CA TALIZ4DOR ENLA SINTESIS DE DIPÉPTI[DOS”

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE FARMACIA
Dpto. de QUÍMICA ORGÁNICA Y FARMACÉUTICA
“a-QUIMOTRIiPSINA INMOVILIZADA COMO
CA TALIZ4DOR EN LA SINTESIS DE DIPÉPTI[DOS”
TESIS DOCTORAL
CARLOS TORRES FECED
Madrid, Enero de 1997
El Dr. José
Vicente
Sinisterra Gago, Catedrático de Química Orgánica y
Farmacéutica y el Dr. Andrés R. Alcántara León, Profesor Titular de Química
Orgánica y Farmacéutica del Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica de
la Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid
CERTIFICAN:
que la presente Memoria titulada:
“¿v-QUIMOTRJPSINA lAMOVIL(ZADA COMO
CATALIZADOR EN £4 SINTESIS DE DIPÉPTIDOS”
que presenta D. Carlos Torres Feced para optar al grado de Doctor en Farmacia, ha
sido realizada bajo su dirección y ralbe las condiciones necesarias para ser juzgada por
el tribunal correspondiente, autorizando así su presentación.
Para que conste donde proceda firman el presente certificado en Madrid, 30 de
Enero de 1997.
Fdo: Dr. José Vicente Sinisterra Gago
Fdo:Dr. Andrés R. Alcántara León
CIUDAD UNIVERSITARIA
28040 MADRID
TEL.: 304 18 23
FAX: 3941822
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE FARMACIA
DEPARTAMENTO DE QUíMICA ORGÁNICA Y FARMACÉUTICA
D. JOSÉ VICENTE SINISTERRA GAGO, CATEDRATICO Y DIRECTOR DEL
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA Y FARMACÉUTICA DE LA FACULTAD DE FARMACIA EN LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID,
CERTIFICA:
que D. CARLOS TORRES FECED ha realizado en los laboratorios
de este Departamento, bajo la dirección del Dr. José V. Sinisterra
(lago y del Dr. Andrés R. Alcántara León, el presente trabajo de
Tesis Doctoral para optar al grado de Doctor en Farmacia, con el
título:
a- QUIMO TRIPSINA
INMO
IZADA
COMO CATALIZADOR ENLA SÍNTESIS DE
DIPÉPTIDOS Y para que conste donde proceda, a petición del interesado, firmo el
presente en Madrid, a veintinueve de Enero de mil novecientos
noventa y siete.
Memoria presentada para optar
al grado de Doctor en Farmacia por:
CARLOS TORRES FECED
“a-QUIMOTRJPSINA INMOVILIZADA COMO
CATALIZADOR EN £4 SÍNTESIS DE DIPÉPTIDOS”
Directores:
Dr. José Vicente Sinisterra Gago
Dr. Andrés R. Alcántara León
Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica
Facultad de Farmacia
Universidad Complutense de Madrid
Madrid, Enero de 1997
Quiero expresar mi más sincero agradecimiento:
A D. Andrés R. Alcántara León, por su magistral dirección, por las enseñanzas de él
recibidas, y por los buenos momentos que hemos compartido durante la realización de este
trabajo.
A D. José Vicente Sinisterra Cago, por su dirección, y por el interés prestado en todo
momento.
A Cherna, Miki, Pepa y Mayda, con los que he compartido muy buenos momentos, trabajando
codo con codo durante estos años y de los que guardo un entrañable recuerdo.
A Nieves Cabezas por su confianza y amistad.
A Mercedes Villacampa y al futuro Dr. José M~ Pérez, con los que he disfrutado de
experiencias muy agradables fuera del departamento.
A Chami, Sonia, Isabel e Isidoro con los que pasado el último período de este trabajo
disfrutando de su amistad.
A Antonio, Juancho y Ana por los ratos pasados juntos y por su pequeña contribución a este
trabajo, y al resto de compañeros que han pasado o aún están en los laboratorios 1, 2 y 3.
A Angel Rumbero y Carmen del Campo por sus consejos y colaboración en la finalización de
este trabajo.
A la profesora Elena de la Cuesta por despertar mi interés por el apasionante mundo de la
Química Orgánica
Al resto de los componentes de este departamento, por hacer de éste un agradable lugar de
trabajo.
A la Comunidad de Madrid, por su aportación económica en forma de boca de Formación de
Personal Investigador
A D. Javier Burguillo, por su interés y colaboración en la realización de las fotografías de
microscopia electrónica.
A D. J. M. Guisán y a su grupo de trabajo por los derivados inmovilizados sobre agarosa
indispensables para llevar a cabo la presente Memoria.
A D~. M~ Helena Gil, por su disposición y ayuda prestada, suministrando los copolímeros
requeridos para obtener los derivados objeto de estudio.
A mi familia y más concretamente a mis padres por la ayuda y comprensión prestada, sin la
cual este trabajo no se hubiera podido realizar.
A ¡ni tía
Angelines y abuelos
.:
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN
1.1.- ENZIMAS: ASPECTOS GENERALES
1.1.1.- ESTRUCTURA. CLASIHCACIÓN Y NOMENCLATURA
.1
1
1.1.2.- CATÁLISIS ENZIMÁTICA Y SU APLICACIÓN EN PROCESOS
BIOCATALIZADOS
1.2.- PROTEASAS: CONCEPTO Y CLASIFICACIÓN
1.3.- a-OUIMOTRIPSINA
5
8
lo
1.3.1.- ESTRUCTURA Y OBTENCIÓN
lo
1.3.2.- ESTRUCTURA DEL CENTRO ACTIVO
18
1.3.3.- REACCIONES DE HIDRÓLISIS
25
1.3.4.- SELECTIVIDAD DE LA a-OUIMOTRIl>SINA
31
1.4.- SÍNTESIS DE PÉPTIDOS CATALIZADA POR ENZIMAS.
37
1.4.1.- PROTEASAS EN LA SÍNTESIS DE PÉPTIDOS
PERSPECTIVAS Y LIMITACIONES
37
1.4.2.- MECANISMOS DE SÍNTESIS DE PÉPTIDOS
44
1.4.3.- FACTORES OUE INFLUYEN EN EL RENDIMIENTO
DE LA SINTESIS DE UN ENLACE PEPTÍDICO
51
1.4.4.- ASPECTOS EXPERIMENTALES DE LA SÍNTESIS
DE PÉPTIDOS CATALIZADA POR ENZIMAS
65
U.- OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO
71
11.1.- PLAN DE TRABAJO
71
III.- PARTE EXPERIMENTAL
72
111.1.- ENZIMAS. SUSTRATOS Y REACTIVOS
72
111.1.1.- ENZIMAS
72
111.1.2.- SIJSTRATOS
72
111.1.3.- DISOLVENTES
72
111.1.4.- OTROS REACTIVOS
74
111.1.5.- APARATASE EMPLEADO
75
111.1.6.- PROGRAMAS INFORMATICOS
75
111.2.- CARACTERIZACIÓN DEL PREPARADO COMERCIAL
78
111.2.1.- DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO PROTEICO
DE LA a-OUMOTRIIPSINA COMERCIAL
78
111.2.2.- MEDIDA DE LA ACTIVIDAD DE LA
«-OUIMOTRII>SINA NATIVA
81
111.3.- SINTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE LOS DERIVADOS
DE a-QUIMOTRII’SINA INMOVILIZADA SOBRE COPOLIMEROS
DE INJERTO <PE/HEMA’>
84
111.3.1.- PREPARACIÓN DEL SOPORTE (PE/IIEMA)
84
111.3.2.- INMOVILIZACIÓN COVALENTE DE LA a-OUIMOTRIiPSINA
SOBRE COPOLÍMEROS DE LN.IERTO (PE/HEMA)
88
111.3.3.- DETERMINACiÓN DE LA ACTiVIDAD ENZIMÁTICA
DE LOS DERIVADOS INMOVILIZADOS
91
111.4.- DERIVADOS INMOVILIZADOS SOBRE
GELES DE AGAROSA
91
111.4.1.- ACTIVACIÓN DEL SOPORTE
91
111.4.2.- INMOVILIZACION DE LA ENZIMA
93
111.5.- SINTESIS PEPTIDICA CATALIZADA POR a-OUIMOTRIPSINA
93
INMOVILIZADA EN MEDIOS ORGÁNICO-ACUOSOS
111.6..- ENSAYOS CON DERIVADOS DE a-OUIMOTRIPSINA
INMOVILIZADA SOBRE COPOLIMEROS DE INJERTO (PE/HEMA)
111.6.1.- ENSAYOS DE ESTABILIDAD ENZIMÁTICA
..
96
96
111.6.2.- ENSAYOS DE ABRASIÓN
103
111.6.3.- HIDRÓLISIS DE BTEE
104
111.6.4.- REACCIONES DE SÍNTESIS DE PÉPTIDOS
CINÉTICAMENTE CONTROLADAS
111.6.5.- SINTESIS DE PEI’TiDOS TERMODINÁM1CAMENTh
105
.
CONTROLADAS
108
111.6.6.- REACCIONES MÚLTIPLES DE SÍNTESIS DE PÉPTIDOS
Y POSTERIOR PURIFICACIÓN DE LOS MISMOS
109
111.7.- ENSAYOS REALIZADOS CON DERIVADOS DE
«-OUIMOTRIPSINA INMOVILIZADA SOBRE GELES DE AGAROSA. 111
111.7.1.- HIDRÓLISIS DE BTEE
111
111.7.2.- REACCIONES DE SÍNTESIS DE PÉPTIDOS CINÉTICAMENTE
CONTROLADAS. EFECTO DE DIVERSAS VARIABLES
112
111.7.3.- SINTESIS DE PÉPTIDOS TERMODINÁMICAMENTE
CONTROLADAS
111.8.- REACCIONES CON SUSTRATOS NO NATURALES
114
115
111.8.1.- SINTESIS OUÍMICA DE LOS ÉSTERES
SUSTRATOS DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS
115
111.8.2.- HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA EMPLEANDO SUSTRATOS
NO CONVENCIONALES
116
IV.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN
118
IV.1.- ENSAYOS CON LOS DERIVADOS DE a-OUIMOTRIPSINA
INMOVILIZADA SOBRE COPOLÍMEROS DE INJERTO
118
IV.1.1.- CARACTERÍSTICAS DE LOS DERIVADOS DE
a-OUIMOTRIPSINA INMOVILIZADA SOBRE
COPOLIMEROS DE INJERTO
118
IV.i.2.- ESTUDIO DE LA RESISTENCIA A LA DESACTIVACIÓN.. 126
IV.1.3.- ENSAYOS DE ABRASIÓN
139
IV.1.4.- REACCIONES DE HIDRÓLISIS
140
IV.1.5.- REACCIONES DE SÍNTESIS DE PÉPTIDOS
CINETICAMENTE CONTROLADAS
143
IV.i.6.- REACCIONES DE SÍNTESIS DE PÉPTIDOS
TERMODINÁMICAMENTE CONTROLADAS
IV.1.7.- REACCIONES DE SÍNTESIS DE PÉPTIDOS
181
.
EN REACTOR DISCONTINUO Y POSTERIOR
PURIFICACIÓN DE LOS MISMOS
182
lvi.- ENSAYOS CON DERIVADOS INMOVILIZADOS SOBRE
GELES DE AGAROSA
196
IV.2.1.- CARACTERIZACIÓN DE LOS DERIVADOS INMOVILIZADOS
SOBRE GELES DE AGAROSA
196
IV.2.2.- REACCIONES DE HIDRÓLISIS DE BTEE.
197
IV.2.3.- REACCIONES DE SÍNTESIS DE PÉPTIDOS
CINETICAMENTE CONTROLADAS
202
IV.2.4.- REACCIONES DE SINTESIS DE PÉPTIDOS
TERMODINÁMICAMENTE CONTROLADAS
IV.3.- SUSTRATOS NO NATURALES
233
236
[Y. 2.1.-INTRODUCCIÓN
236
IV.3.2.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN
248
V.- CONCLUSIONES
268
VI. BIBLIOGRAFÍA
270
-
L- INTRODUCCIÓN
.
Introducción: Enzinms
E- INTRODUCCIÓN
1.1.- ENZIMAS: ASPECTOS GENERALES
1.1.1.- ESTRUCTURA. CLASIFICACIÓN Y NOMENCLATURA
Las enzimas son proteínas desarrolladas por las células de los organismos vivos con la
función específica de catalizar reacciones químicas in vivo (1). También son capaces de
catálizar la vitro reacciones en las que intervienen tanto sustratos naturales corno no naturales
(2,3). Cuando el sustrato transformado pertenece a este segundo tipo, se emplea la
denominación de BIOTRANSFORMACIÓN para designar el proceso.
Como todas las proteínas, las enzimas poseen una estructura primaria, secundaria y
terciaria. La estructura primaria se debe a la secuencia de aminoácidos unidos por enlaces
peptídicos, mientras que la secundaria y terciaria confieren a la enzima su forma tridimensional
(fIgura 1). La estructura cuaternaria sólo aparece en aquellas enzimas constituidas por varias
subunidades, las cuales se asocian entre sí, mediante uniones de tipo no covalente.
Debido a su estructura proteica, las enzimas son sensibles a los cambios que se
producen en su entorno. La presencia de disolventes orgánicos, iones, la variación del pH, de
la temperatura o del microentomo, pueden alterar la estructura secundaria, terciaria o
cuaternaria y pueden provocar la desnaturalización de la enzima, es decir, la pérdida de su
estructura ordenada. En general, la mayoría de las enzimas desarrollan su actividad óptima a
pH=7.O y a una temperatura de 370C, si bien existen excepciones, tales como las alcalasas
que trabajan a un pH
>
8.0, las lipasas, que trabajan en las interfases aceite-agua y son
bastante resistentes a la presencia de disolventes orgánicos, o las enzimas de “termófilos” o
“arqueas”, cuya temperatura óptima de trabajo es igual o superior a 60 oc.
Las enzimas se han clasificado sistemáticamente por el Comité Internacional de
Enzimología en 6 clases principales, cada una de las cuales se divide a su vez en subclases,
según el tipo de reacción que catalizan (Tabla 1). Cada enzima se designa por un nombre
I~QIn~fl4adQ, generalmente corto y apropiado para su uso habitual, por un nombre
sisIwn~IkQ, que identifica la reacción que cataliza, y por un número de clasificación que
1
Introducción: Enzimas
a
R’
CH
N
0N
R
N
O
CH
—
II
1
X ¾ -flt-.
N.
O
CH2
O
R
1
Fi
O
1.
A
3
II
14
Fi
I~
1
Fi
O
1
II
N
~
0
O
O
¾ — N.
II
CH
R’
.-
N
Fi
H
03014
Y
b 1: lámina fi autiparalela
R
4
E
5.4 A
It
b2: a-hélice
b3: lámina fi paralela
c
Figura 1.- Estructura de las enzimas: (a) estructura primaria; (b) estructura secundaria;
(c) estructura terciaria.
2
Introducción: Enzimas
Identifica a la enzima de forma inequívoca. Para ilustrar con un ejemplo, la enzima aquimotripsina, empleada en la presente Tesis viene clasificada con el número E.C. 3.4.21.1,
donde E.C. son las iniciales en inglés de Comisión de Enzimas, la primera cifra «3” representa
el nombre de la clase (hidrolasa), la segunda cifra «4» representa a la subclase (enlaces
peptídicos, ya que rompen este tipo de enlaces), la tercera cifra «21» a la sub-subclase (Serinproteasas, ya que la unión al carboxilo se realiza a través de un resto de serma) y la cuarta
cifra «1» que indica que la ruptura del enlace peptídico se produce en la vecindad de un
aminoácido aromático.
Tabla 1. Clasificación internacional de las enzimas.
1.- OXIDO REDUCTASAS:
(Reacciones de oxido-reducción)
1.1 Actúan sobre alcoholes >-OH
1.2 Actúan sobre cetonas > C=O
1.3 Actúan sobre alquenos > =CH1.4 Actúan sobre grupos amino -NH2
-
-
1.5 Actúan sobre grupos imino =NH
-
2.- TRANSPERASAS:
2.1 Grupos de un átomo de C
2.2 Grupos aldehídicos o ceténicos
2.4 Grupos glucosilo
-
(Transferencia de grupos funcionales)
-
2.7 Grupos fosfato
2.8 Grupos que contienen azufre
-
3.- HIDROLASAS.
3.1 -Esteres
(Reacciones de hidrólisis)
3.2 Enlaces glucosídicos
3.4 Enlaces peptídicos
3.5 Otros enlaces C-N
3.6 Anhídridos de ácido
-
-
4.-
LIASAS.
(Adición a dobles enlaces)
4.1
4.2
4.3
-
-
> C=O
-
5.- ISOMERASAS
(Reacciones de isonrrirac¡ón)
5.1 Racemasas
6.- LIGASAS:
(Formación de enlaces con escisión de ATP)
6.1
6.2
6.3
6.4
-
3
-
Entre átomos de C yO
Entre átomos de C y 5
Entre átomos de C y N
Entre átomos de C y C
.
Introducción: Enzimas
1.1.2.- CATÁLISIS ENZIMÁTICA Y SU APLICACIÓN EN PROCESOS
BIOCATALIZADOS
Las enzimas, como catalizadores, tienen las siguientes características principales, que
pasamos a comentar:
1) Como todo catalizador, aumentan la velocidad de la reacción al disminuir la
energía de activación necesaria para que ésta se lleve a cabo.
Las enzimas normalmente catalizan las reacciones con mayor eficacia que los
catalizadores inorgánicos. Como ejemplo citaremos la descomposición del agua oxigenada en
agua y oxígeno. La energía de activación necesaria para que suceda la reacción en ausencia de
catalizador es de 75 KJ/mol. Esta energía se reduce a 50 KJ/mol en presencia de platino, y
disminuye a 8 KJ/mol si se hace en presencia de peroxidasa (denominada clásicamente
catalasa). Esto justifica el interés aplicado de los biocatalizadores.
—
keacciánenzñnillc.
T(eaccióu no onsizná~’a
AEA
E+SaE-S-.E+P
Curso
del, nacdón
Figura 3.- Efecto de la catálisis enzimática sobre la energía de activación. AEÁ es la
energía libre de activación para una reacción catalizada por una enzima mientras que
AEI es la de una reacción no catalizada. AG0 es la energía libre de la reacción.
5
Introducción: Enzimas
2) Las enzimas son catalizadores selectivos: la formación del complejo enzimasustrato sucede en una pequeña región de la enzima denominada ~nhxQ..acLixQ,
el cual suele
estar localizado en un hueco o cavidad de la estructura proteica. La selectividad de las enzimas
es la base de muchas de sus aplicaciones en Síntesis Orgánica, ya que ofrecen la posibilidad
de llevar a cabo transformaciones muy selectivas con estructuras quirales, polifuncionales o
lábiles. La especificidad enzimática reside inherentemente en este centro activo, que posee las
dimensiones correctas, la topología adecuada y el alineamiento óptimo de grupos contraiónicos
y regiones hidrofóbicas para acomodar a un sustrato específico. Solamente unos pocos
aminoácidos (entre 5 y 10) dentro del centro activo están directamente implicados en la
catálisis enzimática y constituyen el centro de fijación. Estos aminoácidos no están localizados
consecutivamente en la cadena polipeptídica, sino que se encuentran juntos tras el plegamiento
característico de la enzima; por ello, la alteración de la estructura de la proteína puede
desactivar el catalizador. No obstante, aquellos aminoácidos que no intervienen directamente
en la catálisis también son importantes, ya que son esenciales en el mantenimiento de la
conformación activa de la enzima.
Se han propuesto varios modelos para explicar la selectividad de las enzimas hacia un
determinado sustrato. El modelo de “la llave y la cerradura” (4), que da una versión rígida de
las enzimas, ha sido ampliamente superado por el modelo del “acoplamiento o encaje
inducido” (5). En este modelo, el sustrato induce la orientación de los residuos en el centro
activo para que se realice la unión al centro de fijación y suceda la catálisis.
3) Las enzimas pueden ser objeto de regulación, es decir, su actividad catalftica
puede estar influenciada por la concentración de sustratos, productos y otras especies químicas
presentes en solución. E] tema de la regulación de las enzimas, de enorme importancia en los
sistemas metabólicos donde normalmente actúan, es un inconveniente cuando se emplean como
catalizadores en reacciones
iii
vitro con sustratos no naturales. Así, cuando la concentración
del producto de la reacción biocatalizada aumenta hasta cieno valor, puede existir una
inhibición de la enzima por producto final lo cual reduce el interés de la aplicación de estas
enzimas al no poder trabajar en grandes concentraciones de reactivos (6, 7). Existen dos
formas de evitar este problema:
1) La eliminación del producto del medio de reacción a medida que se va formando
6
Introducción: Enzinms
(a veces resulta un proceso no excesivamente sencillo).
II) El aumento de la cantidad de enzima (lo que supone un aumento en el coste del
proceso).
4) Ciertas enzimas pueden requerir la presencia de cofactores para que sean activas.
El apode de estos cofactores y su regeneración significa un encarecimiento del proceso
biocatalizado.
5) La mayoría de las enzimas son solubles en agua y presentan mayor actividad iii
ui¡o a pH=7-8 y a temperatura ambiente. Esto complica su utilización in vitro con sustratos
no naturales, generalmente lipóides.
6) Se pueden utilizar varias enzimas en combinación para realizar transformaciones
que sucedan en varios pasos sucesivos. Esto no es técnicamente viable, por lo que muchas
veces se acude al empleo de la célula entera.
7) Las enzimas, dada su estructura proteica, se degradan en condiciones
relativamente suaves. Los químicos, acostumbrados a conservar sus catalizadores metálicos
durante mucho tiempo sin una pérdida considerable de actividad, se enfrentan con unos
biocatalizadores que requieren un manejo mucho más cuidadoso; ésto implica muchas veces
el que se busquen catalizadores inorgánicos menos eficaces pero más estables en las
condiciones de reacción.
Las enzimas se pueden desnaturalizar mediante diversos mecanismos como:
1) La acción de proteasas presentes como contaminantes en los preparados
enzimáticos;
II) La temperatura o los cambios de composición del medio, que pueden alterar la
conformación de la proteína;
III) La contaminación microbiana;
IV) La autooxidación; etc.
Por ello la manipulación de las enzimas, tanto durante su utilización como durante su
conservación, exige un manejo más delicado que el de otro tipo de catalizadores.
