AMINOÁCIDOS PÉPTIDOS Y PROTEINAS M. EN C. ISRAEL VELÁZQUEZ MARTÍNEZ 1 AMINOÁCIDOS, PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS. Los aminoácidos, como su nombre lo indica, son bifuncionales. Contienen un grupo amino básico y un grupo carboxílico ácido. NH2 H O OH R N H OH O Un α-aminoácido primario L-Prolina Un α-aminoácido secundario Con fines de clasificación, las cadenas con menos de 50 aminoácidos se llaman polipéptidos, mientras que el término proteína se reserva a cadenas mas largas. O O O O H3C + OH H3C H2N NH OH OH NH2 NH2 Alanina Glicina un dipéptido (un enlace amida) Un polipéptido (muchos enlaces amida). Estructura de los aminoácidos. Como los aminoácidos contienen un grupo ácido y un grupo básico, experimentan una reacción ácidobase intramolecular y se encuentran principalmente en la forma de un ión dipolar, o Zwitterion (del alemán zwitter, híbrido): O O H3C H3C OH H2N H Alanina (sin carga) O + H3N - H (zwitterion) 2 Los iones dipolo (zwitterions) de los aminoácidos son sales internas y por ello tienen muchas de las propiedades físicas asociadas con las sales. Poseen momentos dipolares grandes, son solubles en agua e insolubles en hidrocarburos, y son sustancias cristalinas con puntos de fusión altos. Además los aminoácidos son Anfóteros: pueden reaccionar como ácidos o como bases, dependiendo de las circunstancias. En solución ácida En solución básica En la siguiente tabla se representan las estructuras de los 20 aminoácidos que se que encuentran en las proteínas. Todos son α-aminoácidos. Diecinueve de los 20 aminoácidos son aminas primarias, RNH2, y sólo difieren en la naturaleza del sustitúyete unido al carbono α, llamado Cadena lateral. Cadena lateral Un α-aminoácido primario Prolina, Un α-aminoácido secundario Además de los 20 aminoácidos que se encuentran en las proteínas, hay otros aminoácidos que no son proteínas y que tienen importancia biológica. O O - I O O + H3N HO - Ácido γ-aminobutírico + NH3 HS O O I + NH3 Homocísteina - I O I Tiroxina 3 ESTRUCTURA DE LOS AMINOÁCIDOS. Nombre Abreviaturas PM Estructura pKa pKa pKa PI Sol. P.f. COOH NH3+ cad. lat. H2O, g/dL a 25°C Aminoácidos Neutros. O H3C OH Alanina Ala (A) NH2 89 2.34 9.69 --- 6.01 17 297 d 2.02 8.80 --- 5.41 2.4 236 1.96 10.28 8.18 5.07 2.17 9.13 --- 5.65 3.6 186 2.34 9.60 --- 5.97 25 233 d 2.36 9.60 --- 6.02 4 284 2.36 9.60 --- 5.98 2 337 2.28 9.21 --- 5.74 3 283 O H2N OH Asparagina Asn (N) 132 O NH2 O HS Cisteína Cys (C) OH 121 NH2 NH2 O O Glutamina Gln (Q) Muy --Soluble OH 146 NH2 O Glicina Gly (G) 75 H2N OH CH3 O H3C OH Isoleucina Ile (I) 131 NH2 O H3C OH Leucina Leu (L) CH3 131 NH2 O S H3C Metionina Met (M) 149 OH NH2 4 Nombre Abreviaturas PM Estructura pKa pKa pKa PI Sol. P.f. COOH NH3+ cad. lat. H2O, g/dL a 25°C Aminoácidos Neutros cont… O OH Fenilalanina Phe (F) NH2 165 1.83 9.13 --- 5.48 3 283 1.99 10.60 --- 6.30 162 220 2.21 9.15 --- 5.88 5 228 2.09 9.10 --- 5.60 2.83 9.39 --- 5.89 2.20 9.11 2.32 9.62 O H N OH Prolina Pro (P) 115 O HO Serina Ser (S) OH 105 NH2 CH3 O HO Treonina Thr (T) 119 OH NH2 Muy 257 Soluble O OH Triptofano Trp (W) NH2 204 NH 1 289 10.07 5.66 0.04 344 --- 9 315 O OH Tirosina Tyr (Y) 181 NH2 HO CH3 O H3C Valina Val (V) 117 OH NH2 5.96 5 Nombre Abreviaturas PM Estructura pKa pKa pKa PI Sol. P.f. + COOH NH3 cad. lat. H2O, g/dL a 25°C Aminoácidos ácidos. O Ácido aspártico HO Asp (D) 133 OH O O Ácido glutámico Glu (E) 147 1.88 9.60 3.65 2.77 0.4 269 2.19 9.67 4.25 3.22 0.7 247 2.17 9.04 12.48 10.76 15 230 d 1.82 9.17 6.00 287 2.18 8.95 10.53 9.74 NH2 O HO OH NH2 NH2 O Aminoácidos básicos. HN Arginina Arg (R) NH 174 OH NH2 O H N Histidina His (H) 155 N OH NH2 7.59 0.4 O H2N OH Lisina Lis (K) 146 NH2 Muy 255 Soluble Problema 1. ¿Cuántos de los aminoácidos que se muestran en la tabla contienen anillos aromáticos? ¿Cuántos contienen azufre? ¿Cuántos contienen alcoholes? ¿Cuántos contienen cadenas laterales hidrocarbonadas? Con excepción de la glicina, los carbonos de los α-aminoácidos son centros quirales. Por lo tanto, son posibles dos formas enantioméricas, pero la naturaleza sólo utiliza una para la construcción de las proteínas. En las proyecciones de Fischer, los aminoácidos que se encuentran en forma natural se representan colocando el grupo COOH en la parte