
secuencias hidrofóbicas y la región “coiled-coil”; en el dominio central; y en el dominio
GTPasa o dominio GED.
La patogénesis de AOAD se produce en algunos casos como el resultado de una
haploinsuficiencia (pérdida de función). Datos clínicos apoyan este concepto:
1) la deleción del gen completo de OPA1 o en el residuo aminoacídico 2 (Trp2X)
(129, 130);
2) casi el 50% de las mutantes de OPA1 causan la terminación prematura de OPA1,
un número importante de éstos en el dominio GTPasa, y es altamente probable que causen
pérdida de función; y
3) fibroblastos de la piel con mutaciones en OPA1 evidencian fosforilación oxidativa
y fusión mitocondrial deficientes (106).
En este aspecto, la ablación de OPA1 inducida por ARNi causa fragmentación
mitocondrial, disminución del potencial de membrana mitocondrial y de la respiración
celular, desorganización de las crestas mitocondriales y apoptosis (17, 48, 131, 132). En
ratones la pérdida de función de OPA1 inducida por deleción (sin corrimiento del marco de
lectura) de 27 aa en el dominio GTPasa (en heterocigosis) exhibe degeneración de las
células gangionares retinales y desorganización de las crestas mitocondriales en los axones
del nervio óptico (133). Ratones mutantes inducidos mediante ENU (N-etil-N-nitrosurea)
que contienen una mutación sin sentido en el gen de OPA1 (en heterocigosis), la cual
CAPÍTULO VIII 173 produce una proteína truncada, también muestra un 50% de reducción de la proteína
OPA1, la aparición lenta de la degeneración del nervio óptico y la disminución de la
función visual (134).
Además de la haploinsuficiencia, la AOAD puede producirse como consecuencia de
un mecanismo de dominancia negativa. En este aspecto, se han reportado varias
mutaciones sin sentido en el gen de OPA1 que eliminan los elementos consenso para la
unión a GTP (130, 135-137) (http://lbbma.univ-angers.fr/eOPA1), y mutantes de la
GTPasa de OPA1 o de su ortólogo de levadura Mgm1 evidencian un efecto negativo en
presencia de la proteína salvaje (90, 138, 139).
Recientemente, se ha publicado que mutaciones de OPA1 causan oftalmoplegia
externa progresiva además de atrofia óptica dominante. Este síndrome extra de OPA1
(“OPA1 plus syndrome”) es un fenotipo clínico caracterizado por una reducción en el
número de copias de ADN mitocondrial. En relación a ello, pacientes con determinadas
mutaciones en OPA1 muestran múltiples deleciones en el ADN mitocondrial en el músculo
esquelético (140, 141).
En los últimos años, se ha obtenido información creciente con respecto a las
patologías relacionadas a OPA1, sin embargo quedan aún pendientes de resolver los
interrogantes de por qué las mutaciones de OPA1 afectan específicamente a la célula
ganglionar retinal y no a otros tipos celulares, y si mutaciones de OPA1 causan enfermedad
debido a la disrupción de la morfología mitocondrial o si esta alteración es secundaria a la
mayor susceptibilidad a la apoptosis. Por ende, son necesarios estudios adicionales sobre la
función de OPA1 para poder responder a dichas preguntas.
Mutaciones en MFN2: Charcot-Marie-Tooth Tipo 2A
La enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT) (también conocida como neuropatía
motora y sensorial hereditaria HMSN) se caracteriza clínicamente por debilidad y atrofia
muscular distal, predominantemente en las extremidades inferiores, y pérdida sensorial.
Aproximadamente 1 de cada 2.500 individuos es diagnosticado con CMT, lo que conlleva a
que sea la enfermedad hereditaria más común y la neuropatía hereditaria más habitual
(142).
CMT2 se caracteriza por la degeneración y la regeneración axonal crónica,
produciendo una pérdida continua de fibras nerviosas asociada a una velocidad de
conducción del nervio motor normal o levemente reducida (≥38 m/s) (143, 144).