De todo lo dicho podemos concluir que la inestabilidad, el precio elevado y la
especificidad respecto al sustrato son los principales inconvenientes que presentan las enzimas
para ser utilizadas como catalizadores industriales con sustratos no naturales. Sin embargo,
7
lntrodncción: Pr~~~s
muchos de estos problemas se han superado en los últimos años de investigación en
biotransformaciones:
J) Existen ya una gran cantidad de enzimas comercialmente muy baratas, que
transforman muchos sustratos estereoselectivamente originando intermedios de síntesis no
accesibles económicamente por otras vías.
2) Con el objetivo de utilizar los biocatalizadores en procesos industriales a gran escala,
se han desarrollado técnicas que mejoran la estabilidad de las enzimas y que facilitan su
recuperación y reutilización (8); como ejemplos, citaremos la inmovilización y la modificación
química.
3) Los avances de la Biología Molecular y los nuevos métodos del ADN recombinante
han permitido la manipulación del material genético, el aislamiento de genes productores de
enzimas y su expresión en otros microorganismos con el fin de obtener determinadas proteínas
en grandes cantidades (9). Como consecuencia de ésto, el precio de las enzimas ha bajado
espectacularmente.
Estas técnicas también permiten la alteración controlada de las enzimas, creando
enzimas artificiales con nuevas actividades.
4) La limitación que supone la insolubilidad de ciertos sustratos no naturales en agua
se ha visto en parte superada por la posibilidad de realizar reacciones en sistemas heterogéneos
en los que una pequeña parte del sustrato está presente en la disolución donde se suspende la
enzima (10). Esto se logra empleando cosolventes orgánicos como el etilenglicol, el glicerol,
el dimetilsulfóxido (DM50) o la dimetilformamida (DMF), donde las enzimas son bastante
estables (11).
1.2.- PROTEASAS: CONCEPTO Y CLASIFICACIÓN
Las enzimas que producen la ruptura de enlaces peptídicos (amídicos) en sustratos
proteicos se denominan PROTEASAS (o también peptidasas). Estas enzimas llevan a cabo la
catálisis en reacciones de transferencia de acio, en las cuales un resto acilo es transferido a una
molécula de agua.
El comité de Nomenclatura de la Unión internacional de Bioquímica, en sus reglas
8
Introducción: Proteasas
dictadas a tal fin en 1984, clasificó a las proteasas dentro del grupo de enzimas hidrolíticas,
junto con estearasas, glicosidasas y lipasas (Tabla 1, Sección 1.1.1). Históricamente, las
enzimas hidrolíticas que actúan sobre sustratos proteicos fueron de los primeros catalizadores
biológicos en ser purificados y caracterizados, debido, en parte, a su estabilidad.
Las proteasas pueden, a su vez, clasificarse en dos tipos, dependiendo de su
especificidad en la ruptura de los enlaces peptídicos: cuando el enlace susceptible de ser roto
se encuentra en el interior de una cadena polipeptídica, la enzima se considera una
ENDOPEPTIDASA; si por el contrario, la ruptura se lleva a cabo en el grupo amino terminal
o en el carboxilo terminal, la enzima es una EXOPROTEASA, las cuales pueden ser, por
tanto, bien aminopeptidasas o carboxipeptidasas.
Las proteasas se dividen en relación a su función fisiológica, en dos clases diferentes:
a) Proteasas que degradan los polipéptidos y las proteínas con fines digestivos y
nutricionales. Tales enzimas funcionan tanto extracelularmente (en el tracto intestinal) como
intracelularmente (en los orgánulos hidrolíticos intracelulares llamados lisosomas, situados
fundamentalmente en las células del hígado y riñón).
b) Proteasas que tienen como función la limitación y control de la proteolisis de
sustratos proteicos, para lo cual degradan o activan enzimas. Unos ejemplos de este tipo de
transformación aparecen en la Tabla 2.
Tabla 2.- Proteasas actuando en procesos
f
de control de funciones risk>ldgicas.
FUNCION FISIOLOGICA
EJEMPLO
Mecanismos de defensa
Coagulación sanguínea
Producción hormonal
Pminsulina-lnsulina
Digestión
Zimógeno-Proteasa activa
Uniones macromoleculares
Fibrinógeno-Fibrina
Procolágeno-Colágeno
Desarrollo y crecimiento
Proqujtma sintetasa-quitina sintetasa
9
Introducción. a-Quinvatripsina
Según su mecanismo de acción las proteasas se dividen por grupos (12):
1 .-Protcasas con un residuo de SERINA en el centro activo (endoproteasas), también
llamadas SERINPROTEASAS. Según su origen, se pueden dividir a su vez en dos familias:
aquellas que se extraen de órganos de mamíferos, como son la a-quimotripsina, tnpsina, y
elastasa; y por otro lado, las que se obtienen a partir de microorganismos bacterianos, como
es el caso de la subtilisina.
2.-Proteasas con un residuo CISTEINA en el centro activo (endoproteasas), también
llamadas SULFHIDRILPROTEASAS tales como la papaína.
3. -Metaloproteasas (endoproteasas y exoproteasas) que contienen un metal en su
estructura, bien provenientes del páncreas de mamíferos (carboxipeptidasa A) o bien de origen
bacteriano como la termolisina.
4. -Proteasas
con
un
residuo
ASPÁRTICO
en
su
centro
activo,
ASPARTILPROTEASAS (penicilinopepsina).
1.3- a-OUIMOTRIIPSINA
1.3.1.- ESTRUCTURA Y OBTENCIÓN
La a-quimotnpsma es, segón las clasificaciones de proteasas dadas en la Sección 1.1.1,
una ENDOPROTEASA con un residuo SERINA en el centro activo.
Su origen se encuentra en las células acínicas del páncreas, donde se sintetiza en forma
de precursor inerte, el quimotripsin6geno A, el cual está formado por una sola cadena
polipeptídica de 245 residuos aminoácidicos, con un peso molécular aproximado de 25 KDa.
Este precursor inerte es transportado por el jugo pancreático hasta el intestino delgado, donde
es atacado por la tripsina (SERINPROTEASA), lo que origina la ruptura de un enlace
peptídico crucial para originar la enzima plenamente activa. Esta ruptura ocurre entre los
residuos Arg15 e Ile16
,
(13, 14), originando un producto, compuesto por dos cadenas,
completamente activo, llamado n-quiniotripsina. Esta forma de la enzima no es estable en el
intestino y sufre dos rupturas más (catalizadas por otras dos moléculas de quimotripsina)
originando sucesivamente 5-quimotripsina (ruptura Leu13-5er14) y a-quimotripsina (Thr,47
lo
-
Introducción: a-Quñmtripsñm
Asn148) (Figura 4).
¡68
42
T
—
lle¡6
Arg 15
¡49
Ser
Leu ¡4¡3
¡47
42
—
168
¡¡e ¡6
Leu ¡3
¡49
¡46
¡<Srs
1
Quimotripsinógeno
a-Qubnotripsina
(1 cadena)
(3 cadenas)
Figura 4.-Activación de quimotripsinógeno. T y C representan la acción de tripsina y
quimotripsina respectivamente.
Esta última, la a-quimotripsina, es, por tanto, una enzima cuya estructura está formada
por tres cadenas polipeptídicas unidas entre sí por puentes disulfuro. Una representación
esquemática de la misma se muestra en la FIgura 5.
Así, la a-quimotripsina consta de 241 residuos aminoacídicos con un peso molecular
aproximado de 24,8 KDa; las tres cadenas péptidicas unidas por enlaces disulfuro constan de
13, 131 y 97 residuos respectivamente y se denominan A, B y C.
Los residuos esenciales para la actividad catalítica de la proteína aparecen señalados con
círculos en la Figura 5, y son Asp1~, lbs57 y Ser195. Los aminoácidos que intervienen en la
conversión de quimotripsinógeno inactivo en a-quimotripsina activa están marcados con
cuadros y son: Ile16, Asp1~ e His~. Muchos otros aminoácidos, que no están marcados, son
importantes para la unión del sustrato porque forman la cavidad en la cual se fijan las cadenas
11
Introducción: a-Quñnotripsina
6 CHAIN
NH,
2
(-5
Figura 5.-Secuencia de amin4cidos de la «-quimotripsina bovina, según Hartley y cok
(15, 16) y Meloun ycols (17).
(@) Residuos amino y carboxilo terminales.
(O) Residuos implicados en la reacción catalítica.
(O) Residuos implicados en la activación del quhnotripsinógeno.
(A) Residuos implicados en la unión de los sustratos al centro activo.
12
Introducción: a’.Quinrtripsina
laterales hidrofóbicas de los sustratos específicos de la «-quimotripsina (18); por otra parte.
existen otros dos residuos marcados con triángulos que también están implicados en la unión
de los sustratos, pero que se sitúan fuera del centro activo, y son Ser,14 (18) y Met19, (19, 20).
En 1967 se obtuvo un mapa de Rayos X de densidades electrónicas de alta resolución
de la Tosil-a-quimotripsina (21, 22). Posteriores cálculos permitieron mejorar el mapa de
densidad electrónica, lo que hizo que se pudieran analizar coordinaciones atómicas de casi toda
la molécula (23).
La Tosil-a-quimotripsina es un derivado inactivo de la a-quimotripsina que se obtiene
por tosilación del resto de serbia del centro activo (24, 25). La Tosil-a-quimotripsina cristalina
tiene la misma estructura que la a-quimotripsina cristalina (26), salvo unas pocas diferencias
en el centro activo. Los cristales pertenecen al grupo espacial P2, con unas distancias a=49.3
0. La celdilla unidad contiene dos moléculas
A, b67. 3 A, c=65. 9Ay un ángulo ~=l0l.8
de enzima (27) y aparece representada en la Figura 6.
La molécula de enzima es elipsoidal, con unas dimensiones de aproximadamente 51
a lo largo del eje cristalográfico t’a” y 40
A en
los ejes “b” y
“&‘.
A
La molécula está un poco
aplanada en el centro activo y presenta un agujero en la superficie el cual tiene un papel muy
importante en la unión a los sustratos específicos.
Los residuos 235-245 de la parte C-terminal forman una a-hélice. En esta zona, el
último enlace peptídico tiene una orientación que produce un estrechamiento de la hélice
semejante a la estructura de hélice ~
(28). Este efecto ya ha sido observado en la
Mioglobina y en la Lisozima. La estructura recibe el nombre de a~-héIice (29). Los residuos
164-173 también presentan estructura en a-hélice; esta hélice está distorsionada por la
existencia de un enlace de hidrógeno ~
en el centro de la hélice. El cuidadoso examen de
este tramo acentúa la dificultad de decidir si la relación de los dos enlaces peptídicos
consecutivos es más típica de la a-hélice o de la hélice ~
ya que la distancia total de los
ángulos diedros, característicos de las dos hélices, es solo de 350 (29).
13
Introducción: a-Quimotrinsina
(a)
76
36
245
¡95
H15 57
146
92
Mp 102
¡70
Ch)
O
¡07
H
C
a
—
N
H
II
o
,.
N
\
—
Co
87
C
¡
C
N
-‘-Ca—
IQÓ
II
—
N~
N
H
H
II
~c:
II
o
O
los
N
II
88
—C
H
—
H
o
o
~
O
c
‘~~C
II
O
II
~
¡03
N
Ii
90
~~C0
N-
¡
c
It
o
—
N
‘—
—
91
Figura 6.- (a)Estructura de la a-quimotripsina. (b) Representación de los puentes de
hidrógeno en la estructura antiparalela de la a-quimotripsina.
14
Introducción: a-Qwnvútríps,na
La disposición antiparalela de láminas plegadas (30) es bastante común en la molécula
de a-quimotripsina, aunque no hay regiones extensas de lámina plegada regular. Por el trazado
de la cadena principal en zig-zag, casi todos los residuos que forman los puentes de hidrógeno
de la cadena principal están muy próximos. El modelo de líneas en zig-zag se utiliza para
recalcar la distancia de dos unidades plegadas en la molécula entre los residuos 27-112 y 133230. Cada una de estas unidades consta de una serie de seis líneas antiparalelas que siguen el
mismo patrón; dentro de cada unidad hay algunos puentes de hidr6geno del tipo de láminas
plegadas antiparalelas entre cada una de esas líneas y sus vecinas. Además, existen puentes de
hidrógeno entre la sexta y la primera línea de cada unidad, de tal forma que las seis líneas se
unen formando un cilindro (31, 32). Estos cilindros están tan distorsionados que son casi
irreconocibles, pero cada uno contiene un núcleo de residuos hidrofóbicos.
En la cadena principal de la proteína los enlaces de hidrógeno se establecen entre un
grupo amido y el carbonilo del tercer residuo posterior. Este tipo de enlace de hidrógeno es
característico de la hélice 3.0w (29) y muy común en la molécula de a-quimotripsina,
especialmente al final de las vueltas o rizos donde la cadena polipeptídica se tuerce y vuelve
a ser paralela a su dirección original (32).
Todos los grupos cargados de la proteína se sitúan en la superficie de la molécula,
excepto el grupo «-amino de la 1le~6 y los grupos carboxílicos de Mp
~=
y Asp
~.
Aunque
existen muchos grupos hidrofóbicos en la superficie de la molécula como Phe39 y Phe41, la aquimotripsina presenta la tendencia general, observada en otras proteínas, a tener los grupos
hidrofóbicos colocados hacia el interior y los grupos ionizables expuestos hacia el exterior.
También se ha visto que hay varias moléculas de agua atrapadas dentro de la molécula de
proteína (33). Los diferentes entornos de los residuos de la enzima aparecen en la Tabla 3.
16
Introducción: a-Quinntrjvsina
Tabla 3.- Entorno de las cadenas de aminoácidos en la u-quimotripsina.
CADENA LATERAL
Amino-
GRUPO FUNCIONAL
Externo
Superficie
Internob
Grupo
Externo
Interno
Gly
11
3
8
Ala
13
3
6
Val
4
8
11
Leu
2
7
8
Ile
3
3
4
Ser
20
3
3
Hidroxilo
21
5
Thr
15
4
3
Hidroxilo
19
3
Asp
7
1
1
Carboxilo
7
2
Glu
4
1
0
Carboxilo
5
0
Asn
11
2
0
Amida
11
2
Gín
6
3
1
Amida
8
2
Lys
14
0
0
Amino
14
0
Arg
3
0
0
Guanídíno
3
0
His
0
2
2
Imidazol-N
1
3
Phe
1
5
0
Tyr
2
2
0
Hidroxilo
3
1
Trp
0
6
2
Indol-N
3
5
Pro
3
3
3
Cys
3
4
3
Sulfuro
5
5
Met
1
0
1
Sulfuro
1
1
ácido
b
Superficie, sr~m&a: que solo un lado de la cadena latemí es accesible al agua.
Interno, significa: Ma ccesible al agua, asumiendo que la estructura cristalográfica
17
observada sea rígida.
Introducción: ¿z-Quiniotrijpsina
Este experimento probaba que el residuo de la Ser195 juega un papel vital en el proceso
catalítico.
Normalmente, la ionización del gmpo -OH de los residuos de serbia, necesaria para
llevar a cabo el incremento de nucleofilia del átomo de oxígeno y poder realizar el ataque
nucleofílico que conduzca al intermedio acil-enzima, es insignificante debido al alto valor del
pKa (~ 14) del grupo -CH2-OH. Debería existir alguna especie de catálisis básica que aumente
la nucleofilia de la Ser195 para facilitar esta disociación. Así, el complejo ES’se produce
mediante un sistema de movimientos de densidad electrónica (58) en el cual están implicados
tres residuos aminoacídicos: serbia, histidina, y ácido aspártico, denominada TRIADA DE
AMINOÁCIDOS del centro activo. Concretamente en el caso de la «-quimotripsina, estos
residuos son la Ser195, la His ~ y el Asp1~
,
hecho que fue deducido mediante estudios de
difracción de Rayos X (58), los cuales mostraron un ordenamiento preciso de los tres residuos.
Qe
Qn
CLV 193
•0
SER i95
ASP ¡94
ILE ¡6
MIS 57
ASP loa
Esquema 2.-Representación de la triada catalítica.
19
Introducción: cx-Quinrtripsina
en las ionizaciones microscópicas del sistema. El valor de k
depende de un pKa de 6.7 a 7.0,
y este pKa se asigna normalmente a la disociación de un protón de la forma catiónica de His57.
No obstante también se podría asignar a un grupo ¡3-carboxílico, del Asp192, el cual
normalmente presenta un pKa de aproximadamente 4.5. No obstante, este último residuo se
encuentra en un entorno hidrófobo en el interior de la proteína, y este medio elevaría el pKa
de este grupo carboxflico, puesto que el anión carboxilato sería menos estable en un medio de
baja constante dieléctrica. Por tanto, Hunkapiller y cols. (59) postularon que los pKa de los
residuos de His57 y de Asp1~ estaban invertidos, y que la ionización que se produce a valores
de pH de aproximadamente 7.0 se debía a la pérdida de un protón del grupo carboxilo de un
residuo aspártico en presencia de un anillo neutro de imidazol en lugar de la pérdida de un
protón de un catión imidazólico en presencia de un anión carboxilato. Estas suposiciones se
vieron refrendadas mediante un estudio realizado en una serin-proteasa de origen bacteriano,
la proteasa a-lítica de Myxobacter 495 (59). Dicha enzima sólo presenta un residuo histidina,
3C, y analizado
concretamente el situado en el centro activo, el cual puede ser marcado con ‘
con RMN, a fin de calcular los valores concretos de pKa, los cuales resultaron ser 4.0 para
el catión imidazólico y 6.7 para el carboxilo del ácido aspártico. Posteriores estudios de RMN
(60, 61) ya realizados sobre la propia a-quimotripsina, así como otros estudios de difracción
de neutrones, (62) reafirmaron estos valores de pKa para los residuos mencionados.
La mutagénesis dirigida también ha sido empleada para reafirmar la importancia del
residuo de Asp
1~ (63), realizando el cambio de este aminoácido por una asparragina. El valor
de k~ calculado resultó ser 5000 veces menor que el de la enzima nativa, lo que demuestra que
este residuo Asp10, es importante, pero no imprescindible, para la catálisis. Mediante
marcadores de afinidad se demostró también que la mutación de Asp1~ a Asn origina efectos
considerablemente mayores sobre la reactividad de la Ser195 que sobre la His57. Otros estudios
de mutagénesis dirigida demostraron que las tres cadenas laterales implicadas en el sistema de
intercambio de densidad electrónica actúan de modo sinérgico para aumentar la velocidad de
catálisis (64).
Un residuo metionina, concretamente Met1~, también tiene cierta importancia en la
catálisis, debido a su cercanía con el centro activo. Esto fue demostrado por Lawson y
Schramm (65), al realizar la acilación de la Ser195 con N-(bromoacetil)-a-aminobutirato de p20
Introducción: a-Quimotripsina
a) PASO DE ACILACIÓN
El sustrato se une al centro de unión de la enzima, mediante un puente de hidrógeno
entre un hidrógeno del grupo N-acilamino y el grupo carbonilo de la Ser214, de forma que el
grupo carbonilo reactivo se coloca con su oxígeno entre los -NH- de la cadena de los grupos
Ser195 y Gly1~ (Esquema 4), originando el complejo ES (paso a1).
No obstante, es posible que el eniace de hidr6geno entre el oxígeno y la Gly1~ sea más
largo y débil. Ahora se produce el primer paso químico, ataque del hidróxilo de la Ser1~ al
carbono carbonílico para formar un intermedio tetraédrico (paso a2). Durante este ataque, el
protón del hidróxilo es transferido al imidazol de la His
mientras el resid uo Asp1~ retira el
otro protón del anillo de imidazol. De esta forma se ha aumentado la nucleofilia del grupo
hidróxilo de la Ser195.
El oxígeno, con su carga negativa, se mueve hacía posiciones más cercanas al -NR- del
residuo Gly1~, fonnando un enlace de hidrógeno más corto y fuerte. El estado de transición
se estabiliza con respecto al complejo ES debido a las mejores interacciones del grupo saliente
y el centro activo de la enzima, más concewtamente al enlace de hidrógeno con la citada
glicina. El intermedio tetraédrico posteriormente se rompe (paso a), para formar el complejo
acil-enzima produciendose la liberación del primer producto de la reacción hidrólisis.
En el Esquema 4 se muestran los pasos (a
1’
a2, a3) que componen el proceso de
acilación.
b) PASO DE DEACILACIÓN
El proceso de deacilación supone el ataque de una molécula de agua, que actúa como
nucleófilo, atacando al complejo adil-enzima. Según el principio de reversibilidad
microscópica, los pasos implicados en esta reacción han de seguir mecanismos similares a los
del proceso directo. La activación de la molécula para actuar como nucleófilo se produce de
modo similar al hidroxilo de la Ser1~; de nuevo funciona el mecanismo de desplazamiento de
densidad de carga electrónica entre la triada de aminoácidos del centro activo, tal y como se
representa en el Esquema 5.
22
Introducción: a-Quinntr4,sina
bibliografía otros casos con: cinamato de o-nitrofenilo (72), con N-trans-cinamoil-imidazol
(73), con un sustrato específico de la a-quimotripsina, el N-acetil-L-triptofanato de metilo (66)
o con la sultona del ácido 2-hidroxi-5-nitro-«-tolueno-sulfónico (74).
En la hipótesis de Hartley y Kilby se predijo que el complejo ES’ debe presentar una
geometría covalente.
Posteriormente esta hipótesis fue confirmada con diferentes
experimentos:
-Un estudio cinético mediante la técnica “stopped flow” de la hidrólisis de un
tripéptido con elastasa demostró que la descomposición de un intermedio tetraédrico para
producir la enzima acilada es el paso limitante de la reacción hidrolítica total (75).
2.-Mediante estudio de Rayos X de complejos formados por tripsina y moléculas
proteicas pequeñas que actúan como potentes inhibidores. (76, 77)
3.-Reduciendo la temperatura de la reacción hidrolítica hasta el punto de lograr el
aislamiento del complejo tetraédrico (78).
1.3.3.1.- Diferencias entre ésteres y amidas
Dado que el paso fundamental del proceso químico es la acilación de la enzima para
originar el complejo acil-enzima, éste es el primer paso a estudiar.
Para ello vamos a comentar brevemente la formación del complejo acil-enzima en la
hidrólisis de ésteres y en la hidrólisis de amidas (hidrolisis de péptidos).