superior y la cadena lateral abajo, como se dibuja un carbohidrato, y luego se coloca el grupo –NH2 a la izquierda. Debido a la similitud estereoquímica con los azúcares L, llamamos a los α-aminoácidos que se encuentran en forma natural como aminoácidos L. 6 COOH CHO H H OH CHO NH2 HO R CH2OH D-gliceraldehído COOH H H2N CH2OH D-aminoácido H R L-gliceraldehído L-aminoácido Problema 2. Dieciocho de los 19 L-aminoácidos tienen configuración S en el carbono α. La císteina es el único L-aminoácido con una configuración R. Explique la razón. Problema 3. El aminoácido Treonina, ácido (2S, 3R)-2-amino-3-hidroxibutanoico tiene dos centros quirales. Dibuje una proyección de Fischer para la Treonina. ¿Cuántos estereoisómeros podrían existir? Dibuje las proyecciones de Fischer e identifique los centros quirales como R o S. Problema 4. Dibuje formulas con enlaces de cuña (tetraédricas) y proyecciones de fischer que representen la configuración de los átomos de carbono de la L-valina, L-leucina y L-isoleucina. Aminoácidos esenciales. Son aminoácidos que el organismo no puede sintetizar. Reacción de transaminación. COOH COOH COOH COOH Enzimas transaminasas H H2N R Aminoácido Antiguo O + O (muchos pasos) R1 R cetoácido antiguo cetoácido nuevo H2N + H R1 aminoácido nuevo Fenilcetonuria. O O OH NH2 OH Enzimas NH2 HO 7 REACCIÓN DE TRANSAMINACIÓN. Un interesante el papel de las iminas como intermediarios es el de la reacción de transaminación, de importancia biológica. La transaminación es un proceso por el cual se transfiere un grupo amino de una molécula a otra. En los sistemas biológicos el grupo amino de un aminoácido se transfiere al grupo carbonilo de otra molécula. La secuencia, es promovida por una enzima, la transaminasa, es un método de formación de nuevos aminoácidos. NH2 O O O H3C + HO glutamato transaminasa OH OH O Alanina Ácido-α-cetoglutárico. O O O H3C O HO OH HO + NH2 Ácido pirúvico Ácido glutámico Todas las transaminasas importantes parecen compartir la misma coenzima, el fosfato de piridoxal. Las coenzimas son pequeños constituyentes no proteínicos de las enzimas, con frecuencia indispensables para la actividad enzimática. H O OH O P HO HO N O CH3 Fosfato de piridoxal. La transaminación biológica no es la simple transferencia de un grupo amino de una molécula a otra. El grupo carbonilo de la coenzima piridoxal forma primero una imina con el grupo amino del aminoácido “donador”. La reacción subsiguiente de este aducto con el compuesto carbonílico “receptor” conduce a la formación de un nuevo aminoácido, regenerándose el fragmento de piridoxal. El piridoxal es el transportador del grupo amino de un reactivo a otro. La secuencia, de numerosos pasos, supone una serie de adiciones e isomerizaciones reversibles. 8 Mecanismo general de una reacción de transaminación. O PRP PRP OH R N + H H2N R O H2O + H O OH PRP N PRP R N R O OH H H H O OH O N PRP PRP R + H H2O NH2 + H OH OH O PRP PRP NH2 N R1 + H + R1 N O PRP H O OH R1 PRP + H O OH N R1 O OH H H N H2O H OH PRP R1 H O H PRP O H H O R OH H2N O R1 + H2O H O OH PRP = fosfato de piridoxal. 9 Reacción de transaminación catalizada por la Aspartato aminotransferasa. H3C CH3 H3C CH3 B: N - O O O P OH O - O H - O - O + N H O CH3 O H - O NH2 + O NH - O O OH P O - O + CH3 N H H3C CH3 B + aldimina O O - O + NH O OH O O O + O - O NH3 - + CH3 N H O H2O OH P O - O NH - P - - + O O O - O - O O - O - O H O paso lento - O O CH3 N H O OH P O - O quinoide + H3C + B: NH3 - O O O - O O H OH P H3C O O - O H3C + N H CH3 N H CH3 O CH3 - + NH - O O OH P - O O H3C + CH3 B + O H3C H3C - O + + NH NH O - O CH3 OH P O N H + NH3 CH3 O O - O - O H3C - OH H3C - O - P O O H O CH3 N H NH2 H3C CH3 + O NH - + N H CH3 O O OH P - O O + N H CH3 10 ACIDEZ, BASICIDAD Y pKa. Lewis. Ácido: acepta electrones. Base: cede electrones. Brosnted-Lowry. Ácido: cede protones Base: recibe protones. H-A Ácido + H2O Base H3O+ + Aácido base conjugado conjugada Keq = [H3O+][A-] [HA][H2O] La concentración del agua permanece casi constante. [H2O]= 55.6 M a 25°C. Ka = Keq [H2O] = [H3O+][A-] [HA] log Ka = log [H3O+][A-] [HA] log Ka = log [H3O+] + log [A-] [HA] - log Ka = - log [H3O+] - log [A-] [HA] pKa = pH – log [A-] [HA] pH – pKa = log [A-] [HA] pH = pKa + log [A-] [HA] Ecuación de Henderson – Hasselbalch. 