Métodos serológicos para el Diagnóstico de la Bartonelosis. Jenny Merello Flores IMT ¨Alexander von Humboldt¨ Universidad Peruana Cayetano Heredia INTRODUCCION: Bartonella bacilliformis (Bb), bacteria hemotrófica capaz de invadir y replicarse en eritrocitos y células endoteliales humanas. La infección resultante se manifiesta como una enfermedad bifásica (aguda y crónica). Hasta el 2003 se han reportado casos autóctonos en 12 de los 24 departamentos del país: Piura, Cajamarca, Amazonas, La Libertad, Ancash, Lima, Ica, Huancavelica, Huánuco, Junin, Ayacucho y Cuzco. INTRODUCCION: Se hace necesario conocer métodos de diagnóstico rápidos y sensibles. Existen pocos reportes difundidos sobre técnicas de inmuno-diagnóstico para la enfermedad. La detección de anticuerpos contra Bb, tiene como ventajas: *Evitar largos períodos de incubación como en los cultivos; *Obtención de muestras difíciles, o INTRODUCCION: *Implementación de equipos altamente especializados y ambientes especiales para realizar cultivos y pruebas por biología molecular. La desventaja es que la respuesta de anticuerpos es inespecífica en los humanos, hay reacción cruzada!. Bartonella bacilliformis (Microfotografía electrónica) Diagnósticos Serológicos DIAGNOSTICOS SEROLOGICOS: En 1928, Noguchi realizó los primeros estudios sobre inmunidad humoral por fijación de complemento. En 1942, Howe usó la técnica de aglutinación. En 1972, Colichón y Cantella usaron hemoaglutinación. En los últimos años se han desarrollado otras pruebas serológicas como: test de anticuerpos fluorescentes (IFI, IFA), hemoaglutinacion indirecta, ELISA y Western blot. P. Pachas.¨ La Bartonelosis en el Perú¨. Módulos Técnicos, OGE/INS 2000 . INMUNOPRECIPITACION: Knobloch y col. (1985):encuentran una sensibilidad del método en 27.8%. Knobloch y col. (1988): Identifica 6 antígenos de pared celular, Considerando 2 bandas antigénicas para Bb (65 y 75 kDa). Dando resultados específicos. Knobloch J, Solano L, Alvarez O, Delgado E. Antibodies to Bartonella bacilliformis as determined by fluorescence antibody test, indirect haemagglutination and ELISA. Trop Med Parasit 1985;36:183-185 Knobloch J. ¨Analysis and preparation of Bartonella bacilliformis antigens¨. Am. J. Top. Med. Hyg. 1988;39:173-178. IFI, IFA: Chamberlin y col.(2000): Con IFI demostraron 74% de sensibilidad en pacientes con enfermedad de Carrión en Caráz (prevalencia de 38%). 92% de los controles negativos fueron seronegativos. Con IFA, a partir antígeno cultivado en células Vero obtiene 82% sensibilidad para fase aguda y 93% para fase convaleciente, siendo su especificidad del 92%. Chamberlin J, Laughlin l, Gordon S, Romero S, Solorzano N, & Regnery RR. Reserved. Serodiagnosis of Bartonella bacilliformis Infection by Indirect Fluorescence Antibody Assay: Test Development and Application to a Population in an Area of bartonellosis endemicity Journal of Clinical Microbiology, Nov. 2000, p. 4269–4271 Vol. 38, No. 11 American Society for Microbiology. ELISA: Knobloch y col.(1985): Un estudio en Cajamarca reporta una sensibilidad del 54.6% para esta técnica. No encontró reacción cruzada con sueros que contenían anticuerpos contra otras bacterias. Usando HPLC prepara 7 antígenos de los cuales sólo uno de 48 KDa. Reacciona específicamente para Bb cuando se aplica esta técnica Además, antígeno crudo produce reacciones inespecíficas (reacción cruzada contra Chlamydia psittaci). Knobloch J, Solano L, Alvarez O, Delgado E. Antibodies to Bartonella bacilliformis as determined by fluorescence antibody test, indirect haemagglutination and ELISA. Trop Med Parasit 1985;36:183-185 WESTERN BLOT: Knobloch y col.