El mecánismo de hidrólisis del acetato de p-nitrofenilo se ha usado como modelo para
estudiar la hidrólisis de ésteres catalizada por a-quimotripsina (Esquema 8 anteriormente
expuesto). El proceso implica la acetilación del grupo -OH de la Ser1~ y tiene lugar en dos
etapas (79, 80), como ya se ha comentado.
Guntfreund y Sturtevant sugirieron que la hidrólisis de todos los ésteres catalizada por
a-quimotripsina tiene el mismo mecanismo que el observado para el caso de la hidrólisis del
acetato de p-nitrofenilo (81, 82).
Cuando el sustrato S es el éster etílico de la N-benzoil-L.tirosina, sustrato que se
empleará a menudo en la presente Memoria, P1 es etanol y 1% es N-benzoil-L~tirosina, ¾
es
la constante de disociación del complejo enzima-sustrato y ES es la enzima acilada, en la que
-
28
Introducción: a-Quimo tn»sina
el oxígeno del -OH de la Ser~95 está unido al carbono carboxíico de la N-benzoil-L.-tirosina.
a) Estudios cinéticos de la hidrólisis de ésteres
La velocidad de hidrólisis de ésteres catalizada por a-quimotripsina se ha medido bien
mediante valoraci6n del ácido liberado en la reacción de hidrólisis (83), bien empleado
métodos espectrofotométricos (84, 85). Cuando la concentración inicial de sustrato [S0] es
mayor que la concentración de enzima, [E], las respresentaciones de velocidad frente a
concentración de sustratos nos permiten determinar los parámetros cinéticos (86, 87).
Las constantes cinéticas para el proceso indicado anteriormente son:
y
_ lqk3
[E] k2+k3
[1]
k
K=k1 x.......L.
[2]
En este caso, se ha visto que k2 > 1<3 con lo que los parámetros cinéticos se pueden
escribir como:
k~, =1<3
=
(k3Ik2)
Para explicar la influencia del alcohol en el proceso se ha realizado hidrólisis de
diferentes ésteres de N-acetil-L-fenilalanina (R
=
Metilo, Etilo, o p-nitrofenilo) (88),
analizando los valores de k~, para cada uno de ellos, observándose que eran similares, lo que
indica que el paso limitante del proceso, por analogía con la hidrólisis del acetato de pnitrofenilo, debería ser la descomposición del complejo N-acetil-L4enilalanina-aquimotripsina.
De todos estos datos se deduce que la hidr¿lisis de ésteres tiene lugar a través de la
formación rápida de un intermedio cuya ruptura es el paso limitante de la velocidad de
29
Introducción: Selectividaddelag~qu¡motr¡psina
observación sugiere que el impedimento estético en esta posición no permite al grupo
acilarnido del carbono-a alcanzar la conformación adecuada, impidiendo así que el enlace
sensible al proceso de hidrólisis adopte la conecta conformación para ser hidrolizado.
El grupo acilamido, que está unido al residuo aminoacídico específico, tiene un
importante efecto sobre la reactividad de la a-quimotripsina. La sustitución de ese grupo amido
-NH- por un éster (108) o por un grupo metileno (102) o incluso la presencia de un resto
metilo en el citado grupo amido provocan una disminución en la reactividad y en la
estereoespeciflcidad de la a-quimotripsina (102, 106, 109). Ingles y Knowles (50) demostraron
que el aumento de la reactividad de los sustratos con grupo amido no era debido a que se
unieran más fuertemente a la enzima, sino que era el resultado de una orientación más
favorable de estos sustratos específicos. Estos autores demostraron que la energía de la
interacción enzima-acilamido era similar a la del enlace de hidrógeno y sugirieron que esa
energía de enlace era compensada forzando al sustrato a una configuración de alta energía.
Mediante estudios cristalográficos se ha visto que el grupo amido del N-formil-L-
triptéfano está orientado de tal forma que puede establecer un enlace de hidrógeno con el
grupo carbonilo de la Ser214 (18). Si el resto aromático de un sustrato específico está unido
firmemente al centro “a?, entonces la función acilaniido podría evitar la rotación alrededor
del enlace «43 del residuo aminoacídica, y así el enlace que va a ser hidrolizado adoptaría la
orientación adecuada para la actuación hidrolítica de la enzima.
Los resultados cristalográficos sobre la unión de sustratos a la a-quimotripsina son
confusos debido a la interacción con Tyr1~ de una molécula de agua adyacente al entorno de
la zona de interacción del acilamido. Por ello, los datos de Rayos X no dan evidencia acerca
de la adquisición de una conformación de alta energía por parte del sustrato, si bien tampoco
la excluyen de la unión.
Norin ycols. (110) empleando la metodología de la Mecánica Molecular (M.M.) han
postulado semicuantitativamente la estereoquímica de los sustratos suceptibles de hidrólisis de
ésteres catalizada por a-quimotripsina. Estos autores proponen un esquema del estado de
transición más detallado que el indicado por Hansch y cois (111) para explicar la
enantiopreferencia observada, analizando las interacciones de los grupos que rodean al centro
34
Introducción: Síntesis de péptidos
ve]ocidades de deacilación de los complejos (D y L)-acil-ct-quimotripsina procedentes del
proceso de hidrólisis de los ésteres de p-nitrofenilo de algunos aminoácidos naturales (118).
La velocidad de deacilación~del complejo acil-enzimadepende directamente de la fuerza
de eniace de la cadena literal del aminoácido, aumentando en la serie L y disminuyendo en la
serie D. Las diferencias de velocidad observadas para la deacilación de los distintos
aminoácidos de la serie Ldependen fundamentalmente de factores entrópicos (119).
El valor obtenido en el proceso de hidrólisis de los derivados del L-triptófano implica
que la orientación es casi perfecta para la deacilación del complejo acil-enzima por el agua
(51).
1.4.- SINTESIS DE PÉPTIDOS CATALIZADA POR ENZIMAS
1.4.1.- PROTEASAS EN LA SÍNTESIS DE PÉPTIDOS: LIMITACIONES Y
PERSPECTIVAS
Los péptidos son polímeros de aminoácidos de pequeño peso molecular (desde 2 hasta
100 residuos aminoacídicos), que presentan una enorme versatilidad funcional. Estos pueden:
estimular o inhibir la liberación de hormonas, actuar como edulcorantes, toxinas, agentes
quimiotácticos, frtores de crecimiento, analgésicos, neurotransmisores, etc. (120). El interés
por el estudio y síntesis de péptidos ha ido paralelo con la velocidad con que se van
descubriendo nuevos péptidos biológicamente activos. Así mientras en una revisión publicada
en 1953 “Naturally Ocurring Peptides” (121), se presentan las estructuras conocidas de
solamente seis péptidos, hoy día la cifra es del orden de millares de péptidos conocidos.
Recomendamos al lector el excelente trabajo de revisión bibliográfica recientemente
publicado por Vulfson y cok., en el cual se citan innumerables ejemplos de péptidos
biológicamente activos (122).
La variedad de propiedades biológicas de los péptidos hace que la síntesis, tanto de
péptidos naturales, como de análogos sintéticos, tenga un enorme interés y diferentes campos
de aplicación. Un ejemplo de ello sería el uso de péptidos sintéticos como agentus terapéuticos,
y.
g., los análogos sintéticos de hormonas peptídicas, que podrían tener nuevas e importantes
37
Jnzroducción: Síntesis de péptidos
propiedades farmacológicas: mayor potencia de acción, diferente especificidad biológica,
mayor estabilidad, etc.
La automatización de la metodología de síntesis de péptidos en fase sólida descrita por
Merrifleld (123) ha permitido en la actualidad obtener péptidos mediante un proceso sencillo
y automatizado, el cual aparece reflejado en el Esquema 21.
x
Y
aa~
Aooplnni torito
y
x—aan~i— aa~
Do ase o pie rito nt o
x
Y
aa,~~— aa~
Acopienironto
Y
x— aa~2— aa,<— ea,
X
x
aa~, ~
Y
y— ea,4 ~
55n-í
—
Y
X—
Deeacoplani¡onto
aa~~—aa~
1— aa0
Peptido
Esquema 21.- Síntesis en fase sólida, X e Y son reactivos de protección y activación
respectivamente
No obstante, este proceso presenta algunas desventajas frente a otros métodos de
síntesis de péptidos, como se puede observar en la Tabla 7, en la que se comparan entre silos
diferentes métodos de inmovilización.
38
Introducción: Sinicsis de péptidos
Tabla 7.- Comparación de los diferentes métodos empleados actualmente en la síntesis de
péptidos (122).
Condiciones
Síntesis química
Síntesis química
Síntesis
Ingeniería
en fase sólida
en fase líquida
enzimitica
Genética
Escala típica
mg., dg. 6 g.
g., kg. 6 tonel.
g., ¡cg. 6 tonel.
g., ¡cg. 6 tonel.
Longitud del péptido
de medio a largo
de corto a medio
corto
largo y proteínas
Limitaciones de la
nmguna
ninguna
alguna
ninguna
Protecciones
global
parcial o global
Coste de sustratos y
muy caro
caro
generales
¡
secuencia
relativamente
barato
barato
reactivos
Condiciones de
ninguna
peligroso2
peligroso2
suave/no peligroso
suave
reacción
Racemtzaciones
Pureza3
algunas
algunas
ninguna
ninguna
muy elevada
elevada
media/elevada
baja/media
Estado de desarrollo
bien establecido
bien establecido
avanzado
comenzando
Aplicaciones
restringida a
muy empleada en
algunos usos
muy empleada
nvestgacíón
investigación e
industriales
en investigación
industria
Futuras perspectivas
e industria
debido a su
péptidos cortos o
Alimentos y
método ideal
elevado coste, se
medios de uso
productos
P~ péptidos
emplea para
farmacéutico con
farmacéuticos de
largos y
obtener productos
elevado valor
medio a alto valor,
proteínas
farmacéuticos de
atractiva para la
elevado valor
producción de
aditivos
alimentarios
1
Problenes en la unión de aminoácidos tales comaprolina e hadron~rolina.
%~ nstnraleza tóxica dejos reactivos enpleados tanto para lasprotecciones y desprotecciones
nx4todo sea pehÉroso para la salud.
~Rendimiento de la secuencie deseada.
39
hace que este
Introducción: Sintesis de pépudos
Numerosos son
los procesos de síntesis peptídica catalizados por a-quimotripsina como
demuestra la Tabla 8, en la cual se resumen algunos procesos catalizados por proteasas.
Tabla 8.- Ejemplos de síntesis de péptidos biologicamente activos, empleando proteasas
(122).
Péptido
Secuencia
Síntesis
Enzimas’
Aspartamo
Asp-Phe
Total
TI
Kiotoifina
Tyr-Arg
Total
a-CT
edulcorante de usina
Pbe-Lys
Total
a-CT
Péptido nutricional
Tyr-Trp-Val
Total
a-CT, Pa
y~MSH de bovino (9~12)2
His-Pbe-Arg.Trp
Total
a-CT, TI, Tr
y-MSH de bovino <l3~l6)2
Asp-Arg-Phe-Gly
Total
a-CT, CY, Tr
Leu-encefalina
Tyr-Gly-Gly.Phe-Leu
Total
a-a, Fa
2-D-Ala, 5-D-Leu-encefalina
Tyr-D-Ala-Gly-Pbe-D-Leu
Parcial
a-CT, TI
Dinorfina (1-8)
Tyr-Gly-CJly-Phe-Leu-Arg-Arg-Tle
Total
a-CT, Pa, Ir
Colecistoquinina (26-33)
FCE de ratón3
Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe
His-fle-Glu-Ser-Leu-Asp-Ser-Tyr-Thr-Cys
Parcial
Parcial
«-CI, Pa, TI
Cp, CY, Ir, VS
Antígeno de Hepatitis E
Arg-Tbr-Cys-Met-Thr-Tbr-Ala-Gln
Total
CY, Pa, Tr
(-Ala-Gly-Cys-Lys-Pbe-Pbe-Trp-Lys-Ibr.
Parcial
a-CT, TI, Tr
(122-129)
Somatostatina4
Phe-Thr-Ser-Cys-)
,4breiáatiras:
(4,. qwnropapaina; a-CT,
a’~quñwtn»sirm; Ct carboxipeptidasa Yciclica; Pa, papaína;
fl
termolisina; Tr, tripsina; V~ proteasa W.
2 Fragnrnto de la hornrna r-nrlanocito estimulante.
Fragnrnto del factor de crecimiento epicraneal de ratón.
Péptido cíclico unido a Ala-Cys.
Actualmente, muchos autores emplean dipéptidos modificados; como precursores de
productos cíclicos con interés terapéutico (con grupos funcionales o radicales que no aparecen
40
Introducción: Síntesis de péptidos
Tabla 9.- Potencia relativa de varios péptidos y derivados respecto a la Met-encefalína (126).
Estructura
Vaso deferente
IZ~2iCiIaZI
Tys-D-AIa-Gly-Phe-Leu
8.3
1.8
I-Tyr-D-AIa-Gly-Phe-Leu
0.6
0.5
0.02
0.2
Tyr-flAta-GIy-The-Met-NH2
3.8
7.7
Tyr-flMet-Oly-Plie-Lcu-OMe
2.9
0.06
Tyr-D-Met-CIy-Phe-Leu-NH2
3.6
2.7
Tyr-D-Met-GIy-P¶te-Pro~ NH2
0.9
0.02
N-Me-Tyr-D-AIa-Oly-The-Leu-NH2
6.4
0.01
N-Me-Tyr-Oly-Gly-Phe-Leu-N112
0.8
4.8
1
2-Tyr-D-Ala-GIy-Phe-Leu
Tyr-flAIs-CIy-~Phe-Met-NH,
8.6
Pero donde la sñitesis de péptidos
catalizada
por enzimas
resulta realmente
interesante
es en procesos de tipo convergente, en los que dos péptidos se unen para originar otro de
mayor tamaño, como muestra la Tabla 10.
Tabla 10.- Ejemplos de senisintesis y niodiflcación de proteínas empleando proteasas (122).
Péptido/proteina
Enzima’
Condensación/modificación
(1-19)-Ala
+
Ser-(22-124)
(6-48)-Lys
+
Gly-(S1-l49)
(1-37)-Mg
+
Lys-(40-104)
Su
Ribonucleasa A bovina
Nucleasa de estafilococo
Ir
Citocromo C equino
Cp
(I-133)-Arg
+
Ihr-(136-191)
Ir
Somatotropina humana
GIy-(B23-B30)
(Des-B23-H30)-Arg
+
Análogo de insulina humana
2)-(F-His”9) y (F-His’~’ 119>
(F-His’
(1-20)
(52-63)
Insulina humana
(B30-AIa)-insulina porcina a (E30-Tbr)- insulina
Ir
+
(21-51)
+
+
(64-76)
+
(77-97)
SI
(98-115) + (l16-124)~
Ap
humana
Hemoglobina-(Gly~142)
+
Hb-Argl4l) a Hb-Arg(141)-Gly-NH
2(142)
FRHC(1 -29)NR4
FRI4C(1-28)-A¡a a FRiHC(1-28)-Arg
42
Tr
cY
Introducción: Síntesis de péptidos
Abretiaturas: 4~,
proteasa de Acronnbacter; Cp, quinropapaína; carbo4oeptidasa Ycícica; SI,
subtiligasa; Su, subtilisina; Tr, trsipsina.
2 Ribonucleasa A con residuos de histidina reemplazados por 4-Iluor-histidina (F-Ilis).
Condensaciones lleva das a cabo desde C terminal a N terminal
Factor regulador de la hormona del crecimiento.
Finalmente, los recientes estudios basados en el conocimiento del centro activo de
muchos biocatalizadores, así como la aparición de nuevas moléculas, augura un prometedor
futuro a la catálisis con enzimas.
Dentro de esta lThea destacan los trabajos de B. W. Matthews y cols. (127), los cuales
han llevado a cabo síntesis de dos oligopéptidos cíclicos de 29 aminoácidos con actividad
catalftica semejante a la cx-quimotripsina o a la tripsina. Para ello, estos autores han
demostrado que basta con modificar 4 aminoácidos (Esquema 23).
N —~-
ChPepz
42
39 40 41
195 194 193 192 191 190 1S9
Cys.G&.phe~lIis.Phe~G1Y~Gly.Ser.Asp.GIy.MetG¡Y&r~erG¿Y
TrPepz
Tyr
58
ChPepz
Cys-
57
56 55
His- Ala- Ala
Gin
102
-
Gly
-
Mp
-
GIy
TrPepz
-
GIy
-
99
Ile-
Gly
Asp
215 214 213
.Trp-Ser- Val -GIy
La’
C —e—
Esquema 23.- Representación de oligopéptidos, con actividad similar a la cx-quimotripsina
(ChPepz) y a la tripsina (TrPepz) (127).
43
Introducción: Mntesis de péplidos
1.4.2.- MECANISMOS DE SÍNTESIS DE PÉPTIDOS
Durante los últimos años
han aparecido en la bibliografía muchos trabajos en los que
se demuestra que las proteasas, cuya misión in vivo es la hidrólisis de péptidos, pueden
utilizarse para catilizar el proceso inverso (sintesis de péptidos) (128-132). Esta metodología
tiene interés práctico en el caso de la síntesis convergente de péptidos (133) o bien si se
emplean aminoácidos funcionalizados, situaciones éstas en que la síntesis en fase sólida tipo
Merrifield (123) tiene severas limitaciones.
Actualmente se emplean numerosas proteasas en la síntesis de hormonas peptídicas
(134), neuropéptidos (135), edulcorantes tales como el aspartamo (136) y algunas otras
proteínas como las que se emplean en la semisíntesis de la insulina humana (122).
Las proteasas pueden catalizar la síntesis de péptidos por dos metodologías diferentes:
1) Síntesis cinéticamente controlada.
2) Síntesis termodinámicamente controlada.
Estos
dos procesos aparecen reflejados en la Figura 9.
n
I?~ Pr—X
+
Pf- F~—Y
+
1-420
-
-
III:
?
Pi—P1t ?Z~Y
+
H20
+
X—H
II
+
P1’ ~—Y
+
X—H
Figura 9.- Síntesis del péptido P~. .P~-P j...PIY por ambas metodologías: Síntesis
.
cinéticamente controlada <1+11+ lID y síntesis tennodinámicamente controlada (11).
44
Introducción: Síntesis de péptidos
El proceso cinéticamente controlado (1-111) intenta mimetizar a la naturaleza y requiere
la presencia de
un
donador de
acilo activado, generalmente
en forma de éster (péptido o
aminoácido), el cual transfiere un grupo acilo a otro sustrato que actúa como nucleófiio
(aminoácido o péptido)
(reacción 1). En esta reacción,
Compitiendo con esta reacción
está
la proteasa actúa como transferasa.
la hidrólisis del éster (reacción III). El péptido producto
también puede ser sustrato de la enzima y puede hidrolizarse (reacción II). El rendimiento total
de la
reacción
depende entonces de la relación entre las constantes aparentes de velocidad
transferásica e hidrolítica (k#kH).,,~,, y la velocidad con la que el producto es hidrolizado.
Cuando la
relación (kT/kp),~ es
elevada, el producto Pi.. P1-P
•
. .
.P-Y puede obtenerse con
altos rendimientos incluso a pesar de que los productos Pi... P1-OH y P1t..P1-Y sean los
termodinánúcamente estables. Es
por ello por lo que esta metodología se conoce también como
“modelo cinético” 6 de “no equilibrio”, y conduce a los máximos rendimientos en péptido a
cortos tiempos de reacción.
Esta formación de péptido en ausencia de equilibrio de concentraciones requiere de
sustratos activados; por el contrario, el proceso termodinámico se consigue por reacción directa
del ácido (molécula donadora de acilo, P~. ..P1-OH) y el nucleófilo (P7. . .P1-Y, reacción II).
En este caso la proteasa actúa como una verdadera “péptido sintetasa” deteniéndose el proceso
cuando se alcanza el equilibrio entre los moles de péptido sintetizados e hidrolizados; aunque
la enzima no interviene en el equilibrio. influye en la reacción aumentando la velocidad con
la cual éste se establece (flgi¡ra 9, reacción II).
Centrándonos en el proceso
cinéticamente
controlado, diremos que para que una
proteasa pueda utilizarse como catalizador de este proceso se necesita que la relación entre las
constantes de velocidad transferásica e hidrolítica (k1Jkp)~,, sea superior a 1000 (137). Estos
valores tan elevados son necesarios para
minimizar
la transferencia del grupo acilo a la
molécula de agua (hidrólisis), a bajas concentraciones de péptido (<10
3)•
Esto solamente
lo cumplen las proteasas que forman un intermedio covalente acil-enzima y por lo tanto, son
las que pueden ser usadas para catalizar una síntesis de péptidos cinéticaniente controlada.
45
)
Introducción: Sintesis de péptidos
1.4.2.1.- Síntesis cinéticamente controlada <S.C.C.
Existen dos mecanismos para las reacciones de condensación catalizadas por sennproteasas,
primero
los cuales han sido ampliamente estudiados por Riechman y Kasche (138-140). El
(Esquema 16-A) precisa la adsorción del nucleófilo (NR) en el centro
activo
antes
de que tenga lugar la formación del complejo acil-enzima (EA). Según este mecanismo, la
velocidad de síntesis de péptido será siempre proporcional a la concentración de nucleófilo que
actúa como reactivo y
En el
activador enzimático.
otro mecanismo <Esquema 16-B), la adsorción del nucleófilo tiene lugar una
vez
formado el complejo acil-enzima (EA) (141, 142). El producto de condensación deseado sólo
puede formarse a partir de este complejo ternario. Este mecanismo implica dos intermedios
reactivos enzima-sustrato (E-A y E(NH-A)) capaces ambos de reaccionar con el agua.
A)
HE
ffl
EH+ AB
NHj[ t<;
NH..EH
NH
Th-EH
EH..AB
E-A
+AN
H
201
EH
+
AOH
HE
blM
4
EH+ABsetEHAB~z:LE.A
E-A~~’
KN
1
r—EH+
A?’]
NI-I
H
20
EH~AOH
NH
EH+AOH
NH
Esquema 16.- Posibles mecanismos para la semisíntesis de péptidos catalizada por serinproteasas. Símbolos, EH, enzima; AB, donador de adío; ¡IB, grupo saliente, alcohol; E-A
acil-enzima; NR nucicófilo; AOH, producto de hidrólisis; AN producto de condensación;
KN, constante de equilibrio de unión del nucicéfilo al complejo acil-enzima y KS
constante de equilibrio de unión del nncleófllo a la enzima.
