LA Ca2+-ATPasa DE LA MEMBRANA PLASMATICA COMO

REVISION (BIOLOGIA CELULAR)
Acta Científica Venezolana, 55: 304-314, 2004
LA Ca2+-ATPasa DE LA MEMBRANA PLASMATICA COMO
ENZIMA CLAVE EN LA HOMEOSTASIS INTRACELULAR DEL
CALCIO. ESTIMULACION POR ETANOL Y OTROS EFECTORES
Gustavo Benaim
Laboratorio de Señalización Celular y Bioquimica de Parasitos
Centro de Biociencias. Instituto de Estudios Avanzados (IDEA) y Laboratorio de Biofísica.
Instituto de Biología Experimental, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela.
Apartado 47114. Caracas, Venezuela.
e-mail gbenaim@reacciun.ve
Recibido: 27/05/04; Revisado: 06/07/04; Aceptado: 23/11/04
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RESUMEN: La Ca -ATPasa de la membrana plasmática (PMCA) es una enzima clave en la regulación de la concentración basal de Ca .
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Hemos demostrado que el etanol estimula la actividad de la Ca -ATPasa y el transporte de Ca asociado. Cuando el etanol y la
calmodulina (CaM) esta presentes simultáneamente, el efecto estimulatorio es aditivo, lo cual apoya que estos efectores actúan a través de
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distintos mecanismos. Mediante el uso de isoformas diferentes de la Ca -ATPasa se demostró que la variante PMCA2CI resultó ser mas
sensible al efecto del etanol. Es Interesante resaltar que esta es la isoforma mas predominante en cerebro, cerebelo y tejido nervioso. Por
otra parte, el fosfatidiletanol se forma mediante la transfosfatidilación de ciertos fosfolípidos cuando el etanol está presente, por una
reacción que es catalizada por la fosfolipasa D. Este fosfolípido se acumula en la membrana de las células de mamífero luego del consumo
de alcohol. Hemos demostrado que el fosfatidiletanol también estimula a la bomba de calcio de la membrana plasmática. Este fosfolípido
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incrementa la afinidad de la enzima por Ca en mayor medida que la que se obtiene en presencia de CaM u otro fosfolípido acídico natural.
Los esfingolípidos han sido reconocidos recientemente como importantes segundos mensajeros, actuando en varios sistemas en
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combinación con el Ca . En vista del hecho que la PMCA es estimulada por etanol, y tomando en cuenta que los esfingolípidos poseen
grupos hidroxilo libres, decidimos estudiar el posible efecto de la ceramida y la esfingosina sobre esta bomba de calcio. Demostramos que
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la ceramida estimula a la Ca -ATPasa de una manera dosis-dependiente y de forma aditiva a la CaM y al etanol, cuando se compara con
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estos dos efectores añadidos separadamente. La ceramida afecta tanto la afinidad de la enzima por el Ca , como su Vmax. Mas aún, este
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esfingolípido también estimula el transporte de Ca en vesículas invertidas de eritrocitos. Por lo contrario, la esfingosina, la cual se ha
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reportado en varios sistemas que actúa de manera antagónica a la ceramida, mostró un efecto inhibitorio sobre la Ca -ATPasa. Esta
inhibición también se observó en presencia de CaM. Estos resultados tomados en conjunto sugieren que la ceramida y la esfingosina
actúan antagónicamente sobre la PMCA, lo cual coincide con el efecto opuesto que estos esfingolípidos poseen frecuentemente en
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diferentes sistemas. Palabras clave: Ca -ATPasa; calmodulina; etanol; esfingolípidos; ceramida.