174 CAPÍTULO VIII Mutaciones en MFN2 son la causa del 20% de los casos de CMT2 (145), haciéndola la
forma axonal de CMT más prevalente. Los casos de CMT2 presentan alta variabilidad en
cuanto a los síntomas clínicos. Se han hallado mutaciones de MFN2 en familias con CMT2
que se asocian a características adicionales tales como espasticidad (también referida como
neuropatía motora y sensorial hereditaria de tipo V, HMSN V) (146) o atrofia (HMSN VI)
(147).
Se han identificado más de 40 formas mutantes de MFN2 en pacientes con CMT2A
(145-152), y la mayoría de dichas mutaciones son de sentido erróneo. Más del 50% han sido
detectadas en el dominio GTPasa de MFN2 (entre los residuos aminoacídicos 99 y 310).
Además, se detectaron mutaciones de MFN2 en la región NH2-terminal, cerca o en el
dominio de unión a Ras; en la vecindad o en la región “coiled-coil” 1 (406-433); y en el
extremo COOH terminal, en la región “coiled-coil” 2, del lado citoplasmático.
Curiosamente, teniendo en cuenta las aproximadamente 23 mutaciones halladas en el
dominio GTPasa, ninguna de ellas afecta la unión a GTP (153).
En el gen de MFN2, hay zonas de alta frecuencia de mutación (“mutational spots”).
Con respecto a ello, estudios clínicos indican que algunas de las mutaciones de MFN2 han
sido halladas en más de una familia. Dos estudios clínicos importantes demostraron la
existencia de dos subgrupos de pacientes de CMT2 que pueden distinguirse sobre la base de
las diferencias en la edad de aparición y la severidad de la enfermedad.
En relación a ello, se han detectado algunas de las mutaciones en pacientes con
aparición temprana de la enfermedad (<10 años de edad) y un fenotipo clínico fuerte,
mientras que otras mutaciones de MFN2 se han detectado en pacientes con aparición tardía
y enfermedad más leve (148, 151). Es llamativo que la mutación R280H ha sido identificada
en pacientes con aparición tardía de la enfermedad (en 6 individuos de la misma familia),
mientras que la misma mutación ha sido detectada en otra familia de distinto origen
asociada a una aparición temprana de la enfermedad. Estos datos sugieren que el ambiente
o genes moduladores estarían regulando la intensidad del fenotipo.
Las mutaciones de MFN2 responsables de CMT2A se heredan en forma autosómica
dominante; como consecuencia pueden producir haploinsuficiencia o una ganancia de
función dominante. En esta línea, la sobreexpresión de algunas formas mutantes de MFN2
induce la agregación de mitocondrias en cultivos de neuronas ganglionares de la raíz dorsal
de rata o en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) resultando en una ganancia de
CAPÍTULO VIII 175 función, mientras que otras formas mutantes o la MFN2 salvaje no producen agregación
mitocondrial (22, 153).
También, en relación a esto, se han generado ratones transgénicos que expresan una
forma mutante de MFN2 con una presumible ganancia de función (T105M)
específicamente en neuronas motoras. Estos ratones evidencian un fenotipo consistente con
los síntomas clínicos detectados en CMT2A, sugiriendo que mutaciones en MFN2 afectan
la patogénesis de esta enfermedad (154).
Además de los efectos dominantes mostrados por algunos mutantes de MFN2,
estudios realizados en MEFs doble knockout de MFN2 (KO simultáneo de MFN1 y
MFN2) evidencian que algunos mutantes de MFN2 también confieren ausencia de
actividad de fusión mitocondrial (22). En un estudio diferente se ha demostrado que otros
mutantes de MFN2 inducen movilidad mitocondrial reducida en cultivos neuronales (153).
Es interesante comentar que la actividad de fusión mitocondrial defectuosa de
algunos mutantes de Mfn2 es rescatada por la expresión de Mfn1, que está de acuerdo con
la observación de que Mfn1 se asocia físicamente con Mfn2 salvaje y con formas mutadas
causantes de CMT2A (101, 155).