11 Un ácido más fuerte (de mayor Ka) tiene pKa menor. Un ácido más débil (de menor Ka) tiene mayor pKa. Compuesto en una solución de pH por debajo del pKa se encuentra protonado (ionizado). Compuesto en una solución de pH por encima del pKa se encuentre no protonado (no ionizado). Factores que afectan el pKa: Efecto resonante. Efecto inductivo y electrostático. Efecto estérico. Puentes de hidrógeno intramoleculares. Hibridación. Efecto inductivo. O O O Cl 4.5 1.68 2.8 F 3C OH Cl Cl Cl pKa: OH OH OH OH OH O Cl Cl O 2N H3C O O 1.3 0.9 0 Efecto resonante + O NH3 NH3 O H3C H3C + + NH3 O O R1 OH OH R1 R O O R NO2 + O pKa: 4.5 16 11 - 19.20 N O 1.11 2.5 4.60 Efecto estérico O H3C H3C OH CH3 H3C OH CH3 H3C H3C pKa: 4.5 O CH3 7.0 12 Puentes de hidrógeno. O O OH OH HO OH pKa: 4.5 pKa: 9.3 3.0 13.4 Hibridación. H3C H3C + HN H3C pKa: C + NH + N H CH3 9.8 5.2 - 10 AMINOÁCIDOS. INFLUENCIA DE LA CADENA LATERAL. O O H N O H N OH OH OH NH2 NH pKa: 1.99 pKa: 10.60 pKa: 2.83 pKa: 9.39 pKa: - - - pKa: 1.82 pKa: 9.17 pKa: 6.00 NH2 O HO OH O HN O NH OH NH2 NH2 pKa: 1.88 pKa: 9.60 pKa: 3.65 NH2 N pKa: 2.17 pKa: 9.04 pKa: 12.48 13 Problema 5. Pronostique los productos de reacción de: (a) prolina, (b) tirosina, (c) arginina y (d) triptofano con un exceso de HCl; y con un exceso de NaOH. Problema 6. Escriba las formulas estructurales para las siguientes ecuaciones: (a) fenilalanina con un equivalente de NaOH. (b) Producto de (a) con un equivalente de HCl. (c) Producto de (a) con dos equivalentes de HCl. PUNTO ISOELÉCTRICO. pH bajo (protonado) pH alto (desprotonado) Punto Isoeléctrico PI = pKa1 + pKa2 2 Zwitterion neutro. El punto isoeléctrico (PI) de un aminoácido depende de su estructura; y es el promedio de las dos constantes de disociación ácida que incluyen el zwitterion neutro. En cuanto a los aminoácidos con una cadena lateral que sea un ácido fuerte o un ácido débil, el PI es el promedio de los dos valores de pKa más bajos. En el caso de los aminoácidos con una cadena lateral básica, el PI es el promedio de los dos valores de pKa más altos. Aminoácido ácido Ácido aspártico. Aminoácido neutro Alanina Aminoácido básico Lisina 14 Así como los aminoácidos tienen sus PI, las proteínas también tienen un PI global debido a los numerosos residuos ácidos o básicos que pueden contener. Aprovechamos la ventaja de las diferencias de puntos isoeléctricos para separar una mezcla de aminoácidos (o una mezcla de proteínas) en sus constituyentes puros mediante la técnica de la Electroforesis. Tira de papel a pH = 6.02 Cuando se aplica un potencial eléctrico, los aminoácidos con cargas negativas (los que se han desprotonado a causa de que el pH del buffer es más alto que sus PI) migra lentamente hacia el electrodo positivo. Al mismo tiempo que los aminoácidos con cagas positivas (los que se han protonado porque el pH del buffer es menor que su PI) migran hacia el electrodo negativo. Los diferentes aminoácidos migran a diferentes velocidades, lo que depende de sus puntos isoeléctricos y del pH del buffer acuoso. Así es posible separar una mezcla de diversos aminoácidos. Problema 7. Para las siguientes mezclas de aminoácidos, prediga usted la dirección y la velocidad relativa de migración de cada componente: (a) (b) (c) (d) valina, ácido glutámico e histidina a pH= 7.6 glicina, fenilalanina y serina a pH= 5.7 glicina, fenilalanina y serina a pH= 5.5 glicina, fenilalanina y serina a pH= 6.0 Problema 8. La glicina, al igual que la alanina tiene un punto isoeléctrico de 6.0. Trace estructuras de las formas predominantes de la glicina a pH= 2.0, 6.0 y 10.0. Problema 9. ¿Cómo podría explicar el hecho de que el triptofano tenga menor punto isoeléctrico que la histidina, pese a que ambos tienen átomos de nitrógeno en el anillo de cinco miembros? ¿Cual nitrógeno del anillo de cinco miembros de la histidina es más básico? 