46
Introducción: Síntesis de péptidos
En
este tipo de mecanismos el redimiento viene controlado por tres factores:
a) Porcentaje de moléculas de enzima que tengan el nucleófilo adsorbido en el centro
activo. Dependen
de la afinidad de la enzima por el nucleóf;lo y de la concentración de este.
b) Posibilidad de que el nucícófilo sea capaz de superar al agua en su afinidad por el
complejo acil-enzima
c) Velocidad de hidrólisis del péptido formado, pues en este tipo de síntesis los
rendimientos
máximos
son
transitorios,
ya que los productos
formados
son
termodinámicamente inestables.
Por tanto, los máximos rendimientos se conseguirán cuando la relación de las
constantes aparentes
de velocidad transferásica/hidrolítica (kYkH)~, sea lo más alta posible y
cuanto menor sea la velocidad de hidrólisis del péptido formado. Las variables que influyen
en la interacción enzíma-sustrato deben jugar un papel fundamental en el curso de la reacción
y en el rendimiento del producto de síntesis.
Según el valor relativo de la velocidad de síntesis (Vb) y de hidrólisis del péptido
formado tenemos dos interacciones extremas:
1) Cuando la velocidad de síntesis (V>~) es similar a la velocidad de hidrólisis del
péptido formado.
La expresión
[ANJ,,,~=
que nos da el máximo rendimiento en péptido [AN]~para este caso sena:
(k#kHtPPx[NH]
x (k~01/k»JAB~AJH[AB]
[~J2O]+(k#kH) x [NR] (k/k)Á]~TwH
13]
Donde [NR]es la concentración de nucleáfilo y [AB]es la concentración de donador
de acilo.
La expresión [3] se puede simplificar pan este caso 1) de la siguiente manera [4]:
141
[ANL»¿ra<px[AB]x[NII]
Donde a depende de (k~k~J~ y de la constante de equilibrio de unión del nucleáfilo
(NH) al complejo
acil-enzima (KN),
f3 depende de
las propiedades del donador de acilo
activado, y de la concentración de producto final en presencia del nucleófilo. El valor de
(kT/kH).W
puede determinarse a partir del cociente de velocidades transferásica (VAN) e
47
Introducción: Síntesis de péptidos
hidrolítica
(VAOH)
[5]:
y
AN(T)
k
AOl]
><
«vp~
¡51
[NR]
[RO]
El análisis de estas ecuaciones (143, 144) ha permitido definir una constante “p” que
nos proporciona una medida de la máxima cantidad de péptido que se puede obtener en un
proceso cinéticamente controlado catalizado por una transferasa en presencia de un nucleófilo,
y que también equivale a la cantidad de nucleófilo a la cual la velocidad de síntesis
(VAN)
se
iguala con la de hidrólisis (VAoh).
k
V
[6j
p=(2)41-120]zz.-JÉL{x[NH]
II
¿VV
Este parametro también representa la concentración de nucleófilo a la cual ambas
velocidades se igualan (145).
Ejemplos típicos son los procesos de acilación de 6-APA y 7-ACA catalizados por
penicilin G acilasa (146) ola acilación de hidratos de carbono (142).
II) Cuando la velocidad de síntesis (VA) es mucho mayor que la de hidrólisis del
péptido formado. Esto sucede en la síntesis de péptidos (138, 141,147), con ésteres como
donadores de acilo activados y con proteasas de una relación de constantes de velocidad
(k#k12)~, elevada. Para [NII]0(concentración inicial de nucleáfilo) >> [AN]~, el contenido
de nucleófilo y la relación (k#kH),~, son practicamente constantes durante la síntesis. Por lo
tanto
la expresión para [ANjI~ se
transforma
en:
[AB]0~[Nh90
[AN]=
¡7]
[1120]x(k#kH) +[NJ-J]0
A diferencia de lo que sucede en el primer caso, el rendimiento máximo no depende
de <3 (Ecuación [4]). En ambos casos el rendimiento máximo no depende de la cantidad de
enzima añadida, la cual sólo influye en el tiempo requerido para alca.zar el máximo de
conversión (137, 139).
48
Introducción: Síntesis de péptidos
componente menos.
En la bibliografía hay pocos estudios sistemáticos sobre esta estrategia (137,148, 149).
De forma simple, el esquema de esta aproximación sintética puede ser representado de la
siguiente forma:
cx-CT
1
——
+
-.
~1—Ñ-—;j+ft+
H20
1
II
Esquema 17.- Mecanismo de la Síntesis Termodinánjicamente Controlada
Podemos observar que tan sólo las formas no jónicas del ácido (AOH) y el nucleáfilo
(NR) están implicadas en la reacción de síntesis. Como ya hemos comentado, la enzima no
influye en el rendimiento obtenido, si no que este es función de la constante de equilibrio
termodinámico, K,-. La enzima, por tanto, sólo disminuye el tiempo necesario para alcanzar
el equilibrio
Evidentemente, el agua es un componente no deseado si se pretende desplazar el
equilibrio en el sentido de la síntesis. Es por ello por lo que se suele trabajar a bajas
concentraciones de agua en el medio:
[AA!]
a
LS’
[A01-1] x [NR]
donde:
AN
=
AOH
NR
RCONHR’
=
RCOOH
H2N-R’
50
Introducción: Síntesis de péptidos
De esta forma, la constante de equilibrio termodinámico deberá englobar un término
dependiente de la concentración de agua, a.~.
A partir de esta ecuación, la concentración de péptido en el equilibrio puede ser
también representada como una función de la concentración total del ácido y amina, tal y como
indica la ecuación [9]:
[AN]KrXK>,.1,-¡cii [AOJ-flx[NJ-J]
[9j
[1120]
donde el rendimiento final es función de K,»~.,, que es la razón entre el producto de las
concentraciones de las formas no ionizadas de nucleófilo [N?HJy de donador de acilo [AOH]
en el equilibrio y el producto de las concentraciones totales del ácido y la amina.
Evidentemente, la proporción relativa de las formas ionizadas y sin ionizar depende del pH,
de la constante dieléctrica del medio, etc. Por ello, el rendimiento dependerá del pH, de los
pKs de los grupos amino y ácido, de la fuerza iónica, de la naturaleza del tampón, de la
temperatura, del disolvente y de la cantidad de agua presente en la reacción.
1.4.3.- FACTORES DIJE INFLUYEN EN EL RENDIMIENTO DE LA
SÍNTESIS ENZIMÁTICA DE UN ENLACE PEPTÍDTCO
1.4.3.1.- Imr~ortancia del pH
1> Síntesis termodinámicamente controlada
A la vista de la ecuación [9], los rendimientos máximos se conseguirán para un valor
de pH comprendido entre el pKa del ácido y el pKa del nucleófilo. El valor máximo de IQ~,,
se alcanza cuando la diferencia de pKs entre el grupo amino y el ácido es mínima <Esquema
18):
51
Introducción:
Síntesis de ~p¡idos
Una forma de disminuir la diferencia de pKa entre los dos sustratos consiste en proteger
tanto el amino del aminoácido que actúa de donador de acilo como el carboxilo del aminoácido
que actúa de nucleófllo, utilizando para tal protección grupos hidrofóbicos y apolares. De esta
forma se disminuye la influencia mutua de los grupos amino y ácido a través del efecto
inductivo. La forma más común es acetilar el grupo amino lo que se traduce en un aumento
del piCa del ácido, y amidificar el grupo carboxílico, lo cual disminuye la basicidad del grupo
amino.
o
Fi
H~N—RgCO
kA
kB
o
o
II
ji
HtJ—RfC—OH
kD
o
¿e
II
H3~N—RgCOH
Esquema 18.- Equilibrio entre las formas iónicas y no iónicas de los sustratos
El ejemplo más clásico es el caso de la glicina (Tabla 4):
Tabla 4.- Variación de los piCa, empleando grupos protectores y disolventes (150).
Aminoácidos
pKa (ácido)
pKa (amino)
ApKa
Glicina
2.35
9.8
7.4
N-Acetil-glicina/H20
3.6
8.2
4.6
N-Acctil-glicina ei (80% DMSO)
6.9
8.1
1.2
52
Introducción: Síntesis de péptidos
Por otro lado, la introducción de estructuras apolares en la molécula favorece su
solubilidad en medios orgánico-acuosos, los cuales, al tener una constante dieléctrica menor
que el agua, desfavorecen la ionización de -COOH y -NH2, aumentándose los (pKa)a~ de
ambos grupos, tal y como se indica en la Tabla 4 para la glicina en un medio con un 80% de
DMSO (151).
Según el disolvente sea ono miscible en agua hay que diferenciar: S.T.C. en sistemas
monofásicos (152, 153) y S.T.C. en sistemas bifásicos con bajo contenido en agua (154-156)
cuyas peculiaridades comentaremos al hablar del papel de los disolventes en el proceso.
b) Síntesis cinéticamente controlada
En este tipo de reacciones, el donador de acilo generalmente tiene el grupo carboxilo
activado en forma de éster, y su grupo amino está protegido (benzoilado, acetilado, etc.) y el
nucleófllo presenta su grupo carboxilo bloqueado en forma de amida, por tanto, sólo el grupo
amino del nucleófllo es el que nos va a condicionar el pH óptimo de trabajo, el cual debe ser
superior al pKa del grupo amino de nucleófilo (157); no obstante, no interesa que el pH sea
demasiado elevado ya que se incrementa la concentración de grupos 0H, los cuales compiten
con el grupo amino del nucleófllo por el complejo acil-enzima causando un descenso en la
relación (k]k,~J~,, con lo cual disminuye el rendimiento final en péptido.
Así, algunos de los factores que habrá que tener en cuenta a la hora de diseñar ensayos
de este tipo serían: la naturaleza de los sustratos, la enzima empleada, (ya que muchas se
desnaturalizan a pHs elevados, p.e. penicilin amidasa), y la naturaleza de las especies del
tampón (p. e., el Tris puede actuar como nucicéfilo compitiendo con el aminoácido cuando
el pH es superior a 8 (149, 158), aunque por el contrario, otros autores como Mattiasson y cris
han conseguido muy buenos resultados con esta base (159)). Para concluir, podemos afirmar
que el pH ideal para este tipo de reacciones está comprendido entre 8-10.
1.4.3.2.- Influencia de la temperatura
a~ Síntesis termodinámicamente controlada
53
Introducción: Síntesis de péptidos
Teniendo en cuenta que la reacción entre aminoácidos no cargados para la formación
de un enlace peptídico es endotérmica (143) podríamos afirmar que al aumentar la temperatura
se elevaría el rendimiento. No obstante, debemos tener en cuenta en este planteamiento teórico
que muchos catalizadores se desnaturalizan cuando incrementamos la temperatura; por lo tanto,
no podemos generalizar ni extrapolar de un sistema a otro.
b~ Síntesis cinéticamente controlada
No existen muchos trabajos al respecto (137, 160), aunque algunos autores afirman que
la temperatura óptima es inferior a 20 0C (139), Mattiasson y cois (161, 162), han descrito un
aumento en el rendimiento en péptido debido a un aumento en la relación (k
1/kfi4,,, debido
a un acusado descenso de k.~ aparente, cuando se trabaja a temperaturas inferiores a O
0C. De
igual forma Ullmann y cois. (163) también describen recientemente la síntesis de di y
tripéptidos empleando a-quimotripsina, tripsina o papaína en sistemas a O 0C, obteniéndose
éstos con altos rendimientos, y con una minimízación en los problemas derivados de los
procesos de aislamiento y purificación. Sin embargo otros autores aseguran que un incremento
en la temperatura también causa un aumento en el rendimiento en péptido al incrementarse kT.
1.4.3.3.- Influencia de la fuerza jónica
a) Síntesis termodinámicamente controlada
Un aumento de la fuerza iónica estabilizaría los iones libres, causando un descenso en
la constante de equilibrio kT, al desestabilizar las formas no ionizadas, que son las reactivas.
Se ha observado que el pKa del grupo carboxilo desciende mientras que el del grupo amino
se mantiene constante o aumenta con la fuerza iónica, lo cual dificulta el proceso al aumentar
el ApKa. En el caso de productos solubles en H
20 obtenidos por condensación, incrementando
la fuerzajónica disminuimos el rendimiento final, ya que el péptido obtenido es más dificil de
aislar y purificar.
54
Introducción: Síntesis de péptidos
ti) Síntesis cinéticamente controlada
En todos los casos, la fuerza iónica influye en la unión del nucleófilo al centro activo
de la enzima, el cual puede estar cargado, por lo que, cuando las cargas implicadas sean
opuestas, un aumento en la fuerza iónica estabilizaría estas, disminuyendo la atracción entre
el nucleófilo y el centro activo y por lo tanto el rendimiento (137). En cambio, si las cargas
que presentan el nucleófilo y el subsitio de unión al centro activo son iguales (como sucede en
la síntesis de péptídos) un aumento en la fuerza jónica causaría un incremento en el
rendimiento final a péptido.
1.4.3.4.-Influencia del disolvente
De todos los parámetros que caracterizan a un disolvente orgánico: coeficiente de
solubilidad de Rildebrand (8), la constante dieléctrica
(E),
el momento dipolar
(bt)
o el
coeficiente de partición P (en el sistema n-octanol/agua), etc., éste último es el que ejerce una
mayor influencia en la actividad catalítica de la enzima (1 64). Así, se ha podido comprobar
como la actividad enzimática es baja en disolventes con un logP <2, moderada si 2< logP
<4, y alta si el logP >4. Aquellos disolventes con un logP mayor de 4, no alteran Ja capa
ck agua esencial situada alrededor del biocatalizador, con lo que este permanece activo. Por
el contrario, estos disolventes con elevado coeficiente de partición reducen notoriamente la
solubilidad de muchos de los sustratos, por lo que su empleo en reacciones biocatalíticas rio
se puede generalizar.
La naturaleza del disolvente orgánico afecta a la estabilidad y actividad enzimática por
tres vías:
a) Inhibiendo o inactivando la enzima, por interacción directa con ella, ya que el
disolvente orgánico puede distorsionar los puentes de hidrógeno y las interacciones hidrófobas
que mantienen la estructura proteica, provocando una disminución de su actividad y estabilidad
(165).
b) Los disolventes orgánicos pueden interaccionar con sustratos o con productos de la
reacción. Por ejemplo, el cloroformo provoca una significativa disminución de la actividad
55
introducción: Sintesis de péptidos
catalítica de la peroxidasa durante la reacción de oxidación de fenoles (166).
c) El disolvente orgánico puede interaccionar con el agua esencial que rodea a las
enzimas, provocando la alteraéión de su conformación activa. Como comentamos
anteriormente la interacción entre el disolvente y el agua esencial de la enzima es directamente
proporcional a la polaridad del disolvente. Así, los disolventes de mayor logP son los que
menos afectan a la actividad de las enzimas (167).
a~ Síntesis termodinámicamente controlada
En general se ha observado que la presencia de disolventes orgánicos disminuyen las
constantes de disociación, aumentando la constante de equilibrio y por lo tanto también el
rendimiento final en péptido (137, 168).
b~ Síntesis cinéticamente controlada
En un principio, el empleo de disolventes hidrófilos en medios con una cierta cantidad
de agua reduciría las reacciones de hidrólisis aumentando el rendimiento final en péptido, por
lo que la adición de disolventes con un logP bajo mejoraría la síntesis del péptido (como
sucede para el caso 1), empleando DMF (160,169,170)). Por otro lado, el catalizador necesita
de una pequeña cantidad de agua para realizar su actividad (monocapa de hidratación), de
manen que si ésta es capturada por el disolvente o por el soporte (en caso de que la proteína
esté inmovilizada), no se observaría reacción; en consonancia con estas afirmaciones, Reslow
y cris, definieron el concepto de acuofilia del cual, hablaremos más ampliamente en otro
apartado. Así, numerosos autores han llevado a cabo ensayos en los que se mide la actividad
de agua óptima para cada reacci6n biocatalltica (171-173).
Con respecto a la naturaleza del disolvente conviene comentar que los disolventes de
mayor logP son los menos peijudiciales para la enzima (174). Por otro lado, no parece
recomendable el empleo de alcoholes como disolventes debido a la aparición reacciones de
transesterificación (158, 175).
56
.
Introducción: Síntesis de péptidos
¡.4.3.4.1.- Influencia de la naturaleza del disolvente
Centrándonos ahora en el caso de la resoluci6n de ésteres (W paso de la síntesis
cineticamente controlada) diremos que ésta es sensible a la naturaleza del disolvente, en
especial en el caso de trabajar con disolventes hidroxílicos o inmiscibles con agua, tal y como
se ve en la Tabla 5, para el caso de la resolución del éster racémico de la tirosina (175).
De la Tabla 5 se deduce que hay que emplear disolventes apróticos (acetonitrilo,
acetona, etc.), en vez de alcoholes o DMF, que interaccionan con la proteína o conducen a
procesos de interesterificación.
1.4.3.5.- Importancia del agua en las reacciones biocatalizadas en un medio
a
Si bien las reacciones catalizadas por enzimas se comenzaron a estudiar en agua, cada
se ha impuesto de forma progresiva el empleo de medios orgánicos ligeramente hidratados.
Ello se debe a que las enzimas en estos disolventes miscibles en agua son menos sensibles a
la desactivación que en medios acuosos. Esto se ha explicado porque la enzima está
cineticamente atrapada en su estado nativo y activo, en parte debido a la baja constante
dieléctrica del medio, potenciandose así las uniones electrostáticas que rigidifican la molécula
(176), como se ha comprobado por medidas de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) (177).
Otra propiedad que se ve muy afectada es la especificidad del biocatalizador
(164b,. 178). En esta línea se ha descrito la alteración de la especificidad por sustrato en la
metanolisis y en la hidrólisis de aminoácidos N-sustituidos, catalizada por a-quimotripsina, en
la arninolisis de ésteres catalizada por subtilisina en diferentes medios (179), etc. Este hecho
se ha atribuido a la variación de la relación kJKr (164b), por efecto de la solvatación del
biocatalizador, de los reactivos y del complejo adil-enzima.
Asimismo, Klibanov y cois han descrito la variación de la enantioselectividad de la
subtilisina <alsbergen la síntesis de péptidos con Ly D aminoácidos (180, 181). Estos efectos
se explican en la misma línea del razonamiento anterior, ya que ambos enantióneros se
solvatan de forma diferente según la geometría del disolvente. En este sentido Arroyo y
57
Introducción: Síntesis de péptidos
Sinisterra (182) han demostrado como el disolvente afecta a la resolución de (R,~ ketoprofeno
vía esterificación enantioselectiva catalizada por la lipasa de U antartica al emplear (+) ó (-)
carvona como disolvente.
Tabla 5.- Resolución del éster etílico de la (D,L)-tirosina (50 mM), empleando cz-quimotripsina (10 MM),
disolvente/agua (9/1),volmnen total= 20 mi, Tzz3O oc <íis>.
Radímiesto
e.e.I%
E
Metanol
O
--
--
Etanol
34
96
80
1-Propanol
46
89
39
2-Propanol
1 -Butanol
2-Metii-i-propanol
2-E utanol
41
85
22
20
95
49
13
>99
>230
42
96
102
2-Metil-2-propanol
1-pentanol
3-Metil-1-butanol
39
38
41
83
18
93
49
92
46
2-Metil-2-butanol
41
82
18
Tetrahidrofurano
49
>99
1.4-Dioxano
49
95
126
Acetonitriio
48
>99
>646
Acetona
50
>99
>1060
DMFS
32
92
37
DMAb
41
>99
>412
Disolvaite
>
752
“50% deepis.
La presencia del agua es fundamental en la actividad catalítica de las enzimas, ya que
ayuda a mantener la conformación activa mediante interacciones de tipo no covalente,
interacciones no eléctrostáticas, enlaces de hidrógeno y fuerzas de Van der Waals (183). Al
sustituir el agua por un disolvente orgánico se produce, en principio, una distorsión de la
estructura proteica con la consiguiente pérdida de actividad enzimática. De hecho ninguna
enzima sería capaz de mantenerse activa en un disolvente totalmente anhidro si no fuera por
58
Introducción: Síntesis de péptidos
la presencia de una mínima cantidad de agua. De esta forma, una enzima en un medio orgánico
se puede mantener completamente hidratada y activa mediante la adición de un pequeño
volumen de agua, el cual previene la posible alteración que pueda provocar el medio orgánico
de reacción en el microentomo de la proteína. En este principio se basa la catálisis enzimática
en medios practicamente anhidros, tema que ha merecido el interés de muchos investigadores
y la organización de varios congresos internacionales (184).
Es obvio que la presencia de agua es necesaria para la catálisis enzimática; lo que no
parece tan claro es la cantidad mínima que requiere una enzima para mantenerse activa. Por
ejemplo son suficientes únicamente 50 moléculas de agua por una de enzima para que la aquimotripsina sea activa en octano (185). En el caso de otras enzimas hidrolíticas como la
sublilisina o lipasas también es necesaria una cantidad mínima de agua (186-188). Pero para
otras enzimas es fundamental un gran nivel de hidratación; como ejemplos nos encontramos
la peroxidasa de rábano que dobla su actividad con un 0.25 %
(y/y)
de tampón en tolueno
respecto a un 0.025 % (189); y la polifenol oxidasa, que necesita aproximadamente un 0.5 %
(y/y) de agua (3.5 >< lO~ moléculas de agua por molécula de enzima) para ser activa en
cloroformo (190). Entre el primer caso y este último existe una gran variación en cuanto a la
cantidad de agua presente en el medio necesaria para la actividad de las enzimas mencionadas.
Por tanto, esta magnitud no es del todo satisfactoria para controlar la actividad de la enzima
en medios orgánicos ligeramente hidratados. Un método más correcto es relacionar la actividad
catalítica con la cantidad de agua disponible por la enzima en un disolvente orgánico. De aquí
surge la necesidad de recurrir al concepto de actividad de agua (a), que parece ser el
parámetro que mejor describe la distribución del agua en sistemas multifásicos (191).
1.4.3.5.1.- Actividad de agua: definición.
Si suponemos un sistema cerrado en el que una fase gaseosa húmeda se encuentra en
equilibrio con una fase líquida, también húmeda, podemos definir la actividad de agua (a.~) de
la fase líquida a una temperatura dada como [10]:
59
Introducción: Síntesis de péptidos
¡10]
___
wjt
donde 4 es la fugacidad del agua de la mezcla a la temperatura de equilibrio, y £
es la
fugacidad del agua pura a la misma temperatura.