CMT2A es una axonopatía y esto está de acuerdo con el fenotipo obtenido en
ratones knockout condicionales para MFN2. De hecho, la ablación específica de Mfn2 en el
cerebelo de ratones causa neurodegeneración (29). Bajo estas condiciones, las células de
Purkinje evidencian una distribución mitocondrial aberrante y un crecimiento dendrítico y
formación de espinas reducidos (29). Estos resultados indican que Mfn2 es esencial para
mantener la función neuronal. Hasta el momento, la interacción entre mutantes de Mfn1 y
de Mfn2, y la capacidad de Mfn1 de rescatar la función es la única explicación mecanística
disponible que explique las alteraciones tejido-específicas en los pacientes con CMT2A.
Otra conclusión extraída a partir de la información disponible sobre mutaciones de
MFN2 que causan CMT2A es la considerable heterogeneidad con respecto a las
alteraciones en sus propiedades biológicas. Con respecto a ello, algunos mutantes de MFN2
muestran ganancia de función, otros, pérdida de función, mientras que otros parecieran
provocar ambos, ganancia y pérdida de función (22, 153).
176 CAPÍTULO VIII Mutaciones en GDAP1: Charcot-Marie-Tooth Tipo 4A
Las mutaciones en GDAP1 están asociadas con el tipo 4A de CMT (CMT4A), la
forma recesiva de CMT detectada con mayor frecuencia (93, 94). CMT4 es clínicamente
similar pero más severa que CMT1 y tiene una edad promedio de aparición temprana.
CMT4 se define clásicamente como una forma demielinizante de la enfermedad y está
asociada a de- y remielinización segmental, en contraste a CMT2, que muestra
degeneración axonal sin demielinización (156, 157). Sin embargo, el análisis de la tasa de
conducción nerviosa de individuos con mutaciones en GDAP1 indica que mientras algunas
mutaciones muestran bajas tasas de conducción (94, 158, 159), otras se caracterizan por
presentar tasas normales (158, 160-163). Estos datos demuestran que algunas mutaciones en
GDAP1 causan pérdida axonal más que demielinización.
GDAP1 se expresa en las células de Schwann en proceso de mielinización y en las
neuronas del sistema nervioso periférico en roedores (92, 164), y existen evidencias que
indican que la expresión génica de GDAP1 es mucho mayor en las últimas (164), y que las
células de Schwann en cultivo no expresan GDAP1 (164). Estas observaciones sugieren que
las neuronas del sistema nervioso periférico son el principal tipo celular afectado en esta
enfermedad. Sin embargo, se requieren estudios adicionales que demuestren este punto.
Tras su expresión en células COS-7, los mutantes de GDAP1 presentan actividad de
fusión mitocondrial deficiente, a pesar de localizarse en la mitocondria (92). Algunos
mutantes son completamente inactivos con respecto a la promoción de la fragmentación
mitocondrial, y otros mutantes muestran algún efecto residual sobre la fragmentación
mitocondrial aunque muy reducido en comparación con la actividad de GDAP1 salvaje
(92).
Es interesante mencionar que la mutación T157P, descripta originalmente como una
mutación dominante de novo en un caso esporádico (165), induce agregación mitocondrial,
sugiriendo una potencial ganancia de función (166).
Muy recientemente, se han identificado 4 mutaciones patogénicas heterocigotas, 3 de
las cuales novedosas, en familias con CMT (167). Tres de las mutaciones presentan
penetrancia reducida. La aparición de la enfermedad en los individuos afectados fue
variable, extendiéndose desde la infancia temprana hasta la adultez. La progresión de la
enfermedad fue lenta en la mayoría de los pacientes y la severidad global más moderada que
la observada típicamente en las mutaciones de GDAP1 autosómicas recesivas. En la
mayoría de los pacientes los cambios electrofisiológicos son heterogéneos pero compatibles
CAPÍTULO VIII 177 con la neuropatía axonal. Por ello, este reporte confirma la variabilidad fenotípica y la
penetrancia reducida de las mutaciones de GDAP1 autosómicas dominantes en CMT.