(1988), realizan el primer estudio e identifican 24 proteínas antigénicas a partir de Ag. crudo de los cuales, 6 son detectadas específicas para sueros de pacientes con Bartonelosis (18, 26, 36, 48, 65 y de 75 kDa). Knobloch J. ¨Analysis and preparation of Bartonella bacilliformis antigens¨. Am. J. Top. Med. Hyg. 1988;39:173-178. WESTERN BLOT: Xing y Raoult (2000), usando antígeno crudo encuentran 11 bandas inmunoreactivas, siendo detectados con suero policlonal de ratón anti-Bb (120,104,71, 54, 47 41, 37,27 y 25 KDa). Xing Z and Raoult D. ¨Diferentiation of Bartonella species by a microimmunofluorescence assay, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroforesis and western immunoblotting¨. Clinical an Diagnostic Laboratory Immunology, July 2000, p. 617-624.. WESTERN BLOT: Koset y col (2000):trabajando en áreas no endémicas de Amazonas, encuentra a partir de Antígeno crudo por método de sonicado, dos bandas inmuno-reactivas para Bb:17 y 18 KDa, siendo sensible en un 70% para fase aguda y 94% para fase crónica; y específica en ambos casos en un 100%. Reacción cruzada con Brucella (40%), Salmonella (4%), Chlamydia p.(5%), Coxiella b.(10%). Kosek, M. Lavarello R. Gilman R. Delgado J. Maguiña C. Verastegui M. Lescano A. Mallqui V. Kosek J. Recavarren S. And Cabrera L. ¨Natural History of infection with Bartonella bacilliformis in a nonendemic population¨ . The Journal of Infectious Diseases, 2000; 182:865-872. WESTERN BLOT: Mallqui y col. (2000): Comparan antígeno crudo obtenido por los métodos de sonicado y extracción con glicina. Obteniene una sensibilidad del 94% para fase crónica, en ambos métodos; y una sensibilidad del 70 y 30% para los métodos de sonicado y glicina respectivamente, en la fase aguda. La especificidad fue del 100% en ambos métodos. Observaron reacción cruzada(Brucella 34%,Clamydia 5% y Coxiella 7%, no reaccion con B. Henselae) V. Mallqui, E. C. Speelmon, M. Verastegui, C. Maguiña-vargas, P. Pinell-salles,R. Lavarello, J. Delgado, M. Kosek, S. Romero,y.& R. Gilman. ¨Sonicated Diagnostic Immunoblot for Bartonellosis¨. clinical and diagnostic laboratory immunology,jan. 2000, p. 1–5 vol. 7, no. 1 Inmunoblot para sonicado + - -Bb +A +C CONCLUSIONES: Antígeno crudo: se han detectado hasta 6 antígenos inmuno-reactivos (18,26,36,48,65 y 75 KDa), en suero de pacientes con bartonelosis (Knobloch,1990) Mallqui reporta 7 antígenos inmunoreactivos(entre 13-42 KDa).2 específicos para Bb, fase crónica (17 y 18 KDa.) Pared celular: se han identificado 6 probables antígenos de pared celular(25,46,65,75,99 y 160 KDa), 2 antigenicas para Bb de 65 y 75 KDa. (Knobloch,1988) Membrana externa: se ha encontrado 3 proteínas purificadas (31.5, 42 y 45 KDa),con alta inmunoreactividad para Bb(Minnick, 1994) Conclusiones: LPS de membrana externa: se ha encontrado una proteína de 5 KDa. poco reactiva para pruebas inmune. Citoplasmática:Un proteína de 65 KDa, a sido identificada como inmuno-específica para B.bacilliformis. (Knobloch,1990) Seroprevalencia para Bartonelosis A u to r Año K n o b lo c k 1985 C a ja m a rc a , P e rú S o la n o 1988 G ra y 1988 M in a y a 1993 H u a r i, A n ca sh , P e rú S h u m p illa n , P om a b a m b a , P e rú C a rh u a z , H u a ra z , P e rú Am ano C h a m b a r le in D e lg a d o Lugar P re v a le n c ia 6 3 .6 T é c n ic a P o b la c ió n P o b la c ió n g e n e ra l 2 1 .7 50 49 4 1 .2 5 C o n E L IS A , A F y HI E L IS A AF. HI A g lu tin a c ió n e n la m in a E L IS A E L IS A E L IS A E L IS A 7 7 .2 7 E L IS A 9 1 .4 1997 M a n a b i, E c u a d o r 21 E L IS A 17 E L IS A 1998 O ro y Z a m o ra C h in c h ip e , Ecuador C a ra z , A n ca sh , P e rú B o n g a ra , A m a z o n a s, P e rú 1999 P o b la c ió n g e n e ra l A s in to m á tic o s S in to m á tic o s P o b la c ió n to ta l P e rso n a s s in a n te c e d e n te P e rso n a s con a n te c e d e n te C o n ta c to de casos C o n ta c to de casos T IF P o b la c ió n to ta l 7 7 .6 W e s te rn b lo t 9 4 .6 W e s te rn b lo t P o b la c ió n g e n e ra l P e rso n a s le s io n e s e ru p tiv a s P. Pachas.