Si la concentración del agua en el sistema es pequeña (como sucede en los procesos
biocataJizados en medios orgánicos ligeramente hidratados) y se trabaja a bajas presiones (p.
e. a presión ambiental a 1 atm), se puede suponer que el vapor de agua se comporta como un
gas ideal, y podemos sustituir la fugacidad por la presión de vapor [11]:
aw
1k
[11]
o
12~
La presión de vapor del agua pura en estas condiciones se considera igual a la unidad.
La ecuación transformada y expresada en tanto por ciento se define como Humedad
Relatiha en Equilibrio (HRiE) 1121.
[12]
HREzp~xl0Oza~xlOO
1.4.3.5.2.- Isotermas de adsorción
En la práctica la actividad de agua (a.~) se determina introduciendo la muestra en una
cámara de medida cerrada, a temperatura constante y con un volumen lo más pequeño posible.
Pasado un tiempo, se alcanza el equilibrio entre la húmedad del aire de la cámara y la de la
muestra. Esta húmedad relativa del aire en la cámara de medida corresponde a P,~ y si
consideramos P%=l obtenemos el valor de a~ a partir de [11].
La forma más común de representar estos datos, es una curva que nos de la variación
de la cantidad de agua añadida (g. de agualg. de muestra) frente a la a~. Según las medidas
sean efectuadas durante la deshidratación de la muestra desorción o en el curso de la
rehidratación de la misma adsorción o resorción) se obtendrán dos curvas, que no tienen
porqué coincidir (fenómeno de histéresis).
60
Introducción: Síntesis de péptidos
Una isoterma de adsorción se divide en tres zonas:
o
e
e
o
025
o~
Acti~tidad de agn (Aw)
015
FIgura 11.- Isoterma teórica de adsorción-desorción
ZQnaJ. El agua presente en esta zona de la isoterma es el agua más fuertemente unida
y más inmóvil, por lo que para el caso de las proteínas correspondería al agua de
cristalización. Este agua está unida a zonas polares de la proteína por interacciones agua-ión
o agua-dipolo. La entalpía de vaporización de este agua es mucho mayor que la del agua pura
y no puede congelarse a 400C. El límite de las zonas 1 y II corresponde al contenido de
-
humedad “monocapa”. Por “monocapa” se entiende no la cobertura de toda la materia seca por
una capa simple de moléculas de agua densamente empaquetadas, sino que se trata de la
cantidad de agua necesaria para formar una simple capa de moléculas de agua “monocapa”
sobre los grupos altamente polares de la materia seca.
Zona II. El agua añadida en la zona II ocupa los restantes sitios de la primera capa y
varias capas adicionales (agua en multicapa>. La entalpía de vaporización del agua en
mulúcapa es ligera o moderadamente mayor que la del agua pum.
61
Introducción: Síntesis de péptídos
ZQIItIII. El agua de la zona III es la que menos fuertemente ligada y más móvil
(molecularmente) y se denomina “agua de la fase masiva’. Tiene una entalpía de vaporización
igual que la del agua pura, por lo que se trata de agua congelable.
¡.4.3.5.3.- Competencia por el agua en un sistema biocatalítico
La disponibilidad del agua alrededor de las moléculas activas de enzima depende de la
presencia de elementos en el sistema que pueden competir por el agua, según sea su afinidad
por la misma, tales como: los disolventes orgánicos, los reactivos, los aditivos y los soportes.
1) Th,giymn~: los disolventes compiten con la enzima por el agua. Según su polaridad,
estos disolventes podrán solubilizar mayor (polares) o menor (apoZares) cantidad de agua, y
todo ello redundará en la actividad catalítica de la enzima. Esta capacidad de captación de agua
por parte del disolvente se verá reflejada en su isoterma de adsorción. Peter Halling pudo
comprobar la similitud de las isotermas de las proteínas en aire y en disolventes de diferente
polaridad hasta un valor de ~ proximo a 0.5 (192). De este descubrimiento se deduce que el
disolvente no influye en el agua fuertemente ligada a la enzima, la cual suele corresponder con
el agua que queda después de la liofilización.
2) Reactivos: la naturaleza y la concentración de los sustratos pueden alterar la
distribución del agua en el sistema. Una concentración elevada de alcohol (193) o de ácido
(194) en una reacción de esterificación catalizada por enzimas puede provocar una disminución
drástica de la actividad enzimítica debido al aumento de la capacidad de la fase orgánica para
solubilizar agua, y por lo tanto de sustraería del biocatalizador. Se pueden fijar unas
condiciones óptimas de a.~ en el medio que permitan compatibilizar una elevada concentración
de reactivos con una actividad enzimática interesante.
3) MÉÍXQS: las sales pueden competir por el agua con la enzima (195). De la misma
forma los azúcares presentes en muchos preparados comerciales de enzimas son capaces de
captar agua (171, 1%, 197), por lo que algunos autores han observado desplazamientos de las
62
Introducción: Síntesis de péptídos
curvas de adsorción de agua empleando sorbitol como aditivo (171). Compuestos similares al
agua (glicerol y glicoles (198), la N,N-dinietilformamida (199) y el dimetilsulfóxido (200))
son capaces de alterar la actividad enzimática. La adición de estos compuestos produce un
incremento en la actividad de muchos biocatalizadores en medios orgánicos con a~ baja, pues
actúan como miméticos del agua.
4) SQ~rt~s: Reslow demostró claramente en 1988 como la naturaleza del material que
soportaba la enzima inmovilizada era capaz de influir en la actividad catalítica (201). La causa
de este comportamiento era la ac’uoLila del soporte, definida como la capacidad de éste de
retener agua en un sistema que emplea como disolvente orgánico diisopropiléter. Estudios
análogos (194, 202) demostraron que los soportes hidrofóbicos favorecen la actividad catalítica
frente a los soportes de tipo hidrofílico. De todas formas, ni la capacidad del soporte para
adsorber agua, ni su contenido en agua pueden pronosticar una actividad determinada en una
reacción biocatalizada.
En el equilibrio, la a~ será la misma en todas las fases del sistema, incluyendo el
soporte donde la enzima se encuentra inmovilizada. Controlando el valor de a.~ del sistema,
se ha podido comprobar que el perfil actividad enzimática}a~ es prácticamente el mismo en la
mayoría de los soportes empleados (203-206).
1.4.3.5.4.- Influencia de la cantidad de agua en la resolución de mezclas
racénilcas.
La cantidad de agua presente en la reacción para la resolución enantioselectiva del éster
etílico de la (D,L)-tirosina, catalizada por a-quimotripsina resultó ser fundamental para
diferentes disolventes como se refleja en la Figura 12 (175):
Los rendimientos obtenidos difieren de un disolvente a otro, según aumenta la cantidad
de agua, pero el exceso enantiomérico sigue el mismo comportamiento en todos los
disolventes, disminuyendo cuando el porcentaje de agua presente en la reacción es elevado,
aunque el rendimiento sea muy alto, debido a una hidrólisis química indiscriminada de ambos
esteroisómeros, frente a una hidrólisis enzimática mucho más selectiva hacia el isómero L Esta
63
Intrcducción:SíntesisdepépLidos
tiene lugar con menores porcentajes de agua, y controlada por ciertos residuos del centro
activo, variando la enantiopreferencia de los catalizadores enzimáticos.
so
—•0 — loo
¶00
50
•0
t 40
60
30
t
‘E
a
e
O
•0
40
40
10
20
20
o
0
o
‘E
20
W.t.r COnteol /%
F,. 2. Resoluúoo of oc-eyrohinc e.byl ester o
~4ik-sqsrous
pbo.phate buffet (0.1 M pH 8.0).
~.Tyroui,e etb$ t.c 50 mM.
lo siM, )Oc. 24
• teW.
Re.olueios of bt4ytostne ettsyt ester ít n.o.
,iuiIe-neer. ot.TyTouise ethyl este, 50 mM, a to
U.
~M.30’C.24h.
a
O:te:•:yieId.
£00.
loo
0
50
1
ql
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st •0
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20
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20
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SO
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W.t.r ConttnI
~00
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50
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Coóteto~ 1%
Rs. & RncIuiic. of ot4yrouinc ctbyl roer
1%
wst~
Resoluojon oS r..Ayrouíne c.byl ate’ ir. TIfFoelyrozine e’hyl ester 50 mM. fl
siM.
3O’C. 24 ti. 0: <cg •: yicld.
Fig. 3.
¡o
we’er.
mm ¡.4
6.fne—w.ur. m..Tyrnioc eibyl ester 50 mM. CI
Io$M.JrC.24h O:e.e,;•:yñLd.
toe
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1
6
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30
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120
1
0
20
40
40
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Waler Conlení 1%
Water Contení It
55. S. si.e,t¶,jiion of OL.iyrosIne eibyl cneri ti
.tef. o.-Tyros¡ne eÉtwt ester SO ,TIM. CI JO t~M.
30C. 24 5,.
Oce;•
F~
•.
ResoIsíjos 0< vt-tyro.’nc e’byI e.íeí ir. DMAm-Tyronne
este, ‘OmM CO 0 pM.
n’elAh ~s •. •• -0,114
,diI.
cil,yI
Figura 12.- Importancia del porcentaje de agua en la hidrólisis del éster de la (D,,L>tirosina, empleando diferentes disolventes orgánicos, tomada del artículo (175).
64
introducción: Síntesis de péptidos
1.4.4.- ASPECTOS EXPERIMENTALES DE LA SÍNTESIS DE PÉPTIDOS
CATALIZADA POR ENZIMAS
1.4.4.1.- Las enzimas: pureza y purificación
Generalmente los preparados comerciales de proteasas son impuros, ya que pueden
contener diferentes formas de una misma proteasa (a y (3-tripsina) y/u otras proteasas
impurificando la preparación. En el primer caso, en el que existan varias formas de la misma
enzima, estas influyen en e] rendimiento del proceso cinéticamente controlado. Asimismo, la
presencia de otras proteasas puede originar reacciones de hidrólisis indeseables, tanto para los
reactivos como para los productos. Por lo tanto, es fundamental en los procesos de control
cinético, el trabajar con proteasas puras a fin de lograr una buena reproductibilidad.
El isoelectoenfoque sería un método rápido que conviene realizar para visualizar la
pureza de la proteasa (207, 208), si bien no se han de descartar ensayos de contenido proteico
y test de actividad esterá.sica
1.4.4.2.- inmovilización de enzimas
La inmovilización de enzimas tiene como objetivo lograr biocatalizadores estables,
reutilizables y fáciles de manejar. Existen varias metodologías que se pueden agrupar en tres
tipos:
a) Unión a un soporte (de forma covalente, por fuerzas electrostáticas o por adsorción
física).
i» Reticulado usando reactivos bi o polifuncionales.
c) Atrapamiento en matrices, microcápsulas, liposamas, micelas reversas, etc.
En el caso de la a-quimotripsina se han descrito diversas metodologías de
inmovilización y sería prolijo detallar todas. Entre las más interesantes citaremos la
inmovilización sobre geles de agarosa activados con grupos formilo (209), agarosa activada
con grupos amino (210), f3-ciclodextrinas (211), polimetacrilatos (212), copolimeros de
estireno (213).
65
Introducción: Síntesis de péptidos
y con un mayor o menor caracter apolar, el cual beneficia o dificulta, junto con el tamaño de
poro, el acceso de los sustratos al centro catalítico según la polaridad de estos, como podemos
observar en la Tabla 6:
Tabla 6.- Efecto del gel en la oxidación de esteroides y en el coeficiente de reparto entre el gel y el disolvente
(220).
Entradas
(leí
Colesterol
Dehidroepiandrosterona
Aa. Re!. (%>‘
ph
Mt. Reí. (%) •
ENTP-2000
102
2.00
lOS
2
ENT-4000 : ENTP-2000 (15: 85)
97
1.58
NA
3
ENT-4000: ENTP-2000 (30:70>
86
1.13
NA
N.A
4
ENT-4000: ENTP-2000 QO:30)
0
0.16
N.A
N.A
5
ENT-4000 : ENTP-2000 (85 : 15)
0
0.06
N.A
N.A
6
ENT-4000
0
0.02
77
0.31
7
PU-3
75
0.63
107
1.67
8
T’iJ-3 : 145-6 (75 :25)
24
0.24
96
1.48
9
PU-3 : PU.6 (50: 50)
0
0.02
88
1.16
10
PIJ-3 : PU-6 (25:75)
0
0.03
73
0,48
it
141-6
0
0.01
70
0.30
N.A.~ Pt
p
2.36
2118 ¡izado
Actividad reíati,a del biacatalrrador ,nmcvilizado con aspecto a las células libres cApresada en porcentaje (ennhe libre
=
100%).
Coeficiente de partición de colesterol o dehidroepiandrostercna entre el gel yel disolvente
En esta tabla podemos observar como el coeficiente de partición de los reactivos entre
el gel y el disolvente es fundamental para la actividad del catalizador. Así, los biocatalizadores
inmovilizados en geles con menor coeficiente de partición son los que presentan peores
actividades, (entradas 4, 5, 6, 9, 10 y 11), tanto para el colesterol como para la
dehidroepiandrosterona, presentando esta segunda mayor valor de actividad relativa que el
primero, al igual que sucede con su coeficiente de partición.
68
Introducción: Síntesis depéptidos
En una S.T.C, conviene emplear aminoácidos que tengan protegidos los grupos
funcionales que no van a estar implicados en la reacción. No obstante, dada la
quimioselectividad de las proteasas, no se han de proteger los grupos de las cadenas laterales.
La situación resulta algo más complicada en el caso de la S.C.C, ya que el donador de
acilo además de tener bloqueado el grupo amino (en forma de amida) también precisa que el
grupo carboxilo esté activado como éster.
Con respecto a los tampones, como ya hemos comentado anteriormente, no parece
influir demasiado su naturaleza.
70
II.- OBJETIVOS YPLÁNDE TR4BJ4JO
Objetivos y plan de trabajo
II.- OB.IETIVOS Y PLAN DE TRABAJO
De lo indicado en el apartado anterior, se deduce que la búsqueda de nuevos derivados
de enzimas, y en especial de «-quimotripsina, es un tema de interés en Biotecnología por las
muchas aplicaciones sintéticas que posee. En esta línea se han desarrollado por miembros de
nuestro grupo derivados modificados químicamente de «-quimotripsina, o inmovilizados sobre
agarosa, vía tosilo o vía glicidol.
No obstante, estos derivados tienen muchos problemas a la hora de ser utilizados con
fines preparativos dadas sus pobres propiedades mecánicas. Es por ello por lo que se planteó
la colaboración con el grupo de la Dra. Gil de la Universidad de Coimbra, a fin de obtener
derivados inmovilizados de a-quimotripsina sobre copolímeros, cuyas propiedades mecánicas
y su resistencia a los efectos producidos por la variación del pH, de porcentaje de medio
orgánico, y de su naturaleza, los hacía candidatos idóneos para desarrollar una nueva familia
de biocatalizadores de posible uso en Síntesis Orgánica. Para lograr este objetivo se ha
abordado ci siguiente Plan de Trabajo, en el cual hemos utilizado como término de
comparación un derivado inmovilizado de a-quimotripsina suministrado por el Dr. Guisán.
u
PLAN DE TRABAJO
1) Caracterización de los derivados inmovilizados de a-quimotripsina.
2) Estudios de abrasión y estabilidad térmica de los derivados inmovilizados obtenidos
sobre copolimeros de injerto
3) Optimización de la actividad transferásica del derivado «-quimotripsina-agarosa.
4) Optindzanión de la actividad transferásica del derivado «-qu.imotripsina-copolímeros.
5) Estudios de reutilización de los derivados de a-quimotripsina-copolímeros.
6) Estudios de quimioselectividad de los derivados inmovilizados.
71
HL PARTE EXPERIMENTAL
Parte ererinrntal
III.- PARTE EXPERIMENTAL
111.1.- ENZIMAS. SLTSTRATOS Y REACTiVOS
m.m.- ENZIMAS
El biocatalizador empleado a lo largo de toda la Memoria ha sido la a-quimotripsina
de páncreas de bovino (E. C. 3.4.21.1), tipo II, de la casa SIGMA (articulo 4129), con una
actividad específica de 48 unidades/mg de sólido y 50 unidades/mg de proteína (una unidad
internacional de actividad es la cantidad de proteína activa que hidroliza 1 timol de éster etílico
de la N-benzoil-L-tirosina por minuto a pH=7.8 y a 250C). Esta enzima se conserva en su
estado de polvo liofilizado a -150C.
ITI.1.2- SUSTRATOS
Para medir la actividad de la a-quimotripsina se han empleado:
-p-Nitroanilida de la N-glutaril-L-fenilalanina (GpNA) (SIGMA).
-p-Nitroanilida de la N-benzoil-L-tirosina (BTpNA) (SIGMA).
Como donadores de acilo:
-Ester etílico de la N-benzoil-L-tirosina (BTEE) (Bz-L-Tyr-OEt) (SIGMA).
-Éster etílico de la N-acetil-t-fenilalanina (APEE) (Ac-L-Phe-OEt) (SIGMA).
-N-acetil-L-tirosina (Ac-tTyr-OH) (SIGMA).
Y como nucleófilos:
-Hidrocloruro de L-alaninamida (H-L-Ala-NH
2) (SIGMA).
-Hidrocloruro de L-leucinamida (H-LLeu-NI{2) (SIGMA).
-Hidrocloruro de L-metioninamida (H-LrMet-NH2) (SIGMA).
-Hidrocloruro de Lrglicinamida (H-L-Gly-NI%) (SIGMA).
-Hidrocloruro de L-serinamida (H-L-Ser-N?H2) (SIGMA).
-Hidrocloruro de L.aspartamida (H-LAsp-NH2) (SIGMA).
-Dihidrocloruro de Uargininamida (H-UArg-NH2) (SIGMA).
72
Parte experinrntal
En la determinación del número de centros activos en un preparado se empleó:
-Sultona del ácido 2 thidroxi..5 tnitrofenilme~osulfónico (SULTONA) (SIGMA).
Precursores de sustratos y sustratós no convencionales:
-Éster N-(4-Clorobutanoil)-Ltriptofanato de metilo
-N-(3-indolilmetil)-glicinato de etilo.
-(Cis 1,3) 1 -metil-2, 3,4, 9-tetrahidro-1 H-~-carbolina-3-carboxilato de metilo.
-Ácido (±)2-fenilbutírico (ALDRICH).
-Ácido (±)3-fenilbutírico (ALDRICH).
-Ácido (±)tetrahidrofurano-2-carboxílico (ALDRICH).
-Ácido (±)tetrahidrofurano-3-carboxíico (A.LDRICH).
-Ácido (±)1,2,3,4, -tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico (ALDRICH).
-(1<)
Mandelato de etilo (FLUKA).
-(~ Mandelato de etilo (FLUKA).
-(A, S) Mandelato de etilo (FLUKA).
-(R,S)
Mandelato de bencilo (FLUKA).
-(R,S) Mandelato de isoamilo (FLUKA).
IIL1.3.-DISOLVENTES
-Acetato de etilo (PANREAC) (99.8% de pureza).
-Acetonitrilo (SCHARLAU) (>99% de pureza).
-l,4-Butanodiol (MERCK) (98% de pureza).
-Diclorometano (SCHARLAU) (>99% de pureza).
-N,N-Dimetilformamida (MERCK) (>99% de pureza).
-Etanol absoluto (MERCK) (>99% de pureza).
-Isobutilmetilcetona (MERCK) (>99% de pureza).
-Metanol (MERCK) (>99% de pureza).
-l-Propanol (SCHARLAU) (>99% de pureza).
-Tolueno (MERCK) (> 98% de pureza)
-1,1,1 -Tricloroetano (MERCK) (>99% de pureza).
73
Parte experinrntal
111.1.4.-OTROS REACTIVOS
-Acetato sádico (PANREAC).
-Acetona (SCHARLAU).
-Ácido acético (PROBUS).
-Ácido cítrico (MERCK).
-Ácido clorhídrico 35-36% (MERCK).
-Ácido bórico (PANREAC).
-Albúmina bovina (SIGMA).
-Bicarbonato sádico (PANIREAC).
-Borato sádico (PANREAC).
-Carbonato sádico (PROBUS).
-Carbonato potásico (PROBUS).
-N-Ciclohexil-N t(2-(metilmorfolino)etil)-carbodiimida-4-tolueno--Sulfonato (CMC)
(MERCK).
-Citrato sádico cristalizado dihidrato (MERCK).
-Fosfato dipotásico (MERCK).
-Fosfato disódico (PAN?REAC).
-Fosfato monopotásico (PAN?RIEAC).
-Fosfato monosódico monohidrato (PANREAC).
-Hidróxido sádico (MERCK).
-Metacrilato de 2 ~hidroxietilo(HEMA) (Biochemical Co. Poale, Dorset, U.K).
-Polietileno (PE), suministrado por Telcon Plastics. Ltd. U.K.
-Sulfato de cobre (II) pentahidrato (MERCK).
-Trietilamina (ALDRICH).
-Tris-(hidroximetil)-aminometano (Tris) (MERCK).
-Triton X 100 (MERCK)
Todos estos reactivos presentan la pureza de grado analítico o superior.
74
Parte e,ipetinrntal
111.1.5.- APARATASE EMPLEADO
-
Espectrofotómetro de ultravioleta-visible Shimadzu 2100 UV. equipado con un
sistema de termostatización por recircularización de agua, con cubetas de un paso óptico de
1 cm, y un volumen total de 3 ml.
-Cromatógrafo líquido de alta resolución (HPLC), LDC, con una columna C8,
Nucleosil 128 (LDM) (fase reversa).
-Valorador volumétrico ATI ORION AF8 (para medir la cantidad de agua, mediante
el método de Karl-Fisher).
-
Espectrómetro Resonancia Magnética Nuclear (RMN) BRUCKER 250 MHZ).
111.1.6.- PROGRAMAS INFORMÁTICOS
a) Programas para ajustes matemáticos. SJMF¡T V. 4.0(226)
A lo largo de esta Tesis Doctoral se ha utilizado como herramienta de cálculo el
paquete integrado S¡MFlTversión 4.0 para llevar a cabo el ajuste de los datos experimentales
a determinadas ecuaciones matemáticas.
Este paquete informático, diseñado por W. G. Bardsley, escrito en lenguaje Fortran
compilado y desarrollado en base a rutinas de regresión no lineal de la librería “NAG
WORKSTATION”, emplea algoritmos de optimización matemática por iteración con el
objetivo de minimizar la función Sumatorio de Residuales (SSQ) definida mediante el método
de mínimos cuadrados.