Mutaciones en DRP1: Desarrollo cerebral anormal
Se ha publicado un reportaje de una niña recién nacida con microencefalia,
desarrollo cerebral anormal, atrofia e hipoplasia óptica, acidemia láctica persistente, y
concentración plasmática levemente elevada de ácidos grasos de cadena muy larga (168).
A los 6 días de vida, estudios de resonancia magnética del cerebro revelaron un
patrón giral anormal en ambos lóbulos frontales que se extendía hacia las áreas perisilvias y
que estaba asociado a desmielinización. Además, la infante evidenciaba hipotonía troncal
con movimientos espontáneos pequeños, carecía de reflejos en los tendones y no respondía
a la estimulación lumínica (168). El desorden fue letal, y la paciente falleció a los 37 días de
vida. La paciente también presentaba alteraciones metabólicas que consistieron en
concentraciones elevadas de lactato en sangre, de alanina plasmática y de ácido cerótico
(ácido graso de cadena muy larga). La paciente también evidenciaba concentraciones
elevadas de lactato, alanina, piruvato y proteína en el fluido cerebroespinal.
Estos datos sugieren alteraciones en la oxidación mitocondrial (oxidación de
piruvato) como así también en la oxidación peroxisomal (oxidación de ácidos grasos de
cadena muy larga). Fibroblastos obtenidos de la paciente mostraron una deficiente fisión
mitocondrial y fisión peroxisomal. Los análisis genéticos revelaron una mutación
heterocigota sin sentido en DRP1 (A395D) y que se localiza en un residuo aminoacídico
conservado en el dominio medio de la proteína. Esta mutación se comporta de forma
dominante y causa la inhibición tanto de la fisión peroxisomal como de la mitocondrial
cuando se expresa en fibroblastos (168).
Esta inhibición podría ser explicada por un posible defecto en la oligomerización
inicial de DRP1 requerida para la formación de las estructuras altamente ensambladas
sobre la membrana mitocondrial. Este papel hipotético del dominio central ha sido
recientemente demostrado para dinaminas convencionales (169).
Evidencias experimentales indican que ratones que carecen de Drp1 presentan
anormalidades en el desarrollo, particularmente en el cerebro anterior, y mueren en
promedio un poco después de E12.5. Ratones DRP1-/- específico de células neurales (NS)
mueren poco después de su nacimiento como resultado de una hipoplasia cerebral con
apoptosis. Cultivos primarios de cerebro anterior de ratones NS-DRP1-/- evidenciaron una
178 CAPÍTULO VIII disminución en el número de neuritas y también una formación sináptica defectuosa,
probablemente debido a la presencia de mitocondrias agregadas que no pudieron
distribuirse correctamente entre las proyecciones neuronales (57). Los autores remarcaron la
importancia de la fisión mitocondrial DRP1-dependiente en células altamente polarizadas
como es el caso de las neuronas.
La depleción Drp1 específica de cerebro causó defectos en el desarrollo del cerebelo:
las células de Purkinje poseían unas pocas mitocondrias gigantes en vez de muchas
mitocondrias cortas y tubulares observadas en células controles (58). Además, el proceso de
apoptosis regulada durante el desarrollo no pudo llevarse a cabo durante la formación del
tubo neural in vivo en los embriones DRP1 homocigotas.
Resumiendo, la mutación A395D de DRP1 causa una enfermedad letal que puede
reflejar defectos en la función mitocondrial o peroxisomal. La severidad de las
características clínicas sugiere que las mitocondrias y los peroxisomas están involucrados en
la patogénesis de la enfermedad. Estudios adicionales en animales mutantes confirman el
papel esencial de Drp1 en la dinámica mitocondrial como así también en el proceso de
apoptosis en el desarrollo neuronal. Sin embargo, estos hallazgos requieren de evidencia
experimental suplementaria.
Mutaciones en LETM1: El Síndrome de Wolf-Hirschhorn
Hasta este momento, hemos revisado la información disponible sobre el efecto de
mutaciones humanas en genes involucrados en la fusión y fisión mitocondrial. Mutaciones
en genes involucrados en la morfología mitocondrial tal como LETM1 también provoca
enfermedad neurodegenerativa.