15 Un aminoácido reacciona con dos equivalentes del hidrato de ninhidrina, para dar el púrpura de Ruhemann, un producto azul-violeta. Esta reacción se emplea como ensayo para detectar la presencia de aminoácidos en una muestra desconocida. O O O R OH O OH + H3N O H2O ninhidrina O O - + O O - H N + R CO 2 + H2O O O O + púrpura de Ruhemann. Si se conocen los valores exactos de pKa para los sitios ácidos de un aminoácido, se puede calcular los porcentajes de las formas protonadas, neutra y desprotonadas en una solución a un pH dado utilizando la estuación de Henderson-Hasselbalch: pH – pKa = log [A-] [HA] pH = pKa + log [A-] [HA] Para ver como se utiliza la ecuación de Henderson-Hasselbalch, encontremos las especies que están presentes en una solución 1M de alanina a pH= 9.00. de acuerdo a los valores antes mencionados, la alanina protonada tiene un pKa1 de 2.34, y la alanina neutra tiene un pKa2 de 9.69: H3C H3C OH O - + H3N O H3C O + - + + H3N O H3O + + H2O H3N O H3C O pKa1= 2.34 - + H2O H2N + H3O + pKa2= 9.69 O 16 Como el pH de nuestra solución está mucho más cerca del pKa2 que del pKa1, necesitamos usar pKa2 para nuestros cálculos. De acuerdo a la ecuación de Henderson-Hasselbalch, tenemos: log [A-] = pH – pKa = 9.0 – 9.69 = - 0.69 [HA] De tal modo que [A-] = antilog (-0.69) = 0.20 [HA] Además, sabemos que: [A-] + [HA] = 100% (1.0 M) [HA]= 83% y [A-] = 17% Se pueden efectuar cálculos similares a otro pH, con lo que se llega a la curva de titulación siguiente: Problema 10. La Treonina tiene un pKa1 = 2.1 y un pKa2 = 9.1. Utilice la ecuación de HendersonHasselbalch para calcular la proporción de formas protonadas y desprotonadas a pH= 1.5 y pH = 10.0. 17 SÍNTESIS DE AMINOÁCIDOS. 1. Síntesis de Strecker. α-aminonitrilo aldehído α-aminoácido O O C N H3O NH4Cl / KCN H NH2 H2O Fenilacetaldehído α-aminonitrilo + OH NH2 (R,S)-fenilalanina (53%) Problema 11. El aminoácido poco común conocido como L-Dopa (3,4-dihidroxifenilalanina) es un fármaco útil contra el mal de Parkinson. Indique cómo podría sintetizarse a partir de 3,4dihidroxifenilacetaldehído. 2. Aminación de ácidos α-halogenados. Uno de los métodos más antiguos comienza con la α-bromación de un ácido carboxílico por tratamiento con Br2 y PBr3 (La reacción de Hell-Volhard-Zelinsky). La sustitución del α-bromo ácido con amoniaco produce un α-aminoácido. Ácido 4-metilpentanóico Ácido 2-bromo-4metilpentanóico (R,S)-leucina 45% Problema 12. Indique como podrían obtenerse los siguientes aminoácidos a partir de los ácidos carboxílicos apropiados: (a) Valina (b) Fenilalanina (c) Alanina (d) Serina 18 3. Síntesis de Gabriel. Glicina Cloroacetato de etilo Ftalimida potásica Glicina (85%) Ácido ftálico Fenilalanina O CH3 CH3 - N O O O Br O O Br O CH3 + K O CCl4 O O CH3 DMF Br malonato de dietilo O O CO2C2H5 1) NaOEt / EtOH N CH CO2C2H5 N H3O C (CO2C2H5) 2 2) C6H5CH2Cl + calor O O O O KOH / H2O N CH O O HO o NH2NH2 OH NH2 Fenilalanina Ácido Glutámico 19 O O CO2C2H5 CH2CH2CO2C2H5 1) NaOEt / EtOH N CH N (CO2C2H5)2 2) CH2=CHCO2C2H5 CO2C2H5 H3 O C + calor O O O KOH / H2O N CH O O O O OH OH CH2CH2CO2C2H5 o NH2NH2 HO NH2 4. Síntesis del amidomalonato Ácido (R,S)-aspártico (55%) Acetamidomalonato de dietilo 3 EtOH + CO2 + CH3COOH Problema 13. Indique los halogenuros de alquilo necesarios para producir los siguientes αaminoácidos por el método de síntesis amidomalónica. (a) leucina (b) Histidina (c) Triptofano (d) Metionina Problema 14. La serina puede sintetizarse por una simple variación del método amidomalónico utilizando formaldehído en vez de halogenuro de alquilo. ¿Cómo podría lograrse esto? 5. Aminación reductiva de α-cetoácidos: Biosíntesis. O O HO O OH + NH3 O L-glutamato deshidrogenasa O HO OH NADH NH2 Ácido-α-cetoglutárico. Ácido glutámico O O H3C O H2N OH NH3 H3C OH NaBH4 20 Ácido pirúvico (R,S)-Alanina Problema 15. Proponga una síntesis para cada uno de los siguientes aminoácidos partiendo del malonato de dietilo: Valina, Metionina y ácido aspártico. Problema 16. La prolina puede prepararse por una secuencia que utiliza ftalimida, malonato de dietilo y 1,3-dibromopropano. Indique los pasos de esta síntesis. Síntesis Enantioselectiva de aminoácidos. La síntesis de α-aminoácidos a partir de un precursor aquiral por cualquiera de los métodos descritos produce una mezcla racémica (una mezcla racémica en partes iguales de enantiómeros R y S). Existen dos métodos para obtener aminoácidos enantoméricamente puros. Una manera consiste en resolver la mezcla racémica en sus enantiómeros puros. Sin embargo un método mejor consiste en usar una síntesis enantioselectiva para preparar directamente sólo el enantiómero S deseado. Resolución de