La función SSQ se define como:
SSQ=r (y,-ftp,x,W
[13]
donde y~ es un dato experimental obtenido para la variable independiente “y”, cuando
la variable dependiente “x” adopta un valor “xi”.
P son los parámetros óptimos del ajuste
Las suposiciones estadísticas en las que se basa el criterio de los mínimos cuadracos
son: que la ecuación por ajustar es la correcta, el error en la respuesta es estrictamente aditivo
75
Parte experinrntaJ
y los errores son independientes entre sí y siguen una distribución homocedástica (varianza
constante), esto es, las medidas se han hecho con la misma precisión. Este tipo de regresión
se denomina regresión sin pesos estadísticos.
No obstante la mayoría de las veces las medidas experimentales siguen una distribución
heterocedástica (diferente varianza), y se hace necesario dar más importancia a los datos de
menor error frente a los de mayor error. Para ello, lo que se hace es corregir los residuales con
un factor llamado ~sQssia4ísIkQ
(w,), que es inversamente proporcional a la varianza de los
datos (el cuadrado de la desviación estándar).
wÍ=
114]
LS,.
—
De esta forma, la función que se optimiza se denomina sumatorio ponderado de
residuales (WSSQ), que se define como:
WSSQ=~ (lIS5x(y,~flp,x))2
[15]
La desviación estándar en las mediciones de la variable dependiente se determina
mediante réplicas. De esta forma, se le asigna a cada conjunto de medidas (yD su desviación
estándar correspondiente, que se utiliza para ponderar el error. No obstante esta metodología
es recomendable siempre que el número de réplicas obtenidas por cada valor de la variable “y”
sea mayor o igual que 3. Como esto no es factible en muchas ocasiones, otra metodología que
puede sugerirse consiste en determinar el error experimental promedio que tiene el método y
asignar a cada punto dicho error experimental como error relativo constante; generalmente se
toma como valor de dicho error el 5 0X.
Como parámetros que cuantifican la bondad del ajuste, el paquete SIMFfTcalcuIa el
valor del coeficiente de determinación (R2). Por otra parte, cuando se utilizan como pesos
estadísticos las desviaciones típicas de los errores (o estimaciones de las mismas), la función
WSSQ sigue una distribución Ji-cuadrado
(x2) con
“g” grados de libertad, siendo g
=
n0 de
puntos experimentales n0 de parámetros del ajuste. De esta forma, por comparación del valor
-
de ji-cuadrado con WSSQ se puede establecer la bondad del ajuste. El programa SIMFJT
76
Parte experinrntal
calcula automáticamente la probabilidad de que ji-cuadrado exceda del valor de WSSQ. Así,
cuando la probabilidad de ji-cuadrado sea mayor de WSSQ es menor de 0.01 (nivel de
significancia del 1 %) o menor de 0.05 (nivel de significancia del 5 %), se debería rechazar
el ajuste utilizando dichos niveles de significación.
S¡MFlTtanibién permite establecer criterios de bondad de ajustes a través del estudio
de los residuales, los cuales, en un óptimo deberían quedar distribuidos al azar y no deberían
presentar una correlación serial significativa, por lo que el número de residuales positivos y
negativos debe ser similar, y no debe haber series largas de residuales con el mismo signo, ni
tampoco muy pocas series. El número de residuales positivos se designa con la letra
y el
de residuales negativos con la letra “ni” y el n0 de series con “r”. SlMFlTestablece dos test
acerca de las series, que deben dar una probabilidad (p) comprendida entre «/2 y 1 -«/2
“ix”,
(«=0.05 60.01 según el nivel de significancia con el que se trabaje). La prueba de los signos,
también desarrollada por este programa, debe dar una probabilidad de p=«para poder
considerar el ajuste como bueno. Un nuevo estadístico que el programa calcula es el test de
Durban-Watson, que indica la posibilidad de que exista una correlación seriada, esto es, que
el signo que presente un residual venga impuesto por el signo del anterior. Normalmente,
cuando el valor de dicho estadístico está comprendido entre 1.5 y 2.5 se puede descartar dicho
efecto.
Es frecuente que los parámetros del ajuste deban ser distintos de cero, pues el hecho
de anularse suele conllevar el que La variable respuesta “y” no dependa de alguna variable
explicativa “x”, que lleve consigo una simplificación del modelo debido a la desaparición
funcional del mismo. Así para determinar si un parámetro puede considerarse nulo o no, éste
se mide en unidades estándar, es decir, se calcula el cociente:
T=(Valor estimado del parámetro)/(error de estándar de su estimación)
[16)
si el valor de este cociente T esta dentro de ciertos límites que se consultan en las tablas
estadísticas de la «t” de Student, considerando como grados de libertad (g=n0 de puntos
-
de parámetros) puede ser que el parámetro se anule; si por el contrario, el valor de T rebasa
esos límites, entonces el valor del parámetro es distinto de cero. El programa SJMF¡T
77
Parte xpvrinrntal
suministra automáticamente toda esta información mediante un parámetro de redundancia.
b) Pro~mmas de modelización molecular. Hhrirhem 7M. VIO br gindow3 (227).
Los cálculos de Mecánica y Dinámica Molecular de la estructura de los sustratos objeto
de estudio en la presente Tesis Doctoral, se realizaron con el programa IHPERCIJiEM
El estudio por Dinámica Molecular se realizó a alta temperatura debido a la mayor
eficacia para atravesar barreras de energía en el espacio conformacional multidimensional. Se
0K como punto de partida, ya que permite a la molécula
eligió una temperatura de 100
explorar un número de conformaciones separadas por barreras energéticas significativas. Para
evitar el riesgo, inherente a toda simulación de Dinámica Molecular (D.M.) a alta temperatura
de que la estructura encontrada corresponda a un mínimo local de alta energía se realizaron con
cada uno de los confórmeros obtenidos procesos de D.M. sucesivas de lps (T~=450 0K); lOps
(T=350 0K); l2ps (T=300 0K).
Finalmente, la geometría de los confórmeros de mínima energía obtenidos se analizaron
por Mecánica Molecular (M.M.) mediante el uso del método MM+ como campo de fuerzas.
Primeramente se analizó el algoritmo “steepest descent” de forma interactiva hasta un gradiente
de 0.1 KcaI/mol A. Una vez optimizada esta estructura se procedió a una nueva optimización
utilizando el algoritmo “Fletcher-Reeves” con gradiente conjugado hasta un valor de 0.02
Kcal/mol
A,
que permitió considerar los efectos de la conjugación de dobles enlaces, tan
importante a priori, en las moléculas objeto de estudio.
111.2.- CARACTERIZACIÓN DEL PREPARADO COMERCIAL
111.2.1.- DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO PROTEICO DE LA a-ET1 w122 24
OUIMOTRII’STNA COMERCIAL
Para la determinación del porcentaje de proteína presente en el preparado comercial se
empleó el método del Microbiuiet, (228) empleando el reactivo de Benedict, cuya preparación
se detalla a continuación:
Se disuelven 86.5 g de citrato sádico cristalizado (2Na
3C6H5O7. 1 1H20) y 50 g de
78
Parte e perinrnta¡
carbonato sádico anhidro en 250 ml de agua (se filtra si es necesario). Se añade con agitación
continua una solución de 8.65 g de sulfato cúprico cristalizado disuelto en 50 ml de agua, y
se diluye a 500 ml. La solución résultante debe quedar perfectamente transparente.
Posteriormente se preparó una solución de seroalbdniina bovina en tampón fosfato
pH=6.0, 0.1 M, de una concentración de 0.8 mg/ml.
Las condiciones experimentales empleadas para la construcción de la recta de calibrado
en la determinación de proteína por el método del Microbiuret se muestra en la Tabla 11
(como referencia se empleó el contenido del blanco);
Tabla 11.- Cálculo de la cantidad de proteína presente en una disolución, empleando
seroalbúmina bovina como patrón.
Tubo
Tampón fosfato
Disol.
pH=6.0(0.l M)
Albúmina
(mí)
(mí)
(mí)
(mg)
(D.O.)
0.2
0.2
0.2
0.2
1.0
1.0
0.8
0.0
0.0
0.00
0.00
0.000
0.000
0.2
0.2
0.16
0.16
0.054
0.051
0.6
0.6
0.4
0.32
0.32
0.098
0.092
NaOH R. Benedict
(0. IM)
(mí)
=
Albúmina
Abs.
(330 nm)
Blanco
Blanco
la
lb
4.0
2a
2b
4.0
4.0
0.2
0.2
3a
4.0
4.0
0.2
0.2
0.5
0.5
0.5
0.5
0.40
0. 117
0.40
0.105
4.0
0.2
0.4
4.0
0.2
0.4
0.48
0.48
0.114
0.121
Sa
4.0
0.160
4.0
0.2
0.2
0.64
Sb
6a
6b
7a
0.64
0.164
4.0
4.0
0.2
0.2
0.2
0.2
0.6
0.6
0.8
0.8
0.9
0.9
0.72
0.72
0.192
4.0
4.0
0.2
0.2
0.0
0.0
3b
4a
4b
7b
4.0
4.0
4.0
0.8
0.4
0.1
0.1
79
1.0
0.80
1.0
0.80
0.190
0.197
0.202
Parte experínirnta¡
El contenido de los tubos se agitó bien y se dejó reaccionar durante 1 h. a 25 0C de
temperatura, para que se forme el complejo coloreado entre los iones Cu (II) y los restos
amino y carboxilo de los enlaces peptídicos. Transcurrido ese tiempo se midió la absorbancia
a 330 nm. En la cubeta de referencia se empleó el blanco que no contenía proteína, y con el
cual se realizó el autocero.
Siguiendo esta metodología obtuvimos la siguiente recta de calibrado:
0.25
0.20
2(u
0.15
15
c
0.10
0.05
0.00
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
mg de AJbumina
Figura 14.- Recta de calibrado para el cálculo de la cantidad de proteína presente en una
disolución, empleando seroalbúmina bovina como patrón.
Los parámetros de esta recta son los siguientes:
-Pendiente=(0.245 + 0.001) (D.O/mg de albúmina)
-Ordenada en el origen=(0.000 + 0.001), no es significativa según el test “t de
Student” al 99% de certeza.
-
= 0.994
El preparado comercial utilizado en la preseste Tesis Doctoral posee un contenido en
proteína de un (83 ±4) %, calculado por el método del Microbiuret (228).
80
Parte experinrntal
m.2.2.-
MEDIDA
DE
VA
ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA
DE
a-ET1 w116 74
OUIMOTRIPSINA NATIVA
Para cuantificar la actividad hidrolítica de la enzima nativa, se empleó como reacción
estándar, la hidrólisis del GpNA (229), cuantificando la cantidad de p-nitroanilina liberada por
valoración espectrofotométrica a 410 nm. Para ello, a fin de calcular el coeficiente de
extinción molar de la p-nitroanilina a esa longitud de onda, se realizó una curva patrón
variando la concentración de p-nitroanilina según se muestra a continuación en la Tabla 12
(como referencia se empleó el contenido del blanco):
Tabla 12.- Cálculo del coeficiente de extinción molar de la p-nitroanilina.
Tubo
Tampéi?
Vol. PNAb
[pNA]
Abs.C
(mi)
(mi)
(X 10.2 mM)
(DO.)
Blanco
5.0
0.0
0.00
0.000
la
4.0
1.0
1.77
0.130
lb
le
4.0
4.0
1.0
1.0
1.77
1.77
0.132
0.126
2a
2b
3.0
3.0
2.0
2.0
3.53
3.53
0.254
0.254
2c
3.0
2.0
3.53
0.256
3a
3b
3c
2.0
2.0
2.0
3.0
3.0
3.0
5.30
5.30
5.30
0.369
0.374
0.372
4a
4b
1.0
1.0
4.0
4.0
7.07
7.07
0.492
0.497
‘le
1.0
4.0
7.07
0.495
Sa
5b
Sc
0.0
0.0
0.0
5.0
5.0
5.0
8.83
8.83
8.83
0.642
0.643
0.643
Tan~rx5n tsé Lo nvnopoWsico/bsfato dipotásicopH= 7.8 (0. IAl).
b
Disolución rmdre depNA (8.83 X 10
.2
mM).
Absorbancia nrdida a 410 nm.
81
PurUtexp~trinrntaI
0.80
—
_______________________________________________
=0
0.60
it
oo
13
e~
0=40—
0.20
—
A
a.oa
‘II’
0.0
2.0
4.0
[pNA]
6.0
8.0
10.0
(mM) X 1OE+2
Figura 15.- Cálculo del coeficiente de extinción molar de la p-nitroanilina.
El valor de la pendiente de esta recta coincide con el coeficiente de extinción molar (c),
que resultó ser:
(0.0717 + 0.0003) (mM1 cm1).
-La ordenada en el origen no es significativa según el test “t de Student” al 99% de
-Pendiente
=
certeza
-
=
0.999.
Una vez llevada a cabo esta valoración espectrofotométrica, se cuantificó la actividad
hidrolítica de la a-quimotripsina nativa, realizando diferentes ensayos de hidrólisis de GpNA
(0.015 M en DMF) (229) empleando distintas cantidades de una disolución de «-quimotripsina
comercial preparada en tampón fosfato pH=6.0, 0.1 M de una concentración de 1.37 mg/ml.
Así, se realizó un protocolo que aparece indicado en la siguiente Tabla 13 (como
82
Parteg~~erinrn4 ¡
referencia se empleó el contenido del blanco):
Para calcular la velocidad inicial de reacción se cuantificó el incremento de absorbancia
producido a 410 nm debido a la liberación de p-nitroanilina en un intervalo de tiempo de 25
minutos y una temperatura de 25 0C, el cual, mediante el empleo del coeficiente de extinción
molar calculado anteriormente, pudimos transformar dicho valor en actividad hidrolítica,
cuantificada como b¿nioles de p-nitroanilina liberada por minuto.
Para medir la actividad hidrolítica especifica, esto es, expresando la actividad por
unidad de cantidad de enzima, se procedió a la representación de la velocidad medida frente
a la cantidad de preparado comercial presente en cada ensayo, obteniendose así la
representación que aparece indicada en la Figura 16.
Tabla 13.- Cálculo de la acividad hkfrolftica específica.
Tubo
a-Quimotr.
Tampóna
GpNA
Abs.b
(mí)
(mí)
(D.O.)
0.0 0.000
4.5
0.5
0.000
0.000
0.1
0.1
0.2
0.2
0.3
0.3
0.4
0.4
0.5
0.5
4.4
4.4
4.3
4.3
4.2
4.2
4.1
4.1
4.0
4.0
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.141
0.141
0.247
0.247
0.441
0.421
0.545
0.555
0.666
0.690
0.788
0.900
1.382
1.488
2.466
2.356
3.048
3.104
3.726
3.860
(mi)
Blanco
la
lb
2a
2b
3a
3b
4a
4b
Sa
Sb
(mg)
0.137
0.137
0.274
0.274
0.411
0.411
0.548
0.548
0.685
0.685
0.5
0.5
0.5
0.5
Tanpln #asfato nrnopotásico/bsfato dipotásisoph’= Z8(O.IM).
~,,4bsorbancia
nahda a 410am
Actividad en (gMpNA”min.).
83
Actividadc
)
Parte experimental
4.00
4
‘Li
18
3.00
2.00
1,00
0.00
0.0
0.2
0.4
0.6
0,8
mg de enzima
Figura 16.- Cálculo de la actividad hidrolitica específica de la a-quimotripsina comercial.
Así, la actividad hidrolítica específica de la «-quimotripsina comercial empleada en la
presente Memoria coincide con el valor de la pendiente de la recta.
-Pendiente = (2.54 ±0.04) iM de pNA liberados mm.’1 ing~1 de enzima,
-La ordenada en el origen no fue significativa según el test “t de Student” al 99% de
certeza.
-R2= 0.997.
111.3.- SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE LOS DERIVADOS aQUIMOTRIPSINA INMOVILIZADA SOBRE COPOLÍMEROS DE INJERTO
<PE/HEMAA
111.3.1- PREPARACIÓN DEL SOPORTE (PE/LIEMA
111.3.1.1.- Síntesis del copolíínero (PE/HEMA
El polietileno comercial primeramente fue purificado por extracción en soxhlet con
84
Parte experinrntal
A continuación se lavé el copolímero sobre una placa de vidrio poroso con agua
abundante hasta que la espuma desapareció y se lavé posteriormente el residuo sólido con HCI
1 M (50 mí) para neutralizar el hidróxido de sodio que pudiera quedar. Para finalizar, se
realizó un segundo lavado del copolímero injertado e hidrolizado, con agua, y se dejó secar
a 40 0C durante 24 h.
Para calcular el número de grupos carboxilo libres provenientes de la hidrólisis, se
añadió un exceso de NaOH 0.05 M (10 mi) a un matraz que contenía 50 mg del copolímero
de injerto hidrolizado y se mantuvo en agitación durante 24 h; pasado ese tiempo, se filtró el
contenido y
5
ml del sobrenadante se diluyeron con agua hasta un volumen final de 25 mí, que
posteriormente fueron valorados con HCI 0.01 M. La diferencia entre los moles de NaOH
añadidos y los obtenidos en la valoración con MCi se corresponde con la concentración de
restos carboxilato libres en el copolimero. De esta forma se obtuvieron unos soportes que se
denominaron Cl, C2 y C3, cuyas características diferenciales se comentarán más adelante en
la Sección (IV.l.l).
111.3.1.2.1.- Modificaciones del método de hidrólisis.
En el caso de los derivados con un 54.5% de injerto (respecto a la masa total de
soporte) existen ciertas diferencias en el proceso de hidrólisis:
-Para obtener C4, se partió de 1 g de copolímero que se hidrolizó empleando una
solución de NaOH 1 M (50 mí), 1 ml de Tritón X 100, y se dejó todo ello a reflujo
durante 4 horas.
-En el caso del derivado C5, intentando aumentar el porcentaje de hidrólisis, se
partió de 4 g de polímero los cuales se depositaron en el seno de una solución de NaOH
2 M (200 mI), añadiendose a continuación 4 ml de Triton X 100, dejando la mezcla a
reflujo durante 24 h.
Por otra parte, se suavizó el proceso de hidrólisis, empleando sólo 50 ml de NaOH
(2 M) para 2 g de copolímero y 2 mide Tritón X 100 durante 4horas. Así se obtuvo
el copolímero C6.
Los resultados de estas modificaciones junto con las propiedades de los copolimeros
87
Parte experinrntal
mí).
En los líquidos de los filtrados se determinó la cantidad de enzima existente empleando
el método del Microbiuret (228), tal y como se indica en la Sección 111.2. Así, al conocer, la
cantidad de enzima afíadida inicialmente, por diferencia se puede calcular fácilmente la carga
enzimática del derivado. Siguiendo esta metodología se obtuvieron los derivados CJ-CT, C2-
CT, C3-CT.
Para convertir los valores de absotancia en unidades de concentración construimos una
recta de calibrado empleando en vez de seroalbúmina bovina como patrón la enzima comercial
ya caracterizada disuelta en tampón fosfato de pH=6.O (0.1 M), resultando una concentración
en el tubo madre de 1.76 mg de enzima/ml. Siguiendo el protocolo que se muestra en la Tabla
14, calculamos la carga enzimática de los derivados (como referencia, se empleó el blanco):
Tabla 14.- Cálculo de la cantidad de protdna presente en
Tubo
NaOW (mi)
Enzima
a-Quixnot.
Abs.’
(mi)
(mi)
<¡ng)
(DO.>
1.0
LO
0.0
0.0
0.000
0.000
0.000
0.000
0.2
0.8
0.2
0.352
0.080
0.2
0.8
0.2
0.352
0.082
0.2
0.6
0.6
0.4
0.704
0.155
0.2
0.4
0.704
0.146
0.2
0.5
0.5
0.880
0.190
0.2
0.5
0.5
0.880
0.188
0.2
0.4
0.6
1.056
0.23 1
0.2
0.4
0.6
1.056
0.239
0.2
0.8
1.408
0.2
0.2
0.8
1.408
0.309
0.313
0.2
0.1
0.1
0.9
1.584
0.347
1.584
0.330
0.0
0.9
1.0
1.760
0.382
0.0
1.0
1.760
0.378
t
R. Bcnedict
Tampón
(mi)
Blanco
Blanco
4.0
4.0
la
4.0
lb
4.0
Za
4.0
2b
4.0
3a
4.0
4a
4.0
4.0
4b
4.0
31,
Sa
4.0
Sb
4.0
éa
4.0
6b
4.0
7a
4.0
4.0
7b
una disolución empleando «-quimotripsina como patrón.
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
• Solución de NeOH (0. IAl)
b Tan4xln JOSIB&, ¡mnopotásico/fosfato k1
4>owsico pH=6. 0(0.1 Al)
Absorbencia nabda a una longitud de onda
de 330am
89
Parte e’.pcrinrnt.a)
0.40
0.30
2
‘
020
0.10
0.00
0.00
0.50
1.00
mg de
Enzima
1.50
2.00
Comercial
Figura 17.- Recta de calibrado para el cálculo de la cantidad de proteína empleando a-quimotripsina
comercial, caracterizada, como patrón.
Los parámetros de esta recta resultaron ser:
-Pendiente=(0.215 + 0.001) (FEO/mg de enzima)
-La ordenada en el origen no fue significativa según el test “t de Student” (99% dc certeza)
0. 999
111.3.2.1.- Modificación del proceso de inmovilización
A fin de intentar mejorar el método de inmovilización y aumentar la carga enzimática,
en el caso de los derivados de mayor porcentaje de injerto se introdujeron diferentes
modificaciones en el proceso descrito en el apartado anterior:
a) Para favorecer los choques intermoleculares se redujo el volumen a la mitad.
b) Por otra parte y a fin de estudiar las posibles diferencias entre el método de
inmovilización “one-pot” en un solo paso y una metodología secuencial, se puso en contacto
la CMC con la solución de copolimero durante 24 h.; transcurrido ese tiempo, se añade la
enzima y se deja reaccionar a 4 oc de temperatura durante otras 24 h. Con esto pretendemos
90
.
Parte experinrntaj
activas el soporte antes de reaccionar con la enzima al hacer reaccionar los restos carboxilato
del soporte con la CMC evitando que esta reaccione con los grupos carboxilato de la enzima,
y sí con los residuos e-amino de lisina.
Siguiendo estas modificaciones se obtuvieron los derivados C4-CT, C5-CT, y C6-CT
(ver Tabla 16, Sección IV.1.1).