THE PLASMA MEMBRANE Ca2+-ATPase AS A KEY ENZYME IN THE INTRACELLULAR CALCIUM
HOMEOSTASIS. STIMULATION BY ETHANOL AND OTHER EFFECTORS
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ABSTRACT: The plasma membrane Ca -ATPase (PMCA) is a key enzyme in the regulation of the intracellular Ca concentration. Studies
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from this laboratory have shown that ethanol stimulates the Ca -ATPase activity and its associated Ca -transport. When ethanol and
calmodulin (CaM) were present simultaneously, the stimulatory effect was additive, supporting that these two effectors act through different
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mechanisms. The use of different isoforms of the Ca -ATPase showed that the variant PMCA2CI was more sensitive to the effect of
ethanol. Interestingly, this is the predominant isoform in brain, cerebellum and nervous tissues. On the other hand, phosphatidylethanol is
formed by transphosphatidylation of phospholipids when ethanol is present, a process catalyzed by phospholipase D. This phospholipid
accumulates in the plasma membrane of mammalian cells after ethanol consumption. It was demonstrated that phosphatidylethanol also
stimulates the plasma membrane calcium pump. The phospholipid increases the affinity of the enzyme for calcium to a larger extent than in
the presence of calmodulin or other natural acidic phospholipids. Sphingolipids have been recently recognized as important second
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messengers acting, in many systems, in combination with Ca . In view of the fact that the PMCA is stimulated by ethanol, and since
sphingolipids possess free hydroxyl groups, the study of the possible effect of ceramide and sphingosine on this calcium pump was
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undertaken. It was shown that ceramide stimulates the Ca -ATPase in a dose-dependent manner, and additively to the activation observed
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in the presence of CaM or ethanol, when compared to any of these effectors alone. Ceramide affects both the affinity for Ca and Vmax of
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the enzyme. Furthermore, this second messenger also stimulates Ca transport in inside-out plasma membrane vesicles from erythrocytes.
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Conversely, sphingosine, a reportedly antagonist to ceramide in many systems, showed an inhibitory effect on the Ca -ATPase activity. This
inhibition was also observed on the CaM-stimulated enzyme. Taken together these results suggest that ceramide and sphingosine act
antagonistically on the PMCA. This is in accordance with the frequently reported opposite effect of these sphingolipids in different systems.
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Key Words: Ca -ATPase, calmodulin; ethanol, sphingolipids, ceramide.
INTRODUCCION
El calcio es probablemente el mas importante entre
todos los mensajeros intracelulares, en los mecanismos
de traducción de señales en las células eucarióticas. Su
función como mensajero está garantizada por la
capacidad de la célula de mantener, en virtud de sus
diferentes
mecanismos
homeostáticos,
una
concentración citoplasmática de este catión 4 órdenes de
magnitud por debajo de su concentración extracelular18.
Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática
Como catión bivalente es además atraído fuertemente
hacia el interior de la célula en virtud de la diferencia de
potencial eléctrica transmembrana negativa en el interior.
Así, este ión esta separado de su potencial de equilibrio
electroquímico que predice la ecuación de Nernst, unas
10.000.000 de veces, si este catión se distribuyera
pasivamente a través de la membrana. Este valor se
encuentra muy por encima que el de cualquier otro ión
presente en la célula. Este hecho implica que la apertura
de un canal de calcio en la membrana plasmática,
producto de una interacción con una señal específica,
conllevaría a una entrada rápida de este catión, lo cual
de hecho constituye la base de su acción como segundo
mensajero.
En este sentido cabe preguntarse porque es el calcio,
entre todos los iones disponibles en la naturaleza, el que
ha sido seleccionado evolutivamente como el mas
importante mensajero intracelular. Volviendo a la
elevadísima diferencia con respecto a su potencial de
equilibrio electroquímico, probablemente el primer
problema que tuvo que afrontar la célula durante su
evolución, con respecto a este catión es su muy baja
solubilidad, en comparación a otros iones, aunada a su
gran abundancia en el agua de mar, donde se originó la
vida. De esta manera, si no fuera excluido, el calcio
precipitaría en el interior celular, fundamentalmente con
los abundantes fosfatos y los ácidos orgánicos, lo cual
imposibilitaría los procesos que se llevan a cabo en el
citoplasma. La solución fue mantener una membrana
muy impermeable al calcio y simultáneamente diseñar
mecanismos de transporte altamente específicos, tanto
para su exclusión activa hacia el medio extracelular
como para su almacenamiento en organelos específicos.