aminoácidos R, S. La resolución puede hacerse al convertir el aminoácido en su amida y permitiendo que el aminoácido racémico intervenga en una reacción ácido-base con un solo enantiómero de una amina quiral. Se forman dos sales diasteroméricas que luego se separan y se vuelven a convertir en el aminoácido por hidrólisis del grupo amida. Mezcla de enantiómeros de aminoácidos Mezcla de enantiómeros de aminoácidos Mezcla de sales diasteroméricas Las enzimas catalizan selectivamente la hidrólisis de amidas formadas de L-aminoácidos (S). Mezcla de enantiómeros de aminoácidos Mezcla de enantiómeros de aminoácidos Aminoácido S Aminoácido R 21 Se utiliza una aminoacilasa obtenida de riñon de cerdo. Síntesis enantioselectiva de aminoácidos. Se utiliza un catalizador en una reacción quiral que contenga temporalmente una molécula de sustrato en un ambiente asimétrico. Mientras se encuentra en este ambiente, el sustrato puede estar más abierto a reaccionar de un lado que en el otro, lo que lleva a un exceso del producto enantiomérico sobre el otro. William Knowles descubrió hace algunos años que los α-aminoácidos pueden prepararse enantioselectivamente mediante la hidrogenación de un ácido Z enamido con un catalizador de hidrogenación quiral. Ácido Z enamido S-fenilalanina 98.7% El catalizador más efectivo para la síntesis enantioselectiva son los complejos de coordinación de Rodio (I) con ciclooctadieno (COD) y una difosfina quiral como el (R,R)-1,2-bis(oanisilfenilfosfonio)etano, el llamado ligando DiPAMP. 22 PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS. Las proteínas y los péptidos son polímeros de aminoácidos en los cuales las unidades individuales de aminoácidos, llamados residuos, están unidas mediante enlaces amida, o uniones peptídicas. Alanina (Ala) Alanilserina (Ala-Ser) Serina (Ser) Aminoácido N terminal Aminoácido C terminal La larga secuencia repetida de enlaces peptídicos forman una cadena, la estructura primaria o esqueleto de las proteínas. Por convencion siempre se escriben los péptidos con el aminoácido Nterminal a la izquierda y el aminoácido C-terminal a la derecha. El nombre del péptido se indica utilizando las abreviaturas para cada aminoácido. 23 Bradiquinina H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH R-P-P-G-F-S-P-F-R Problema 17. Nombre los seis posibles tripéptidos isoméricos con valina, tirosina y glicina. Utilice la notación corta de tres letras para cada aminoácido. Problema 18. Trace la estructura completa de H-Met-Pro-Val-Gli-His-OH ENLACE COVALENTE EN LOS PÉPTIDOS. Consecuencias de la resonancia: • Estabilidad del enlace • Menor basicidad del átomo de nitrógeno • Rotación restringida del enlace C-N (carácter de doble enlace) Configuración Trans. 24 En los péptidos se encuentra un segundo tipo de uniones covalentes cuando se forma un enlace disulfuro RS-SR entre dos redisuos de Cisterna. El enlace disulfuro se forma con facilidad por medio de la oxidación suave de los tioles RSH y se rompen con facilidad mediante una reducción suave. Oxidación moderada Cistina Císteina Oxidación moderada de tioles con Bromo. - - HO R R SH H2O - S Br S Br R R S S R Br R S Los enlaces disulfuro contribuyen a la forma (estructura) de un polipéptido. Oxitocina 25 DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA DE LOS PÉPTIDO: ANÁLISIS DE LOS AMINOÁCIDOS ¿Cuáles aminoácidos están presentes? ¿Cuántos hay de cada uno? ¿Cuál es la secuencia de aminoácidos de la cadena peptídica? Las respuestas a las dos primeras preguntas se obtienen con un Analizador de aminoácidos. William Stein y Standford Moore. Mezcla Estándar equimolecular de 17 αaminoácidos. 26 DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA DE UN PÉPTIDO. 1.- Hidrólisis de los enlaces disulfuro RS-SR con ácido perfórmico. 2.- Hidrólisis del péptido con HCl 6M por 24 horas. 3.- Analizador de aminoácidos. 