¨ La Bartonelosis en el Perú¨. Módulos Técnicos, OGE/INS 2000. con Laboratorio de Microbiología Experimental Instituto de Medicina Tropical ”Alexander von Humbolt” Universidad Peruana Cayetano Heredia ¨Western blot como técnica de diagnóstico para bartonelosis¨ OBJETIVOS Objetivo Principal: Encontrar antígenos inmunogénico para Bartonella bacilliformis utilizando la técnica de Western Blot para el diagnóstico de bartonelosis (fase aguda y crónica). Objetivos específicos: Obtener antígenos a partir de cepas estandar y aislados de pacientes con bartonelosis (fase aguda y crónica). Aplicar la técnica de Western blot en el diagnóstico de la bartonelosis para laboratorio. Encontrar el antígeno específico más reactivo para el diagnóstico de la Bartonelosis (fase aguda y crónica) MATERIALES Y METODOS Cepas bacteriales: Se prueba la cepa estandar ATCC 35685 de Bartonella bacilliformis.(Donación Dr. Rito Zerpa) Además de cepas obtenidas a partir de aislados de pacientes que llegan al Laboratorio de Microbiología Experimental, IMT-AvH, UPCH. Condiciones de cultivo: Las bacterias son cultivadas de acuerdo al protocolo referido por Mallqui y col. (2000): Medio bifásico (Medio F1 + RPMI enriquecido con buffer HEPES,Na2CO3 y SFB al 10% ). Siendo incubado a 30°C por 7 a 14 días, 2 repiques en medio líquido (RPMI, HEPES, Na2CO3 y SFB al 10%) por 14 a 21días, 30 °C. Preparación de Antígeno: Células intactas son obtenidas a partir del centrifugado del cultivo,lavado en tres tiempos con buffer SORENSON, resuspendido luego en 5ml de PBS, pH 7.2. El antígeno crudo es obtenido por SONICADO. La concentración de proteína es determinada por el método de BRADFORD.Almacenamiento a –70 El antígeno es preparado en una solución SDS -Tris-HCl (pH 8.0), para una concentración final de proteína de 0.1µg/µL. SDS-PAGE – Inmunotransferencia y blot: Se usan geles al 12%. Proteínas estimadas por el uso de un marcador de peso molecular estandar pre-teñido de amplio rango (6.9 a 201.1 KDa). El antígeno separado por SDS-PAGE es transferido a papel de nitrocelulosa 0.45µm. Tiras conteniendo el antígeno son enfrentadas a sueros 1/50 en controles positivos y negativos para Bartonelosis. Uso de conjugado anticuerpos para humano horseradishperoxidasa IgG Anticuerpos específicos para Bartonella bacilliformis son visualizados con DBA por 10 minutos. Identificación de banda diagnóstica: Bandas antigénicas obtenidas son comparadas con bandas de grupos de sueros de pacientes con bartonelosis confirmados por lámina y cultivo (controles positivos para fase aguda y crónica), y grupos de sueros de personas sin bartonelosis de zona no endémica (controles negativos). Por la referencia, se tiene en cuenta reacciones cruzadas con Chlamydia psittaci, Bartonella henselae, Coxiella burnetti y Brucella sp. RESULTADOS PRELIMINARES Resultados Preliminares: Se obtiene baja producción de antígeno por el método bifásico. Se revelan por SDS-PAGE 30 bandas proteícas que van de 8.6 a 201 KDa. Obtenemos: 7 bandas antigénicas de <20, 36, 40,56, 65, 70, y <100 Kd para sueros con fase aguda. Obtenemos: 9 bandas antigénicas de 17, 18, 36, 46, 60, 65,70,80,110 KDa. para sueros con fase crónica. Controles negativos revelan bandas de 14, 42, 75 KDa. Discusiones: En nuestro avance, inmunoblot por sonicado revela presencia de nuevas bandas antigénicas, tanto para fase aguda como crónica de la enfermedad. Coincidimos con Mallqui en la obtención de las 2 bandas antigénicas específicas para fase crónica (17 y 18 KDa) Con Knobloch con la banda 36 y 65 KDa para fase aguda. A pesar de la alta sensibilidad y especificidad de la técnica se espera a futuro trabajar con antígenos purificados que permitan mejores resultados para el diagnostico de la enfermedad.