Posteriormente en la evolución, dado que la célula tuvo
que invertir una cantidad importante de energía en
mantener este elevado gradiente electroquímico de
calcio, toma ventaja de dicho gradiente, y de otras
propiedades químicas de este elemento y lo transforma
en el catión señal por excelencia.
Aunque esto es solo un teoría, parece concebible en
función de las características de este particular catión y
tomando en cuenta los otros hechos mencionados en
este contexto.
Regulación intracelular de calcio
Tomando en cuenta lo anterior no es de extrañar que
la célula posea hasta 7 mecanismos diferentes para
mantener la concentración citoplasmática de calcio
iónico [Ca2+]i a nivel submicromolar7,18. A nivel de los
organelos, están presentes en el retículo endo (sarco)
plasmático y la mitocondria. El primero presenta una
Ca2+-ATPasa (SERCA), o bomba de Ca2+, con alta
afinidad por Ca2+, pero con baja capacidad para el
transporte del mismo, mientras que la mitocondria por lo
contrario, posee un uniporte electroforético energizado
por el gradiente electroquímico de protones en la
membrana interior mitocondria, el cual presenta una alta
capacidad de transporte pero una muy baja afinidad por
305
este catión7,18. Ambos presentan también mecanismos
de salida de Ca2+. La mitocondria excluye al catión
gracias a un intercambiador Na+/Ca2+, (o en algunos
casos H+/Ca2+), el cual es electroneutro, mientras que la
salida de calcio del retículo endo(sarco)plasmático se
logra a través de canales altamente regulados: Un canal
de rianodina, mucho mas abundante en el
sarcoplasmático, y un canal de sensible a IP3 mas
importante en el retículo endoplasmático15, en el cual se
induce la liberación cuando se produce este mensajero
por la acción de la diferentes fosfolipasas C sobre el
fosfatidilinositol (4,5) bisfosfato, lo cual conlleva a
también a la liberación del diacilglicerol, otro fundamental
segundo mensajero, que a su vez estimula la proteína
quinasa C, con importantes implicaciones en los
mecanismos de señalización celular15. También se ha
identificado otra Ca2+-ATPasa diferente a las anteriores
(PMR1), la cual está presente en el sistema de golgi y en
vesículas secretoras de insulina en las células β del
páncreas29. Sin embargo, en estas últimas células su
función parece estar mas asociada a la secreción de la
hormona29 que a la regulación intracelular del Ca2+.
Los mecanismos presentes en diferentes organelos
están limitados por la capacidad de éstos como
compartimientos, por lo que a largo plazo, son los
mecanismos ubicados en la membrana plasmática los
responsables de la alta asimetría en la distribución del
calcio entre el interior y el exterior celular7. Existe varios
tipos de canales muy bien regulados a través diversos
moduladores que permiten la entrada de Ca2+ siguiendo
su gradiente de potencial electroquímico, tanto
dependientes de ligandos como dependientes de voltaje,
cuya descripción no está en los alcances de esta
revisión. Entre los mecanismos de exclusión, existe un
intercambiador Na+/Ca2+, el cual extruye Ca2+ del interior
celular utilizando como energía la disipación del
gradiente electroquímico de Na+ existente entre el
citoplasma y el exterior celular25. Este intercambiador
presenta una estequiometría de 3Na+ /Ca2+, siendo muy
importante en células excitables donde los cambios en la
concentración basal del Ca2+ pueden ser bastante
elevados25. De acuerdo a esto, su afinidad por el Ca2+ es
relativamente baja, en comparación con su capacidad
relativa de transporte, la cual es alta. Por otra parte, la
Ca2+-ATPasa (o bomba de calcio) de la membrana
plasmática presenta una relativamente baja capacidad
de transporte pero una alta afinidad por el Ca2+,
compatible con la concentración citoplasmática de este
catión cuando la célula esta en reposo7,20. A diferencia
de el intercambiador Na+/Ca2+, esta enzima es
extremadamente ubicua, habiéndose identificado en
todas las células eucariotas estudiadas hasta el
presente, desde mamíferos hasta plantas, y desde
hongos hasta parásitos12.