2-mercaptoetanol Ácido iodoacético 27 Ácido cisteico Ácido cisteico DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS EN PÉPTIDOS: DETERMINACIÓN DE RESIDUOS N-TERMINALES. DEGRADACIÓN DE EDMAN. Isocianato de fenilo Reactivo de Edman derivado de tiazolinona péptido sin el amino ácido N-terminal original 28 La transposición de la anilinotiazolinona en medio ácido acuoso produce el derivado final N-feniltiohidantoina (PTH). PTH se identifica por cromatografía Los péptidos de cadena acortada se vuelven a someter en forma automática a otro ciclo de la Degradación de Edman. La determinación de la secuencia completa de proteínas por este método es poco práctica a causa de la formación de subproductos indeseables que limita el método a un máximo de 50 ciclos. MÉTODO DE SANGER N-aminoácidos 2,4-dinitrofluorobenceno (DNFB) polipéptido Polipéptido marcado Aminoácido N-terminal marcado. Separado e identificado Mezcla de resto de aminoácidos 29 El método de Sanger no es tan utilizado como el de Edman. Dadas las limitaciones de los métodos de Edman y Sanger; primero se rompe una cadena peptídica larga por medio de una hidrólisis parcial en varios fragmentos más pequeños, se determina la secuencia de cada fragmento y éstos se ajustan haciendo coincidir los extremos que se traslapan. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICAS. Enzima Especificidad Tripsina Quimiotripsina Elastasa hidrólisis carboxilo de aminoácidos básicos: Arginina y Lisina. hidrólisis carboxilo de aminoácidos arilo: Fenilalanina, Tirosina y Triptofano. hidrólisis carboxilo de aminoácidos pequeños: Glicina y alanina. Carboxipeptidasa A Carboxipeptidasa B Remueve el aminoácido C-terminal Remueve los aminoácidos C-terminal Arginina y Lisina solamente. Val – Phe – Leu – Met – Tyr – Pro – Gly – Trp – Cys – Glu – Asp – Ile – Lys – Ser – Arg – His Quimiotripsina rompe estos enlaces Tripsina rompe estos enlaces. HIDRÓLISIS PARCIAL 1. Un análisis de los aminoácidos de la angiotensina II revelaría la presencia de ocho aminoácidos diferentes: Arg, Asp, His, Ile, Fen, Pro, Tir y Val en cantidades equimoleculares. 2. Un análisis de extremos N-terminales por el método de Edman indicaría que la angiotensina II tiene un residuo de ácido aspártico en el extremo N-terminal. 3. La hidrólisis parcial de la angiotensina II con ácido clorhídrico diluido produciría los siguientes fragmentos, cuya secuencia puede ser determinada por Degradación de Edman: a. b. c. d. e. H-Asp-Arg-Val-OH H-Ile-His-Pro-OH H-Arg-Val-Tir-OH H-Pro-Fen-OH H-Val-Tir-Ile-OH 30 4. Traslapando las regiones que se superponen de los fragmentos se obtiene la secuencia completa de aminoácidos en la angiotensina II: a. c. e. b. d. H-Asp-Arg-Val-OH H-Arg-Val-Tir-OH H-Val-Tir-Ile-OH H-Ile-His-Pro-OH H-Pro-Fen-OH H-Asp-Arg-Val-Tir-Ile-His-Pro-Fen-OH Problema 19. ¿Cual es la estructura de un pentapéptido que da los siguientes tripéptidos cuando se hidroliza parcialmente? Gli-glu-arg, glu-arg-gli, arg-gli-fen Problema 20. ¿Qué fragmentos resultarían si se rompiera la Angiotensina II con tripsina en un caso, y con quimiotripsina en otro?. Problema 21. Dibuje la estructura del derivado PTH que se puede formar por la degradación de Edman de la Angiotensina II. Problema 22. Indique la secuencia de los hexapéptidos que producen los siguientes fragmentos por hidrólisis parcial con ácido: (a) Arg,Gli,Ile,Leu,Pro,Val forman H-Pro-Leu-Gli-OH, H-Arg-Pro-OH, H-Gli-Ile-Val-OH (b) Asp,Leu,Met,Trp, Val2 forman H-Val-Leu-OH, H-Val-Met-Trp-OH, H-Trp-Asp-Val-OH DETERMINACIÓN DE RESIDUOS C-TERMINALES. carboxipeptidasa 31 Problema 23. Se encuentra que un hexapéptido con la composición Arg, Gli, Leu, Pro tiene prolina en los extremos C y N. La hidrólisis parcial produce los siguientes fragmentos: H-Gli-Pro-Arg-OH H-Arg-Pro-OH H-Pro-Leu-Gli-OH ¿Cuál es la estructura del hexapéptido? Problema 24. Proponga dos estructuras para un tripéptido que por hidrólisis se descompone en Leu, Ala, y Fen pero que no reacciona con carboxipeptidasa ni con fenilisotiocianato. El bromuro de cianógeno hidroliza el enlace peptídico de la Metionina. H – Ala – Lys – Phe – Asp – Met – Val – Arg – Trp – OH BrCN rompe este enlace. Mecanismo de la hidrólisis del enlace peptídico por bromuro de cianógeno. 32 SÍNTESIS DE PÉPTIDOS. Aunque las amidas simples suelen formarse por la reacción entre aminas y cloruros de ácidos, la síntesis de los péptidos es más difícil porque se deben de formar muchos enlaces amida diferentes en orden específico y no aleatoriamente. 2 sitios de unión + 2 sitios de unión = 4 productos distintos. La solución al problema de la especificidad es la protección. 