Sin título-1 - Facultad de Medicina

Modulación Colinérgica de la Eficacia Sináptica:
Pistas para la Reconfiguración de una Red Neuronal
Mesopontina en la Rata.
1
2
1
Borde, M ; Yamuy J. ; Kunizawa, H. .
1
2
Facultad de Medicina, Universidad de la República - Laboratorio de Neurofisiología Celular & Sináptica, Dpto. Fisiología; Uruguay; Veterans Administration of Greater Los Angeles
Healthcare System; USA.
I. Antecedentes y Objetivos.
GABA
LDT- Glutamato
PPT ACh
In vivo, se ha mostrado que la modulación colinérgica del la subdivisión oral de un
núcleo de la formación reticulada pontina (NPO) promueve la aparición de un estado
comportamental con la fenomenología del sueño de movimientos oculares rápidos
(S-REM) en tanto que la aplicación local de monoaminas previene su aparición y
promueve la irrupción de un estado comportamental similar a la vigilia. Los
ACh
mecanismos celulares y sinápticos que subyacen a este control modulatorio dual
mediante el cual una misma red puede participar en la organización de estados
comportamentales disímiles aún se desconocen. Nos propusimos en una
preparación in vitro: i) la identificación de las células del NPO que reciben contactos Promotor
monosinápticos procedentes del LDT-PPT (núcleos tegmentales laterodorsal y de REM
pedúnculopontino), ii) caracterización de las respuestas postsinápticas a la activación
de las aferente originadas en este complejo tegmental (receptores involucrados,
eficacia, facilitación por pulsos pareados) y iii) evaluar la modulación mediada por
colinomiméticos y agentes monoaminérgicos de las propiedades intrínsecas de las
células del NPO y de estos contactos sinápticos aferentes.
II. Rodaja de la unión mesopontina.
II.A. Morfología
Monoaminas
1
2
LDT
3
SCP
Supresor
de REM
NPO
MoV
LDT
NPO
40 m
NPO
MoV
Ejecutiva para varios
componentes de sREM
LDT
1-Esquema de la rodaja.
2-Fotografía de rodaja.
3-Imagen DIC-IR de la
m
rodaja (cal. 200 µm).
MoV
MoV
NPO
*
200 m
500 m
Materiales y Métodos:
En rodajas transversales de la unión mesopontina de ratas (P7-P14) de 350-500m montadas en la plataforma de un microscopio equipado con DIC-IR se
registraron neuronas del NPO en modalidad Whole Cell Patch (WCP). Se analizaron las respuestas sinápticas de las neuronas del NPO ante estímulos eléctricos
pareados (intervalo 100-150 ms) aplicados en la región del LDT-PPT y se calculo el PPR (Pair Pulse Ratio) como R2/R1. Las respuestas sinápticas excitadoras
se aislaron farmacológicamente (Picrotoxina 50-100M) y se utilizo medio intracelular basado en gluconato. Las inhibidoras se aislaron por perfusión con ácido
kynurénico (5 mM) y medio intracelular basado en KCl (150 mM). Las respuestas sinápticas se analizaron en fijación de voltaje con potenciales de mantenimiento
(Vh) -60 y -70 mV para las excitadoras e inhibidoras respectivamente. Se inyecto yuxtacelularmente por presión carbacol (agonista colinérgico, CCh 1mM),
GABA (1 mM), Baclofen (agonista GABA B, 100-500M), glutamato (10 mM).
III. Tipos Celulares del NPO.
Neurona LTS.
Resistencia de entrada:
310.49 ± 45.07 Mohm
LDT
2
25 m
ChAT
20 mV
electrical
stimulation
LDT
C.
Merge
20 mV
IIB. Electrofisiologia y Farmacologia
1
-65 mV
Neurobiotina
electrical
stimulation
NPO
Paired stimuli 50 ms delay
Neurona No LTS.
Resistencia de entrada:
259.79 ± 35.76 Mohm
A1.
El inmunomarcaje
para ChAT y el marcaje retrógrado con

neurobiotina (sitio de inyección *) revelan la presencia del
núcleo motor del trigémino del complejo LDT/PPT y de
proyecciones con el NPO.
E l
a n á l i s i s
inmunohistoquímico de
las rodajas marcadas,
reveló que células
colinérgicas y no
colinérgicas del LDT
proyectan al NPO.
Vm
IPSC inv.
Kcl 150mM
EPSC
Gluconato
3 ms
20 pA
20 pA
20 mV/ms
dVm/dt
20 mV
3
NPO
0.5 nA
20 ms
20 ms
LDT
A2.
1- El estimulo eléctrico del LDT-PPT genera una respuesta sináptica excitadora y/o
inhibidora en las neuronas del NPO. 2- El estimulo eléctrico del NPO genera
respuesta antidrómicas en neuronas del LDT (2/30). 3- Inyecciones por presión de NPO
glutamato (10mM) o CCh en la región del LDT, modula la frecuencia de descargas de
las neuronas del NPO.
0.1 nA
20 mV
*
-70 mV
20 mV
200 ms
30
8
pressure
Inst. freq. (Hz)
200 ms
10
25
Inst. freq. (Hz)
-63 mV
200 ms
6
4
2
0
Glu 10mM
0
5
5
10
time (s)
0.1 nA
CCh
control
A.
200 ms
A1. Respuestas neuronales a una familia de pulsos hiprpolarizantes de una neurona LTS. A2. Al finalizar la inyección
de los pulsos de corriente se observa una respuesta despolarizante lenta todo o nada sobre la que se produce la
descarga de un PA de sodio. B. Esta respuesta se observa en presencia de TTX (1 M). C y D. Protocolos de corrientes
similares aplicados a una neurona No-LTS. Note la ausencia de la LTS (Low Threshold Spike).