El síndrome de Wolf-Hirschhorn (WHS) es un complejo desorden de malformación
causado por la deleción de un fragmento del cromosoma 4 y tiene una incidencia de
1/50.000 nacimientos vivos (170). El WHS se caracteriza por retardo de crecimiento y
mental, hipotonía congénita, apariencia facial distinta, defectos cardíacos congénitos,
defectos en la línea media, y convulsiones.
Un número desconocido de genes contribuyen con el fenotipo. El extremo 5’ del gen
de LETM1 está deleccionado en todos los pacientes con WHS con el fenotipo completo. Un
paciente portador de una pequeña deleción intersticial cercana a LETM1 mostró una
afección muy débil y carecía de convulsiones, lo cual sugiere que LETM1 está involucrado
CAPÍTULO VIII 179 en algunas de las características neuromusculares del WHS (171). LETM1 es una proteína
de 83.5-kDa que se expresa en forma ubicua.
LETM1 es una proteína de la membrana interna mitocondrial (172) y posee
identidad de secuencia aminoacídica con proteínas mitocondriales de numerosas especies.
La delección del gen en levaduras causa disfunción mitocondrial, contenido incrementado
de cationes (especialmente K+) y mitocondrias hinchadas (173). Por ello, se ha propuesto
que está involucrado en la morfología de organelas y que participa en el intercambio de
K+/H+ a través de la membrana mitocondrial interna (173).
Datos recientes, confirmaron que LETM1 es un transportador antipórtico
mitocondrial (que intercambia Ca2+ y H+) (174). Hallazgos adicionales han demostrado que
LETM1 modula la morfología mitocondrial en células de mamíferos. En relación a ello, se
ha observado que su represión causa muerte celular no mitocondrial, fragmentación de la
red mitocondrial independiente de DRP1, hinchamiento mitocondrial y desorganización de
las crestas (172, 175).
Los defectos en la morfología mitocondrial causados por la pérdida de función de
LETM1 pueden restablecerse mediante la normalización de los flujos de K+ a través de la
membrana interna (172, 175). Por otra parte, la represión neurona-específica de DmLETM1
de Drosophila resulta en trastornos del comportamiento locomotor de la mosca y una
liberación sináptica reducida de neurotransmisores (176). Por lo tanto, estos datos resaltan
la importancia de los flujos de iones y LETM1 en el mantenimiento de la morfología y la
función mitocondrial normales.
En conclusión, evidencias experimentales y clínicas confirman que mutaciones en
genes relacionados a la dinámica mitocondrial son responsables de varias neuropatías.
Además, vale la pena mencionar que las proteínas de la dinámica mitocondrial están
asociadas a procesos celulares relevantes tal como la unidad mitocondria-retículo
endoplásmico, el control de calidad mitocondrial y el tráfico mitocondrial, los cuales son
esenciales para el correcto funcionamiento/sobrevida de la neurona. En este reporte,
alteraciones en la expresión/actividad de las proteínas de la dinámica mitocondrial podrían
estar jugando un papel patofisiológico relevante en las enfermedades neurodegenerativas
más importantes.
180 CAPÍTULO VIII AGRADECIMIENTOS
Este estudio fue financiado por proyectos de investigación del Ministerio de
Educación y Cultura” (SAF2008-03803), de la Generalitat de Catalunya (Proyecto
2005SGR00947), CIBERDEM (Instituto de Salud Carlos III), de la Comisión Europea FP7
(MITIN, HEALTH-F4-2008-223450), y de INTERREG IV-B-SUDOE-FEDER
(DIOMED, SOE1/P1/E178). J.S. fue becaria predoctoral de la Fundación Ramon Areces.
M.I.H.-A. fue becaria predoctoral de CONACYT, Mexico. A.Z. disfrutó de un Premio de
Intensificación Científica de la Universitat de Barcelona.
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CAPÍTULO VIII 195 
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