33 Protección NH2 1. Formación de la amida Alanina 2. Desprotección Protección COOH Leucina GRUPOS PROTECTORES EN LA SÍNTESIS DE PÉPTIDOS. Nombre Estructura Abreviatura Reactivo Eliminación Grupos Protectores de aminas. O O Benciloxicarbonilo R Z- , CBZ- O Cl CH3 H3C O tert-Butoxicarbonilo R H3C Boc- O O O CH3 CH3 H2 / Pd-C HBr, HF, HCl O O H3C O O O O H3C H3C Ciano-t-butoxicarbonilo O CH3 Cyoc- CH3 CF3COOH HCl gas BF3 / Et2O / THF H3C CN R CH3 CN Cl O CH3 NaOH / THF 34 O O 9-Fluorenilmetoxicarbonil Fmoc- Piperidina O O p-Toluensulfonilo R Tos- CH3 S Cl Na / NH3 CH3 S O O Grupos protectores de ácidos carboxílicos. Ester ROH / H+ R3O+X- RO- H2O / NaOH H3O+ Preparación de Carbamatos para protección del grupo amino. carbamato O Cl OH O H2N + OH - HCl O NH O O O del Cl2C=O y C6H5CH2OH Glicina Glicina-CBZ O O ZBC NH OH + ZBC - HCl Cl O NH CH3 O O Glicina protegida O CH3 O Cloroformiato de etilo grupo éster activado O O O O O NH O CH3 OH + NH2 O 35 O fenilalanina Gly-Phe con el grupo amino protegido Eliminación del grupo protector carbamato O O HN H2, Pd / C O NH OH O HN CH3 CO2 H2N OH O O ter-butoxicarbonilamida (BOC) Alanina dicarbonato de di-ter-butilo BOC-Ala Fluorenilmetoxcarbonilamida cloroformiato de 9-fluorenilmetilo aminoácido. (cadena lateral protegida si es necesario) aminoácido- FMoc protegido (estable en ácidos) 36 (Grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo) Desprotección. (ruptura del grupo FMoc) piperidina aminoácido libre producto secundario Protección del grupo carboxilo de un aminoácido por formación de un éster. Leucinato de metilo Leucina Leucina Leucinato de bencilo FORMACIÓN DEL ENLAC PEPTÍDICO. Cloroformiato de bencilo 37 Anhídrido mixto de Ala-CBZ EL USO DE AGENTES ACOPLANTES (ACTIVANTES DEL COOH). a) Carbonildiimidazol (CDI) O O O O O R OH N N + R1 R1 CO2 R O NH N NH2 N NH-protegido + CH3 NH-protegido O N calor NH CH3 b) Diciclohexilcarbodiimida (DCC) O O O R1 O R OH + N C N NH2 CH3 NH-protegido calor R1 R O NH + NH-protegido H3C O HN NH C O 38 c) N-(3-dimetilaminopropil)-N´-etilcarbodiimida. (EDCI ó EDAC) O H3C O R1 N R OH NH-protegido O H3C N + C NH2 N R1 O CH3 R O NH CH3 calor NH-protegido H3C + O O H3C C N NH NH CH3 CH3 d) Hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-il-oxi)tripirrolidinfosfonio. (PyBOP) O R O F N N F + O F P- R F CH3 H2N F OH R O F N calor R O NH HN O protegido HN CH3 O protegido N + P N N Resumen de 5 pasos para la síntesis de H-Ala-Leu-OH 1. Proteger el grupo amino de la leucina como su derivado BOC H-Ala-OH + bicarbonato de di-tert-butilo BOC-Ala-OH 2. Proteger el grupo carbonilo de la leucina como su éster metílico 39 H-Leu-OH + CH3OH H-Leu-OCH3 3. Acoplar los dos aminoácidos protegidos usando DCC BOC-Ala-OH + H-Leu-OCH3 BOC-Ala-Leu-OCH3 4. Retirar el grupo protector BOC por tratamiento ácido BOC-Ala-Leu-OCH3 + CF3COOH H-Ala-Leu-OCH3 5. Retirar el éster metílico por hidrólisis básica: H-Ala-Leu-OCH3 + NaOH / H2O H-Ala-Leu-OH Problema 25. Indique el mecanismo de la formación de un derivado BOC para la reacción de Tirosina con bicarbonato de di-ter-butilo. Problema 26. Escriba los cinco pasos que se requieren para la síntesis de H-Leu-Ala-OH a partir de alanina y leucina. Problema 27. ¿Cómo podrían prepararse los siguientes tripéptidos? (a) (b) (c) H-Leu-Ala-Gli-OH H-Gli-Leu-Ala-OH H-Ala-Gli-Leu-OH cadena A 21 aminoácidos cadena B 30 aminoácidos insulina 40 La insulina esta compuesta por dos cadenas que suman un total de 51 aminoácidos unidos pos dos puentes disulfuro. Frederick Sanger determinó su estructura y recibió el premio Nobel en Química en 1958 por su trabajo. SÍNTESIS DE PÉPTIDOS AUTOMATIZADA: TÉCNICA DE FASE SÓLIDA DE MERREFIELD. La síntesis de péptidos se efectúa sobre esferas sólidas de poliestireno, preparado de un modo tal que por cada 100 anillos de benceno uno lleve un grupo clorometilo: CH3 CH3 CH CH2 HC CH2 CH CH2 CH CH2 CH3 CH H3C Cl Cl Síntesis de un tripéptido utilizando la Fase sólida de Merrifield. Aminoácido N-protegido 41 2 Aminoácido N-protegido 2 Aminoácido N-protegido y COOH activado Dipéptido protegido Dipéptido-Resina 3 Aminoácido N-protegido y COOH activado 3 Aminoácido N-protegido Tripéptido protegido 42 Tripéptido-Resina polímero Tripéptido libre Problema 28. La importancia del rendimiento en cada paso de la síntesis de un péptido es muy grande. La preparación de un decapéptido puede implicar de 30 a 40 reacciones químicas. Suponiendo que cada paso pueda realizarse con un rendimiento del 90%, calcule el rendimiento global de una secuencia de 40 pasos. PROTEÍNAS. 