111.3.3.- DETERMNACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LOS
DERIVADOS INMOVILIZADOS
Para determinar la actividad enzimática de los derivados inmovilizados, se realizó un
ensayo similar al que se describe para la enzima nativa, empleando <JpNA como sustrato. Para
ello, se procedió a incubar 25 mg del derivado inmovilizado en 4.5 ml de tampón fosfato
pH=7.8, 0.1 M a 25 0C, con 0.5 ml de una disolución de GpNA en DMF (229) de
concentración 0.015 M.
Transcurridos 25 minutos, la reacción se detiene por filtración a través de una placa de
vidrio Pyrex del n<’> 4, separando así el derivado sólido del resto de los componentes de la
reacción. Posteriormente se midió la absorbancia a 410 nm originada por la p-nitroanilina
liberada presente en los liquidos del filtrado, y por interpolación en las curvas de calibrado
empleadas para la enzima comercial en la Sección 11L3 (Hg. 13 y 16), se obtuvieron los
valores de actividad retenida de los derivados, expresada en comparación con la cantidad
porcentual de enzima nativa que nos propoirionarfa la misma actividad hidrolítica, (Tabla 16).
111.4.- DERIVADOS INMOVILIZADOS SOBRE GELES DE AGAROSA
Estos derivados fueron suministrados por el grupo del Dr. (Suisán, para compararlos
con los derivados obtenidos sobre copolímeros de injerto.
111.4.1.- ACTIVACIÓN DEL SOPORTE
La activación de los geles de agarosa la realizaron siguiendo la metodología del
91
Parte expermnrntal
cabo en un reactor tipo tanque agitado, de un volumen aproximado de SO mí, el cual se
introdujó en un baño termostatizado a 25 0C. Como medio acuoso se empleó tampón Tris/HCI
0. IM pH=9.O, 0.1 M y como codisolventes orgánicos se probaron: 1,l,1-tricloroetano,
metilisobutilcetona, acetato de etilo, acetonitrilo, N,N-dimetilformamida, 1 ,4-butanodiol y
etanol absoluto, en diferentes proporciones desde 10/90 hasta 99/1 (%,
y/y),
disolvente
orgánico/tampón.
Los donadores de acilo utilizados fueron BTEE o APEE (10 mM), y como nucleófilo
se emplearon H-LLeu-NH
2, H-LrAla-NH2, H-L-Arg-NH~ H-LrMet-NH2, H-L-Ser-NH2, H-.L~
Asp-NH2, H-L.-Gly-NH2, (40 mM), (en forma de clorhidrato); el volumen final fue en todos
los casos de 20 ml y, puesto que el nucleófilo estaba en forma de clorhidrato, se añadió una
cantidad de trietilanxina equimolecular respecto a la cantidad de HCl, a fin de lograr la perfecta
solubilización de la muestra y no causar ninguna variación de pH.
Posteriormente, se procedió a agitar la muestra durante 30 minutos para lograr una
buena disolución de todos los componentes, y realizar la toma de muestra correspondiente a
tiempo cero. A continuación, se añadió la enzima libre o inmovilizada sobre los diferentes
soportes, en concentraciones variables desde 0.48 mg de enzima/ml hasta 0.044 mg de
enzima/ml. Una vez añadida la enzima, se fueron tomando muestras a diferentes tiempos de
reacción que se analizaron por HPLC.
Por lo que respecta a la toma de muestras, ésta se llevó a cabo succionando desde la
mezcla de reacción un volumen de 0.05 mi, que posteriormente fue diluido con 0.85 ml de una
disolución de naftaleno en acetonitrilo (0.47 mM), que actúa de patrón interno y 0.1 ml de
alcohol etílico con el fin de anular la actividad enzimática, obteniendo de esta forma un
volumen final de 1 ml. Estas muestras se cromatografiaron inmediatamente empleando la
0C hasta su posterior análisis.
técnica de HIPLC, o bien se almacenaron en el congelador a -15
Las muestras se filtraron con un filtro tipo GV de la casa “Technokroma” de un
diámetro de poro de 0.22 gm, con el fin de eliminar las partículas de derivado inmovilizado
que pudieran obstruir las precolumnas del HPLC, pasando el contenido a un vial, para lograr
la separación y cuantificación de los productos.
El análisis por HPLC se realizó con un cnmatógrafo LDC empleando una columna C
8
Nucleosil 128 (LDM). El eluyente fue acetonitriio/H20 (55/45) (vA’). La longitud de onda
94
Parte experinrntal
empleada fue de 270 nm en el caso de BTEE y 254 nm en el caso del APEE. Conociendo las
cantidades iniciales de naftaleno y sustrato se pueden calcular los rendimientos a los diferentes
tiempos de reacción empleando la técnica del patrón interno, con el cálculo del factor de
respuesta ‘f” según las expresiones siguientes:
[19]
An Jjp]
f=Factor de respuesta
Ap=Area del producto
An = Area del naftaleno
[nj = Concentración inicial de naftaleno
[pl Concentración inicial de producto
[20]
Ap [n]
‘An f
[pL= Concentración de producto a un tiempo determinado
[P]u*Vr*V,,
*M, *100
y
[21]
(%p)fi=Tanto por ciento de producto en reactor
Vr= Volumen remanente
V~=Volumen extraído
V~=Volumen del vial (1 mí)
MjMoles totales de producto
95
Parte experinrntal
e~LE
cm
UEUI~
ea
n
e
TIME
36.2?
DATE
e ~ e
IB. ~
Rtm.I -T1~
~ÁLtT
st
—
U
N~LIZSTIW’4
TIME
1. 84
¡ . 39
asr
622
e. es
It
ez
TflT*t
ncc
e
7552
1 ~fl
44712
39246
2~n
278848
a
1 SBBSfl
mm 1116
U-
a
t
~A
~CWES
604
m
PW PC
13. e a
±4. 671 5??~
61. t4fl1G
ss. nrr
7
Figura 18.- Cromatograma de una muestra a un tiempo diferente de cero. Síntesis del
dipéptido modelo Bz-L-Tyr-L-Leu-NH2.
111.6.- ENSAYOS CON DERIVADOS DE a-OUIMOTRIPSINA INMOVILIZADA
SOBRE COPOLIMEROS DE INJERTO (PE/HEMA
A fin de comprobar la estabilidad operacional de los derivados inmovilizados de aquimotripsina sobre copolímeros de injerto PE/HIEMA, se llevaron a cabo una serie de estudios
fundamentales desde el punto de vista de Ingenieria Enzimática.
111.6.1.- ENSAYOS DE ESTABILIDAD ENZIMÁTICA
En primer lugar, se comprobó la variación de la estabilidad enzimática en condiciones
de almacenamiento, y a diferentes temperaturas, tanto en condiciones de hidrólisis como de
síntesis.
96
:
Parte experinrntaI
A) En condiciones de hidrólisis
Para comparar la estabilidad de nuestros derivados con la de la enzima libre se llevó
a cabo un estudio similar para ambos sistemas.
1) Enzima libre
al Actividad enzimática
La actividad enziniática fue determinada espectrofotométricamente a 25 0C y a una
longitud de onda de análisis de 410 nm) utilizando como sustrato N-benzoil-Lrtirosin-p-
nitroanilida (BTpNA) (4.39 mM en acetona) (258). Para definir el ensayo estándar de actividad
se necesitaron:
-
2.6 mIde tampón Tris/HCl pH=8.0, 0.1 M.
-
25 ~¿1
de BTpNA (4.39 mM en acetona).
-
0.275 ml de acetona.
-
0. 1 ml de solución tampón (cubeta dc referencia) ó 0. 1 ml de solución de enzima
(0.62 mg/mi) (cubeta de muestra) preparada en tampones: dc. cítrico/citrato sódico pH=3.0,
0.05 M; ác. bórico/NaOH pH=9.0, 0.05 M; y dc. bórico/NaOH pH=9.0 0.05 M con un 10%
de N,N-dimetilformamida (y/y)
Primeramente, se calculó el coeficiente de extinción molar (e) de este sustrato, para
obtener directamente las velocidades iniciales expresadas en (mmoles/min.), para lo cual se
construyó una curva de calibrado de absorbancia frente a concentración de sustrato empleando
una disolución madre de BTpNA en acetona (4.39 mM) y otra disolución de enzima en tampón
de almacenamiento dc. cítrico/citrato de pH=3.0, (O.IM) muy concentrada (10 mg de
enzima/mi), para hidrolizar rápidamente el sustrato y comprobar la variación de la absorbancia
a 410 nm en función de la concentración de sustrato, según se describe en el siguiente
protocolo, Tabla 13, (como referencia se empleo el contenido del blanco):
97
Parte experinrntal
Tabla 15.- Cálculo del coeficiente de extinción molar del BTpNA.
Tubo
Blanco
2
3
4
5
6
7
8
Tampón’
Acet.
Enz.b
ETpNAC
[BTpNA1
(mi)
(mi)
(mi)
(mí)
(mM)
(D.0.)
(D.0.)
(DO.)
2.6
0.300
0.1
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
2.6
2.6
2.6
2.6
2.6
2.6
0.295
0.1
0.285
0.1
0.003
0.081
0.227
0.382
0.079
0.225
0.1
0.1
0.1
0.007
0.022
0.037
0.073
0.110
0.003
0.002
0.275
0.250
0.225
0.200
0.005
0.015
0.025
0.050
0.075
0.004
0.673
0.005
1.005
1.493
0.175
0.1
0.008
2.003
0.150
0.1
0.146
0.183
0.220
0.007
2.6
2.6
0100
0.125
0.150
0.669
1.000
1.486
1.995
0.011
2.326
2.315
0. 1
A’
0.379
Tampón Tris/HC)pH=&0, 0.1 M
Disolución de enáma (1.0 mgE’ml,).
Disolución de BTpNA (4.39 mAl).
Absorbancia a 410 nm debida al tampón, a la acetona, y al sustrato, antes de tener lugar su hidrólisis.
Absorbacia a 410 ¡mi debida a p-nitroanilina liberada tras la hidrólisis enzínrltica del sustra to.
2.40
1.80
oo
<u
1.20
.0
o
.0
0.60
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
IBTpNAI (mM)
Figura 19.- Recta de calibrado para determinar el coeficiente de extinción molar
98
del BTpNA.
Parte experinrntal
De esta forma se produce el fenómeno conocido como explosión (burst”), ya
comentado en la (Sección 1.1.3.3), fenómeno que sucede cuando un intermedio unido a la
enzima se acumula en el transcurso de la reacción. Así, el primer mol de sustrato reacciona
rapidamente con la enzima para formar cantidades estequiométricas del intermedio unido a la
enzima y del producto, y posteriormente el siguiente paso es más lento, pues depende de la
ruptura del intermedio para liberar el catalizador.
Sí k1 ‘es mucho mayor que k
2
la formación del intermedio ES’es facilmente medible
y con lo cual también es sencillo conocer la concentración (molaridad) de centros activos de
la solución enzimática.
De esta forma con sustratos tales como el acetato de p-nitrofenilo (67), N-transcinamnoil-imidazol (73) o la saltona (74), es posible medir de esta forma el número de centros
activos presentes en la preparación enzimática.
Según esto empleando, la siguiente expresión extraída de la bibliografía (74) podemos
obtener la concentración de centros activos de la disolución
[6]
ME~(21)
M~= Molaridad de centros activos
A1= Absorbancia debida a la enzima en (D.O.)
A2= Absorbancia debida a la enzima y al complejo enzima-sustrato en (D.O.)
e~= Coeficiente de extinción molar del complejo enzima sustrato, que a esa longitud
1 cnt’ (74).
de onda presenta un valor de 8564 M
La proporción de centros activos del preparado comercial con respecto a la masa tota]
de sólido, utilizado en la presente Memoria, calculada por este método y contrastada con los
valores obtenidos en otros ensayos, empleando N-trans-cinamoil-imidazol (73) y acetato de
p-nitrofenilo (71) como sustratos, resulté ser (59 ±4)%.
101
Parte experinrntal
2) Enzima inmovilizada
Los ensayos de estabilidad de la enzima inmovilizada se llevaron a cabo con los
distintos derivados incubándolos en estado sólido, en condiciones de almacenamiento a una
temperatura de 2 0C. Se fueron tomando cantidades alícuotas de 10 mg del derivado C6-CT
cada cierto tiempo para realizar el ensayo estándar de actividad hidrolftica con GpNA (229),
(descrito en el apanado de caracterización de los derivados inmovilizados (Sección 111.3.3)).
En lugar de emplear BTpNA, cuya hidrólisis es muy rápida, lo que proporcionaría un gran
error en la medida de absorbancia al tener que filtrar el resultado de la reacción, tratando con
derivados insolubles, es más conveniente emplear como sustrato GpNA, ya que su hidrólisis
es mucho más lenta (229).
Al trabajar con este tipo de derivados insolubles, la reacción directa en la cubeta del
espectrofotómetro es muy compleja siendo necesario un sistema de agitación dentro de la
misma cubeta, apareciendo entonces el fenómeno de “scatering”, debido a las variaciones de
absorbancia causadas por la agitación del derivado insoluble.
B) En condiciones de síntesis
1) Enzima libre
Se realizaron vanos ensayos de estabilidad en condiciones generales de síntesis
(Sección 111.5) para estudiar la influencia del medio orgánico y de la temperatura en una
hipotética desnaturalización de la enzima en dichos procesos. Para ello, se añadieron 20 ml de
medio
AcOEtiTris pH=9.0, 0.1 M, 97/3,
(y/y)
en un reactor tipo tanque agitado.
Posteriormente, se adicionaron 1.5 mg de enzima libre (0.075 mg de enzima libre/mí),
dejando incubar la mezcla a diferentes temperaturas 25, 37 y 50 0C, durante cierto tiempo.
Transcurrido este, se incorporan al reactor 0.1334 g de tLeu-NH
2, 112 ~¿1
de trietilamina, y
0.0627 g. de BTEE. Todo esto se termostatizó a 25
0(2
durante 24 h. y se tomaron muestras
del reactor a diferentes tiempos para analizarías por HPLC, como en el proceso general de
síntesis descrito anteriormente (Sección 111.5). Aunque la enzima se incubó a diferentes
102
.
Parte experinrntal
temperaturas, el ensayo estándar de síntesis de péptidos se repitió en todos los casos a 25
0(2,
obteniéndose la velocidad inicia] de conversión a péptido, la cual nos servirá para construir las
curvas de desactivación enzimáticá, a partir del tiempo cero al cual consideraremos el 100%
de actividad como valor obtenido de velocidad inicial.
2) Enzima inmovilizadp
Se realizamn los mismos ensayos que en el caso de la enzima libre, salvo que en esta
ocasión se empleó el derivado C6-CT (1.3 mg. de derivado/ml que equivalen a 0.113 mg de
enzima/mí).
11L6.2.- ENSAYOS DE ABRASIÓN
Estos ensayos se llevaron a cabo con el fin de comprobar si existe parte de enzima no
unida covalentemente al soporte, o bien para observar si en los procesos a los que se somete
al derivado inmovilizado se produce alguna separación física de la enzima con respecto del
soporte. De producirse estos fenómenos tendriamos resultados erroneos en el proceso
estudiado. Según estos planteamientos se llevaron a cabo dos tipos de ensayos:
a’P Ensayo en condiciones de síntesis
Se tomaron 6 reactores tipo tanque agitado, a los que se les aiiadió 10 ml de medio
AcOEt/Tris pH=9.0, 0.1 M 97/3,
(y/y),
se dejaron agitando 15 minutos, pasado ese tiempo,
se introdujeron 50 mg del derivado C5-CT en tres de ellos y otros 50 ¡ng del derivado C6-CT
en cada uno de los tres restantes, manteniendose en agitación durante 24 h. Pasado ese tiempo
se filtró el contenido a través de una placa vidrio Pyrex del n<> 4.
1) 1 ml del filtrado se utilizó para llevar a cabo el estudio de la cantidad de proteína
presente en el mismo, utilizando el método del Microbiuret descrito anterionnente (228) en
el Apartado 111.2.1.
103
Parte experinental
2) 5 ml también del filtrado se adicionaron a 15 ml del mismo medio, junto con 0.0627
g de RilE (10 mM), 0.1334 g de H-L-Leu-NH2 (40 mM), y 112 gí de trietilamina, para
comprobar la existencia o no de actividad en síntesis de la enzima presente la fase liquida,
siguiendo la metodología descrita en el Apartado 111.5.
b) Ensayo en condiciones de hidrólisis
Para estudiar la influencia del medio acuoso en los posibles procesos de desorción de
la enzima en condiciones de hidrólisis, se operó de manera análoga al caso anterior salvo que
en esta ocasión el medio empleado fue tampón KH2PO4/K2HPO4, pH =7.8 (0.1 M) (10 mí),
en ausencia de un co-disolvente orgánico.
Transcurridas 24 h de incubación se filtró el contenido del reactor y se realizaron:
1) El ensayo de cantidad de proteína presente en la fase líquida, con 1 ml del filtrado,
empleando para ello, el método del Microbiuret (228) (Sección ~i.1).
2) El ensayo de actividad enzimática tuvo lugar en condiciones de hidrólisis con 4.5
ml del filtrado y 0.5 ml de GpNA (0.015 M en DMF) durante 25 minutos a 25
0(2
de
temperatura, (como se describe en la Sección 1111.3 al hablar de la actividad de la enzima
comercial) (229).
m.6.3.- HiDRÓLISIS DE BTEE
m.6.31..- Estudio cinético del proceso de hidrólisis
Se llevó a cabo en las mismas condiciones en las que realizaríamos posteriormente los
procesos de síntesis empleando como medio de reacción AcOEt/Tris pH=9.0, 0.1 M, 2/1,
(y/y). Como ejemplo se tomó el biocatalizador (25-a (1.3 mg de derivado/mí, equivalente
a 0.053 mg de enzima/ml) y a diferencia de los procesos de síntesis no se utilizó nucleófilo,
solamente donador de acilo, (BTEE), cuya concentración se fue aumentando desde 5 hasta 90
104
Parte ewerinrntal
mM.
El avance de la reacción se analizó por HPLC de la misma forma que se describe para
los procesos de síntesis en la Sección 111.5, cuantificando ahora la desaparición del sustrato
(BTEE) con el tiempo.
m.6.3.2.- Influencia de la proporción de acetato de etilo/medio acuoso
Para conocer el comportamiento de nuestros derivados en los procesos de hidrólisis en
función de la cantidad de agua presente en el medio se llevaron a cabo ensayos de hidrólisis
empleando la misma cantidad de derivado con una concentración de donador de acilo 10 mM
en reactor (0.0627 g) y el medio empleado fue diferente en cada caso, variando la relación
AcOEt/Tris pH=9.0, 0.1 M, desde 99/1 hasta 10/90,
(y/y).
El progreso de la reacción se
siguió como en el caso de los procesos sintéticos por HPLC empleando también el naftaleno
como patrón interno.
111.6.4.- REACCIONES DE SÍNTESIS DE PÉPTITDOS CINÉTICAMENTE
CONTROLADAS
m.6.4.l.- Variación de la concentración de enzima
Con la finalidad de estudiar el comportamiento en procesos de síntesis en el seno de
disolventes orgánicos de los derivados preparados, sobre copolímeros de injerto primeramente
centramos nuestro interés en detenninar el intervalo de concentración de catalizador en el cual
este presenta una actividad óptima para la síntesis de péptidos. Así variamos la concentración
de los derivados CL-CT y (22-a, desde 0.48 mg de enzima/ml hasta 0.044 mg de enzima/mi,
para un volumen total de 20 ml. El medio empleado fue AcOEt/Tris pH=9.O, 0. lM, en
proporción 2/1,
(y/y).
Como donador de acilo se empleó BTEE (10 mM) y como nucleófilo
H-bLeu-NH., (40 mM).
Empleando estas condiciones llevamos a cabo las reacciones de slntess a 250C de
temperatura siguiendo el esquema general descrito en la Sección 111.5.
105
Parte experhzrntal
111.6.4.2.- Ensayos con diferentes sustratos
Como donadores de acild se estudiaron el éster etílico de la N-benzoil-L-tirosina
(BTEE), el éster etílico de la N-acetil-L.fenilalanina (APEE) y como nucleófilos L-leucinamida
(H-.L.Leu-NH2) y talaninarnida (H-t.Ala-NiH2) (en forma de clorhidrato por lo que también
añadimos una cantidad equimolecular de trietilamina necesaria para neutralizar el HCI
procedente del nucleófilo y no modificar el pH); la relación donador de acilo/nucleófilo
empleada fue 1/4, (10 y 40 mM en reactor respectivamente). Estas reacciones tuvieron lugar
en el seno de un sistema bifásico formado por AcOEt/Tris pH =9.0, 0.1 M, en proporciones
2/1,
(y/y)
usando como catalizador el derivado Cl-CT (E=38.0% de injerto) (2.75 mg de
derivado/mí, 0.24 mg de enzima/mí).
Para conocer la influencia del porcentaje de injerto con respecto a la reactividad de la
enzima se realizó el mismo ensayo que en el párrafo anterior empleando como derivado C5-CT
(E=54.S% de injerto), (1.3 mg de derivado/mí, equivalente a 0.053 mg de enzima/mí) y
como medio AcOEt/Tris pH=9.0, 0.1 M, 99/1,
(y/y).
Además de estas reacciones se realizaron otras empleando el derivado C4-CT, (1.3 mg
de derivado/mi, 0.24 mg de enzima/mí) como catalizador, RilE (10 mM) como donador de
acilo y como nucleófilos (40 mM): H-tLcu-NI{2, H-L.Met-NH2, H-L-Ser-NH2, H-L-Gly~2’
H-L-Asp-NH2, H-L-Arg-NH2. El medio fue AcOEt/Tris pH=9.0, 0.1 M, 97/3, (vi y).
El proceso se siguió como se detalia en la Sección 111.5.