R1
R2
IPSC inv.
KCl 150mM
electrical
stimulation
LDT
NPO
Los IPSCs se bloquean con
picrotoxina y sus caracteristicas
no muestran diferencias
estadisticamente significativas
para ambos tipos celulares (K-S
P>0.05).
Amplitud
(pA)
Latencia
(ms)
τon (ms)
72.8  10.9
8.9  0.4
τdec (ms)
PPR (R2R1/R1)
73.8  20.9
100
n=13
n=11
1.8  0.2
24.4  1.9
24.2  2.5
0.22  0.08
V. GABA inhibe las neuronas del NPO.
GABA puff
80
60
40
10 pA
5
10
Time (s)
15
20
3
2
1
0
0
5
10
Time (s)
15
20
Control
CCh 10 min
15min
cumulative probability
LTS
No LTS
200
100
0
100
200 300
time (s)
PPR (R2/R1)
n=9
Control BAC
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
control
1 min
2 min
0.8
0.6
Vh @ 0 mV, 20s
0.4
0.2
0
400
0
n=9
Control BAC
cumulative probability
300
1
40
80
120 160
sIPSC (pA)
1
0.8
0.6
control
BAC
0.4
0.2
La ausencia de DSI
(Depolarization-induced
Suppression of Inhibition)
sugiere que las terminales
GABAérgicas del LDT-PPT
carecen de receptores CB1
(para endocanabinoides).
El protocolo de DSI sin
embargo es capaz de
bloquear transitoriamente
a l g u n o s I P S C s
espontáneos.
Si bien las terminales LDTPPT inhibidoras no parecen
presentar receptores de tipo
GABA B estos parecen
presentarse en otras
terminales inhibidoras.
0
50
100 150 200 250 300
sIPSC (pA)
1.2
1.3
1.2
1.1
1.0
1.0
0.8
0.9
0.6
0.8
B.
Control
CCh
CCh
A.
140
n=8
120
Control Negro
CCh rojo
100
C.
80
20 pA
2.4
n=8
2.2
60
40
VI. IPSCs inhibidores del LDT-PPT no presentan DSI ni
sensibilidad
a
Baclofen.
Vh @ 0 mV, 20s
1.4
1.4
Facilitación en 38% de las neuronas (8/21).
PPR (R2/R1)
0
0
Cambio del IPSC (%)
10
8
6
4
2
0
1.6
n=5
1.5
A- Respuesta sináptica a estímulos pareados en tres condiciones, control, carbacol y lavado. BCambio % de la amplitud del IPSC. C- El análisis del PPR distingue dos poblaciones de neuronas:
aquellas que el PPR se reduce (C1) y aquellas que el PPR aumenta (C2). El incremento del PPR
sugiere un efecto inhibidor presináptico. La supresión de la inhibición con reducción del PPR
sugiere un mecanismo doble de facilitación presináptica e inhibición postsináptica.
Cell-attach
1s
1.8
Control
20
La inyección
yuxtacelular de
GABA o Muscimol
inhibe la descarga
de potenciales de
acción de las
neuronas del NPO.
Los registros se
realizaron en
condiciones de cellattach.
n=7
2.0
10.6  0.7
2.1  0.2
0.35  0.10
n=13
PPR (R2/R1)
NPO
1.6
2.2
No-LTS (n=23)
Cambio del IPSC (%)
LTS (n = 21)
C2.
C1.
B.
20 ms
MoV
PPR (R2/R1)
S
puff
CCh
1mM
10 pA
40 ms
20 pA
Trace nº
20
30
time (s)
Lavado
IV. El estimulo del LDT genera una respuesta
sináptica GABAérgica en las neuronas del NPO.
Mean freq.
(spikes s-1)
CCh 1 mM
0
10
Supresión en 62% de las neuronas (13/21).
200 ms
10 mV
IPSC amp. (pA)
15
0
B.
-65 mV
IPSC (pA)
10
VII. Los IPSCs del LDT en las neuronas del NPO son modulados por carbacol.
TTX
160
140
120
100
80
60
40
20
0
15
D.
0.1 nA
0
20
20
2.0
A. Respuesta sináptica en control y
durante el efecto de Cch. B. Cambio
porcentual del IPSC. C. El PPR se
reduce para toda las neuronas
analizadas. Estos sugiere un
mecanismo de facilitación
presinaptico
1.8
1.6
1.4
1.2
0
Control
CCh 2-5 min
CCh 10 min
10 ms
1.0
0.8
Control
CCh
Conclusiones.
1- Las neuronas del NPO independientemente de su fenotipo electrofisiologico reciben contactos monosinapticos
GABAérgicos inhibidores procedentes del complejo LDT-PPT.
2- Las terminales GABAérgicas involucradas en esos contactos parecen carecer de receptores de tipo GABA B y
CB1 característicos de entradas sinápticas inhibidoras en otras estructuras del SNC.
3- Las entradas inhibidoras a las neuronas del NPO son moduladas por agonistas colinérgicos. Esta modulación
puede resultar en supresión o facilitación de la entrada inhibidora a través de diversos mecanismos pre o
postsinapticos. Esta variedad de efectos modulatorios podrian coexistir.
Financiado por: Fondo Clemente Estable (FCE2009_3115), PEDECIBA.
Correspondencia: mborde@fmed.edu.uy - jyamuy@ucla.edu - htatsuya@fmed.edu.uy
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