9 9 9 9 9 Estructura primaria y secundaria Estructura terciaria y cuaternaria Clasificación y funciones de proteínas Enzimas Desnaturalización de proteínas ESTRUCTURA PRIMARIA. Se refiere a la secuencia en la que están unidos los aminoácidos. 43 Estructura primaria de la bradiquinina: H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH OXITOCINA VASOPRESINA 44 ESTRUCTRURA SECUNDARIA. Es la orientación relativa de los átomos del “esqueleto” (backbone): átomos que forman en enlace peptídico. Depende de: • La región planar en cada enlace peptídico. • La formación de puentes de hidrógeno. • Separación adecuada de grupos R (cadenas laterales de los aminoácidos) HELICE ALFA α Cada oxígeno está unido con un puente de hidrógeno al amino ácido del siguiente giro de la hélice. (Prolina rompe las hélices alfa) 45 Vista lateral vista superior HOJA PLEGADA (LÁMINA) BETA β Cada carbonilo en un enlace peptídico está unido con un puente de hidrógeno al grupo H-N de un amino ácido de una cadena adyacente. 46 Dos o más cadenas peptídicas pueden alinearse formando la lámina Orientación de los puentes de hidrógeno en las láminas Beta β 47 Tipos de Laminas Beta β ESTRUCTURA TERCIARIA. 48 Describe el enrollamiento de toda la proteína en una forma tridimensional (3D). Factores que determinan la estructura terciaria: • Interacciones hidrófobos de las cadenas laterales. • Puentes disulfuro. • Puentes de hidrógeno. • Grupos prostéticos. Puede haber combinaciones de Hélices α y láminas β. ESTRUCTURA CUATERNARIA. 49 Describe como se unen las moléculas de proteínas diferentes en grandes estructuras agregadas. CLASIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS (COMPOSICIÓN) • • Proteínas simples – Constituidas únicamente por amino ácidos Proteínas conjugadas Constituidas por amino ácidos y otros compuestos. – Glicoproteínas (carbohidratos) – Lipopoproteínas (grasas) – Nucleoproteínas (ácido ribonucleico) – Fosfoproteínas (ésteres de fosfato) – Metaloproteínas (hierro) PROTEÍNAS CONJUGADAS: • • • • • Globulina (glicoproteína) Interferón (glicoproteína) Caseína (fosfoproteína) Ferritina (metaloproteína) Hemoglobina (metaloproteína) CLASES CONFORMACIONALES DE PROTÉINAS. 50 • • Proteínas fibrosas (insolubles) – Colágeno: tejido conectivo, tendones – Queratina: cabello, uñas, piel – Elastina: tejido conectivo elástico Proteínas globulares (solubles) – Insulina: hormona reguladora del metabolismo de la glucosa – Mioglobina: transporte de oxígeno – Ribonucleasa: controla la síntesis del RNA ALGUNAS FUNCIONES BIOLÓGICAS DE LAS PROTEÍNAS. • • • • • • Enzimas (catalizadores biológicos) Hormonas (insulina) Proteínas protectoras (anticuerpos) Proteínas de almacenamiento (caseína) Proteínas estructurales (queratina, elastina) Proteínas de transporte (hemoglobina) ENZIMAS. • • • Casi todas son globulares Algunas son conjugadas: – La parte no proteica se llama cofactor – La parte proteica se llama apoenzima – Cofactor + apoenzima = holoenzima Son específicas Posible mecanismo de acción de la quimiotripsina. 51 Posible mecanismo de acción de la tripsina. 52 DESNATURALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS. 53 Es la alteración de la estructura terciaria. La estructura primaria no se altera. ESTRUCTURAS DE PROTEÍNAS EN INTERNET. Protein Data Bank http://www.rcsb.org/pdb/ 54 Problema 29. se cree que la descarboxilación de los α-cetoácidos catalizada por tiamina se inicia con la eliminación de un átomo de hidrógeno ácido del anillo de tiazol de la tiamina. H3C H3C H3C CH3 + H3C N CH3 + N - S C + + H S H a. ¿Por qué es ácido este hidrógeno? b. Proponga un mecanismo para la descarboxilación del ácido pirúvico (CH3COCO2H) mediante tiamina. Se sabe que el intermedio final es la especie A. H3C A= H3C CH3 + N S H3C C OH H La vitamina ácido lipoico es una coenzima en la conversión de A y CoA en acetil coenzima A. indique de que manera el intermedio A puede justificar la formación de acetil coenzima A a partir del piruvato inicial. S S (CH2)4 CO 2H 55