111.6.4.3.- Ensayos con diferentes disolventes
Para conocer el comportamiento de nuestros derivados y de la enzima libre frente al
logPdel disolvente (234), se llevaron a cabo reacciones en el seno de diferentes disolventes,
tales como: 1,1,1-tricloroetano (logP=2.49), acetato de etilo (logP=0.73), etanol (logP=
0.32), acetonitrilo (logP=
-
0.34), 1 .4-butanodiol (logP=
-
-
0.92), N,N-dimetilformantida
(logP= 1.01), empleando BTEE (10 mM) como donador de acilo, H-LrLeu-NH2 (40 mM)
-
como nucledifio y como catalizadores: a) Cl-CT (2.75 mg de derivado/ml equivalente a 0.2.t
mg de enzima/mí) 99/1,
(y/y),
disolvente orgánico/Tris pH =9.0, 0.1 M, b) C5-CT (1.3 mg
106
Parte experinrntal
de derivado/ml equivalente a 0.053 mg de enzima/mí) 97/3,
(y/y),
disolvente orgánico/Tris
pH=9.0, 0.1 M, c) y la «-quimotripsina libre (0.075 mg de enzima/mI) 97/3,
(y/y),
disolvente orgánico/Tris pH =9.0, 0.1 M. El resto de condiciones son las mismas que las
descritas en el Apartado 111.5.
m.6.4.4.- Variación del porcentaje de disolvente
Es ampliamente reconocida la importancia de la cantidad de agua presente en el seno
de la reacción para conseguir una buena relación péptido/ácido. Así, para profundizar en este
aspecto se realizaron experimentos con los derivados: CL-CT, C2-CT, C3-CT y (24-CT (0.24
mg de enzima/mí) empleando diferentes proporciones de medio desde 99/1 hasta 2/1
(y/y),
AcOEt/Tris pH =9.0, 0.1 M, y con el derivado C5-CT (0.053 mg de enzima/mi) siendo en
este caso las proporciones de medio objeto de estudio; 99/1, 1/1,
(y/y)
y tampón Tris pH =9.0
0.1 M saturado con acetato de etilo.
En todos los casos los sustratos empleados fueron RilE como donador de acilo y H-LLeu-NH2 como nucleófilo, en concentración 10 y 40 mM respectivamente. El resto de
condiciones coincidieron con las del apartado anterior.
¡11.6.4.5.- Síntesis de péptidos a diferentes temperaturas
Se llevo a cabo la síntesis del dipéptido modelo Bz-LTyr-LrLeu-NTH2, empleando
BTEE (10 mM) y H-JAeu-NH2 (40 mM), como medio AcOEt/Tris pH=9.0, 0.1 M, 99/1,
(y/y).
El derivado empleado en todas las reacciones fue C4-CT (1.3 mg de derivado/ml
equivalente a 0.24 mg de enzima/mí), y el parámetro que se modificó en cada caso fue la
temperatura de la reacción, realizando ensayos a 4, 25 y 37
por HPLC como en los experimentos anteriores.
107
0(2
analizándose los resultados
Parte experinrntal
111.6.4.6.- Variación de Ja concentración de donador de arijo
Se realizó según se describe en la Sección 111.5, teniendo en cuenta que en esta ocasión
el partnetro que se modificó fue la concentración de donador de acilo (BTEE) desde 5 hasta
20 mM, manteniendo constante la concentración de nucleófilo (H-L-Lcu-N?H2) en 40 mM. El
derivado elegido fue C5-CT (1.3 mg de derivado/mi o lo que es lo mismo 0.053 mg de
enzima/mí) en un medio AcOEt/Tris pH = 9.0, 0.1 M, 97/3
(y/y).
El progreso de las reacciones se siguió por HPLC según se describe en la Sección
m.s.
111.6.4.7.- Variación de la concentración de nncleófilo
Para conocer la afinidad de] nucleófilo por el complejo acil-enzima a lo largo del
proceso, se llevó a cabo la síntesis del dipéptido modelo Bz-L-Tyr-L~Leu-NiH2, partiendo de
BThE (10 mM) y concentraciones crecientes de nucleófilo H-L-Leu-NH2 desde 5 mM hasta
50 mM, como sustratos. Como medio se empleó AcOEt/Tris pH9.0, 0.1 M, 97/3,
(y/y).
El derivado que catalizó estas reacciones fue C5-CT (1.3 mg de derivado/ml equivalente a
0.053 mg de enzima/mi, en todos los casos).
El avance de las reacciones se siguió por HPLC según se describe en la Sección m.s.
REACCIONES
DE
SÍNTESIS
DE
PÉPTIDOS
TERMODINAMICAMENTE CONTROLADAS
Estos ensayos se realizaxon como los anteriores, empleando el derivado C5-CT (1.3 mg
de derivado/ml equivalente a 0.053 mg de enzima/mí), el medio de reacción fue AcOEt/Tris
pH=9.0, 0.1 M, y como donador de adío se utilizó la N-acetil-L-tirosina en forma de ácido
(10 mM), y como nucleáfilo Lieucinanúda en forma de clorhidrato (50 mM). Se aumenta la
cantidad de nucleófilo para favorecer este tipo de reacciones.
108
Parte experinrntal
111.6.6.- REACIONES MÚLTIPLES DE SÍNTESIS DE PÉPTIDOS Y
POSTERIOR PURIFICACIÓN DE LOS MISMOS
111.6.6.1.- Reutilización de los derivados de a-guimotripsina inmovilizada
sobre conolimero~
La forma más práctica para conocer si un derivado posee buenas propiedades mecánicas
consiste en realizar ensayos de reutilización en las condiciones generales de síntesis, (Sección
111.5) empleando los derivados Cl-CT, C2-CT (0.24 mg de enzima/mí) en una proporción de
disolvente orgánico, 4/1,
(y/y)
AcOEt/Tris pH=9.0, 0.1M, y el derivado C4-CT (0.24 mg
de enzima/mi) utilizando como medios de reacción; AcOEt/Tris pH =9.0, 0.1 M, y 1,1,1
-
tricloroetano/Tris pH=9.0, 0.1 M, 99/1, (y/y). Tras un primer ciclo de síntesis, se filtré a
través de una placa de vidrio Pyrex del n0 4 el contenido del reactor, quedando el péptido y
el derivado en la parte superior y pasando a los líquidos de lavado el resto de los componentes;
el residuo sólido se lava con SO ml de disolvente 3 veces, y posteriormente se vuelve a lavar
con 50 ml de tampón otras 3 veces con el fin de eliminar al máximo el péptido y disolvente
que pueda retener el derivado, para que continúe siendo activo en reacciones posteriores.
La toma de muestras y el avance de la reacción se siguió por HPLC como se describe
en la Sección 111.5.
111.6.6.2.- Síntesis consecutivas dentro del mismo reactor
A fin de conocer la posibilidad de reutilizar el catalizador sin necesidad de separarlo
del seno de la reacción se diseñé una estrategia para llevar a cabo reacciones consecutivas
dentro del mismo reactor. Así, la primera síntesis se realizó siguiendo la metodología general
de síntesis, empleando como medio AcOEt/Tris pH=9.0, 0.1 M 97/3,
(y/y)
y =20 mí, una
relación donador de adio (ETEE ó APEE)/nucleófxlo (H-L-Leu-NIH
2 6 H-L-Ala-N112) de 1/4,
una cantidad de derivado C4-CT de 0.0253 g, (0.113 mg de enzima/mí) y 112 ¡¿1 de
trietilamina, siguiendo el progreso de la reacción por HPLC. Una vez consumido todo el
donador de acilo, en ese mismo reactor se adicioné la misma cantidad de donador de adío
109
Parte experinrntal
empleada en la primera síntesis; por otro lado, de nucítófilo se añadió la cuarta parte que en
la primeva síntesis para mantener la relación donador de acilo/nucleófilo en 1/4, y por lo tanto
sólo se adicionaron 28 gl de trietilanxina, analizándose por HPLC el progreso de la reacción.
Este ciclo consecutivo se repitió hasta 11 veces en el caso del dipéptido Bz-LrTyr-L.Ala-N112.
ffi.6.6.3.- Purificación del néptido obtenido en las síntesis consecutivas
El péptido obtenido de la forma descrita en el apanado anterior es relativamente
insoluble en el acetato de etilo, estando este disolvente casi saturado con un 3% de (Tris/MCI
pH=9.0, 0.1 M) (elacetatodeetilosaturadoconesetampónadmiteun(3.91 + 0.05%)
(y/y)
de fase acuosa, medido por el método Karl-Fisher, en un aparato ATI ORIÓN AF8).
Primeramente, se añaden 50 ml de tampón (Tris/HCI pH=9.0, 0.1 M) a una ampolla
de decantación que contiene el crudo de la reacción. La mezcla se agita varias veces y se
separan las dos fases, repitiendo este proceso dos veces más; de esta forma, a la fase acuosa
pasan las sales del ácido fruto de las reacciones secundarias de hidrólisis, el exceso de
nucleóffio que no reacciona y el clorhidrato de trietilamina. En la fase orgánica se encuentran
tanto el dipéptido como el derivado inmovilizado, ambos suspendidos, más algunas trazas de
éster (soluble en acetato de etilo) sin reaccionar que se eliminan lavando otras tres veces con
0 4.
acetato de etilo y filtrando a través de una placa de vidrio Pyrex del n
Para separar el dipéptido del derivado enzimático, se añaden 25 ml de DMF y se filtra
lentamente. Esta operación se repite otras dos veces, y así conseguimos separar el dipéptido
del derivado enzimático, ya que este último no es soluble en DMF. Para eliminar el disolvente
la mezcla se concentra a vacio a 50
0(2
con la ayuda de tolueno, que forma un azeótropo con
DMF. Posteriormente, el sólido de color blanquecino se congela y se liofiliza durante 48
horas.
110
Parte experinrntal
111.7.- ENSAYOS REALIZADOS CON DER1NADOS DE a-OUIMOTRII’SINA
INMOVILIZADA SORRE GELES DE AGAROSA
111.7.1.- HIDRÓLISIS DE BTEE
111.7.1.1.- Estudio cinético del proceso de hidrólisis
Se realizaron exactamente los mismos ensayos que con los derivados inmovilizados
sobre copolímeros de injerto descritos en la Sección 111.6.3.1, salvo que en esta ocasión los
catalizadores fueron ACU2-CT y AGMl-CT (8.85 mg de derivado/mí, equivalentes a 0.076
mg de enzima/ml en reactor, en ambos casos). También, al igual que ocurría anteriormente
con el otro grupo de derivados, se empleó BTEE como sustrato, variando su concentración
desde 5 hasta 90 mM en reactor.
111.7.1.2.- Influencia de la oroporción de medio acetato de etilo/medio
Para conocer el comportamiento de los derivados preparados empleando como soporte
geles de agarosa en los procesos de hidrólisis, en función de la cantidad de agua presente en
el medio, se emplearon 0.177 g de los derivados AGU2-CT y AGMl-CT (0.076 mg de
enzima/mI) en cada reacción y la concentración de donador de acilo empleada fue 10 mM en
reactor (0.0627 g de BTEE). En este tipo de reacciones, de hidrólisis, obviamente no se
empleó nucícófilo y el medio usado fue diferente en cada caso, variando la relación
AcOEt/Tris pH=9.0, 0.1 M desde 99/1 hasta 10/90
(y/y).
El progreso de la reacción se siguió
como en el caso de los procesos sintéticos por HiPLC empleando también el naftaleno como
patrón interno.
111
.?
Parte eiperinrntal
m.7.2.-REACCIONES DE SÍNTESIS DE PÉPTIDOS CINIÉTI(2AMENT¡
CONTROLADAS. EFECTO DE DIVERSAS VARiABLES
m.7.2.1.- Variación de la cantidad de enzima añadida
Para estudiar la influencia en el proceso de síntesis de la concentración de catalizador
se realizaron varios ensayos con el derivado AGUl-CT, en los que la cantidad de enzima
presente en el reactor varió desde 0.48 mg de enzima/ml hasta 0.044 mg de enzima/ml (desde
0.354 g hasta 0.031 g de derivado), para un volumen total de 20 ml. El medio empleado fue
AcOEtITris pH =9.0, O.lM en proporciones 2/1,
(y/y).
Como donador de acilo se empleó
BTEE (10 mM) y como nucícófilo H-L-Leu-NH2 (40 mM).
Empleando estas condiciones se llevaron a cabo las reacciones de síntesis a 250(2 de
temperatura siguiendo el esquema general descrito en la Sección 111.5.
111.7.2.2.- Ensayos con diferentes sustratos
Como donadores de acilo se emplearon el éster etílico de la N-benzoil-L-tirosina
(BTEE), el éster etílico de la N-acetil-tfenilalanina (APEE) y como nucleófilos Lrleucinamida
(H-L.Leu-NIQ y L~aianinamida (H-L.Ala-NIi2) en forma de clorhidrato, por lo que también
añadimos una cantidad equimolecular de trietilamina para neutralizar el HCI procedente del
nucleófllo y no variar el pH. La relación donador de acilo/nucleófilo empleada fue (1/4), 10
y 40 mM en reactor respectivamente.
Los disolventes utilizados en estos experimentos fueron 1,1,1 -tricloroetano y la
metilisobutilcetona en proporciones 99/1, (y/y) disolvente orgánico/Tris pH=9.0, 0.1 M.
El derivado empleado en todos los casos fue AGUI-(2T (8.85 mg de derivado/ml
equivalentes a 0.24 mg de enzima/mí). El desarrollo del proceso sigue el esquema general
(Sección 111.5)
112
Parte experinrntal
m.7.2.3.- Ensayos con aferentes disolventes
También como en e] caso de los derivados obtenidos con copolímeros de injerto el
disolvente habitual fue acetato de etilo (logP=0.73), empleando como medio acuoso tampón
(Tris/HCI pH=9.0, 0.1 M), en proporción disolvente orgánico/tampón de 99/1,
(y/y),
aunque
también se han empleado puntualmente para estudiar la influencia del logP; 1,1,1 -tricloroetano
(logP=2.49), metilisobutilcetona (logP= 1.38), 1 ,4-butanodiol (logP=
dinietilfonnanúda (logP=
-
-
0.92), N,N-
1.01), (234), empleando BTEE (10 mM) como donador de acilo
y H-L.Leu-NH
2 (40 mM) como nucleófilo, el derivado utilizado fue AGUl-CT (8.85 mg de
derivado/mí, o lo que es lo mismo 0.24 mg de enzima/mí) como catalizador del proceso. El
resto de condiciones son las mismas que las descritas en la Sección 111.5.
111.7.2.4.- Variación del oorcentaie de disolvente
Se han llevado a cabo por un lado reacciones con el derivado AGU1-CT empleando
diferentes concentraciones de derivado (1.6, 3.6, 8.85 mg de derivado/mí, o lo que es lo
mismo, 0.044, 0.097, 0.24 mg de enzima/mi), utilizando como medio de reacción AcOEtJTris
pH=9.O, 0.1 M en distintas proporciones 99/1, 4/1, 2/1 y 1/1,
(y/y);
los sustratos empleados
fueron HIlE como donador de acilo y como nucledf;los H-L-Leu-NH2 y II-DAla-NR2 en
concentración 10 mM (donador de acilo) y 40 mM (nucleófilo).
Por otro lado, empleando los derivados AGU2-CT y AGMl-CT (8.85 mg de
derivado/mi equivalentes a 0.076 mg de enzima/ml en todos los casos), se realizaron
experimentos similares en los que el medio fue AcOEt/Tris pH =9.0, 0.1 M en distintas
proporciones 97/3, 1/1,
(y/y)
y tampón Tris/HCl pH=9.0, 0.1 M saturado con acetato de
etilo, utilizando como sustratos BiTE (10 mM) y H-LLeu-NH2 (40 mM).
El resto de condiciones coincidieron con las del Apartado 111.5.
111.7.2.5.- Variación de la concentración de donador de acilo
Se realizó siguiendo las directrices de la Sección 111.5 modificando en esta ocasión la
113
Parte experimental
concentración de donador de acilo (BTEE) desde 5 mM hasta 20 mM, manteniendo constante
la concentración de nucleófilo (H-L-Leu-N112) en 40 mM. Los derivados empleados también
fueron AGU2-CT y AGMl-CT (8.85 mg de derivado/ml o lo que es lo mismo 0.076 mg de
enzima/mi), y como medio se utilizó AcOEt/Tris pH=9.0, 0.1 M 97/3
(y/y).
111.7.2.6.- Variación de la concentración de nucleófilo
Como en el caso de los derivados de a-quimotripsina inmovilizada sobre copolímeros
de injerto se varió la concentración de nucleófilo (H-t-Leu-NH2) desde 5 mM hasta 50 mM,
manteniendo constante la concentración de donador de acilo BiTE (10 mM).
Como medio se empleó AcOEt/Tris pH =9.0, 0.1 M, 97/3,
(y/y).
Los derivados que
catalizaron estas reacciones fueron AGU2-CT y AGMl-CT (8.85 mg de derivado/mí, 0.076
mg de enzima/mí, en todos los casos).
El avance de las reacciones se siguió por HPLC según se describe en la Sección ffi.5.
111.7.3.-
REACCIONES
DE
SINTESIS
DE
PÉPTIDOS
TERMODINÁMICAMENTE CONTROLADAS
Estos ensayos se realizaron con los derivados AGU2-CT y AGMl-CT (8.85 mg de
derivado/mi, 0.076 mg de enzima/mí), empleando como medio de reacción AcOEt/Tris
pH =9.0, 0.1 M, 97/3,
(y/y),
como donador de acilo se utilizó la N-acetil-L-tirosina (Ac-L-
Tyr-OH) (10 mM), y como nucieófilo L-leucinamida en forma de clorhidrato (50 mM). La
cantidad de nucleófilo es mayor que la empleada en las reacciones que transcurren bajo control
cinético ya que aumentando la concentración de uno de los sustratos se obtienen mejores
rendimientos (235).
114
Parte experinrntaJ
111.8.- REACCIONES CON SUSTRATOS NO NATURALES
m.sa.- SÍNTESIS QUÍMICA DE LOS ÉSTERES. SUSTRATOS DE LAS
REACCIONES ENZIMÁTICAS
a) Los sustratos fueron los siguientes ésteres: N-(4-clorobutanoil)-.L-triptofanato de
metilo, N-(3-indolilmetil)glicinato de etilo, (Cis 1,3) 1-metil-2,3,4,9-tetrahidro-lH-f3carbolina-3-carboxilato de metilo, que fueron suministrados por el grupo de la Dra. Avendaño.
b) Los ésteres etílicos racémicos de los ácidos: ác. (+)-2-fenilbutírico, ác. (±)-3-
fenilbutírico, ác. (+) tetrahidrofurano-2-carboxílico, ác. (+) tetrahidrofurano-3-carboxílico
y el ác. (-i-) 1 ,2,3,4-tetrabidroisoquinolina-3-carboxílico, fueron sintetizados siguiendo el
siguiente protocolo general:
A una suspensión de 0.6 moles del correspondiente ácido en 200 ml de etanol se
adiciona, a temperatura ambiente, gota a gota y con agitación, 0.12 moles de cloruro de
tionilo. La mezcla se refluye durante 12 horas; pasado este tiempo, se concentra a sequedad
y se anaden 200 ml de cloroformo saturado en amoniaco. La agitación se mantiene durante 2
horas, para a continuación filtrar a través de un filtro de pliegues. La concentración a sequedad
del filtrado conduce a la obtención de los ésteres etílicos de los ácidos correspondientes, que
se purifican redisolviendo el contenido sólido resultante de la concentración, en diclorometano
(50 mí), a los que se adicionaron otros (3
X
50) ml de una solución alcalina de bicarbonato
potásico (1 M), agitando cada vez convenientemente. Posteriormente se dejó reposar, para
lograr la separación de ambas Ñses y así decantar a continuación. A la fase orgánica resultante
de la tercera decantación, en la cual se encuentran los ésteres, se la sometió otra vez a la
acción del rotavapor, para obtener el éster puro que se liofilizó, para someterle a las pruebas
de análisis.
c) Los ésteres (R) mandelato de etilo, (~ mandelato de etilo, (R,S) mandelato de etilo,
(¡<.3) mandelato de bencio y (¡43) mandelato de isoamio, fueron suministrados por el grupo
del Dr. Guisán.
115
Parte experimental
111.8.2.- HIDRÓLIsIS ENZIMATICA EMPLEANDO SUSTRATOS NO
CONVENCIONALES
Los dos primeros grupos de ésteres del apanado anterior se intentaron hidrolizar
empleando enzima nativa y los derivados inmovilizados, sometiéndolos a dos metodologías de
hidrólisis diferentes:
a> Condiciones de hidrólisis similares a las descritas por Salvador y cols. (209) en la
hidrólisis del éster etílico de la N-benzoil-Ltirosina, con la enzima libre y con derivados de
«-quimotripsina inmovilizada sobre agarosa.
Las reacciones se llevaron a cabo a 25
0(2
en un reactor tipo tanque agitado
empleando:
-
10 ml de DMF.
-
10 ml de tampón Tris/HCI pH9.0 0.1 M.
-
10 mM de sustrato.
-
5 mg de a-quimotripsina libre.
El avance de la reacción se siguió por HPLC, como en el caso general de síntesis
(Apartado 111.5). A diferencia de lo descrito en esa Sección la muestra (200 gí) fue recibida
en un vial que contenía solamente 800 b~ de acetonitrilo. La absorbancia fue leída a una
longitud de onda de 220 nm, en el caso de los derivados de los ácidos del tetrahidrofurano, el
resto de sustratos, que si poseen algún resto aromático, se analizaron a 254 nm, de forma
similar a la metodología estándar.
El porcentaje de hidrólisis se calculó a partir del área del pico de éster a tiempo cero,
(antes de añadir la enzima), que representa el 100% del sustrato.
b) En busca de mejores resultados se utilizaron condiciones más drásticas, aumentando
el porcentaje de agua presente en la reacción, empleando como disolvente orgánico acetato
de etilo.
116
Parte experinrntal
1) Enzima libre
Las condiciones de reacción fueron:
-
50 mM de sustrato.
-
20 ml de Tris/HCI pH==9.0 0.1 M saturado con acetato de etilo (el agua pura saturada
con acetato de etilo admite hasta un 8%
-
(y/y)
(236).
5 mg de a-quimotripsina libre.
Para el análisis del curso de la reacción se siguió el esquema antenor.
Como los resultados mejoraron se empleó este segundo método con el grupo de los
mandelatos y con los derivados inmovilizados sobre copolímeros y geles de agarosa.
2) Enzima inmoviizad~
Los ensayos se realizaron exactamente igual que en el caso del la enzima libre, a
diferencia del catalizador; empleando el derivado CS-CT (1 .3 mg de derivado/ml equivalentes
a 0.053 mg de enzima/mI) como derivado inmovilizado sobre copolímeros de injerto y AGMí
(8.85 mg de derivado/ml equivalentes a 0.076 mg de enzima/mí), como representante de los
derivados inmovilizados sobre geles de agarosa.
117
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