La visión en conjunto de todos estos diferentes
mecanismos permiten concluir que su presencia
simultanea en una célula no es redundante, ya que cada
mecanismo presenta ubicación espacial, afinidad y
capacidad diferente, lo que garantiza que en conjunto
son capaces de mantener la homeostasis intracelular de
306
Ca2+ tanto en reposo, como luego de una señal que
eleve subitamente su concentración.
La Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática
Desde el punto de vista estructural y funcional, la Ca2+ATPasa de la membrana plasmática (definida
geneticamente como PMCA) es diferente a la Ca2+ATPasa presente en el retículo endo(sarco)plasmático
(SERCA), ya que su peso molecular es de 138.000 Da16,
mientras que la del retículo está entre 109.000 y 115.000
Da18. Ambas proteínas han sido secuenciadas,
encontrándose muy poca homología secuencial. De
hecho, las únicas secuencias comunes entre ambas
proteínas son las correspondientes al sitio de
fosforilación por el ATP y el sitio de unión de nucleótidos.
Estos dos sitios son característicos de todas las bombas
iónicas del tipo ¨P¨, así definidas por la formación de un
intermediario fosforilado (un aspartil-fosfato) durante su
ciclo catalítico18. La estequiometría de estas dos bombas
iónicas también es distinta. La Ca2+-ATPasa de la
membrana plasmática transporta un átomo de Ca2+ por
cada molécula de ATP que hidroliza, mientras que la
enzima del retículo transporta 2 átomos por molécula de
ATP18. Otra diferencia fundamental lo constituye el
hecho de que la enzima de la membrana plasmática
puede perder hasta el 40 % de su masa y todavía ser
capaz de transportar calcio de una manera ATPdependiente2,17. De hecho, en experimentos mediante
proteólisis parcial de la proteína y reconstitución en
liposomas, hemos demostrado que un fragmento de
81.000 Da. es capaz de mantener la función de hidrólisis
de ATP y el transporte de Ca2+ asociado2. Este hecho
sugiere que alrededor del 40 % de la masa de la enzima
esta comprometida en su regulación17, a diferencia de la
bomba del retículo la cual es muy pobremente regulada.
Es interesante mencionar que aunque la Ca2+-ATPasa
de la membrana plasmática es altamente ubicua entre
los organismos eucariotes como se mencionó
anteriormente, existen diferencias interesantes entre
estas bombas de calcio en distintos organismos. Por
ejemplo, la Ca2+-ATPasa del parásito patógeno
Trypanosoma brucei, causante de la enfermedad del
sueño, aunque tiene un peso molecular aparente similar
a la enzima homóloga de humanos y comparte otras
características con ésta8, es inhibida por la pentamidina,
droga de uso generalizado en la cura de la dolencia
antes mencionada, mientras que esta droga no tiene
ningún efecto sobre la Ca2+-ATPasa de humanos8. Lo
mismo puede decirse del efecto de cristal violeta (o
violeta de genciana) sobre esta enzima en Trypanosoma
cruzi 26. Estos estudios apuntan hacia la búsqueda de
diferencias
entre
esta
enzima
en
distintos
tripanosomatidios, con respecto a la estructura homóloga
de mamíferos, con el objeto de establecer diferencias
relevantes desde el punto de vista terapéutico, en el
desarrollo de drogas contra las enfermedades causadas
por estos parásitos12.
Benaim
Regulación de la Ca2+-ATPasa por la calmodulina
La Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática es
estimulada por la calmodulina (CaM), una proteína de
16.700 bien conservada evolutivamente y cuya ubicuidad
en las células eucarióticas es paralela a la de bomba de
calcio. De hecho, se podría postular que ambas
proteínas han coevolucionado en los eucariotes con el fin
de garantizar el funcionamiento del Ca2+ como señal.
Así, cuando el calcio se eleva intracelularmente,
producto de la apertura de un canal voltaje-dependiente
o ligando-dependiente, este catión se une a la CaM la
cual cambia su conformación y modifica la actividad de
las enzimas “blanco”, lo cual a su vez desencadena la
reacción de la célula ante la señal. Posteriormente, el
complejo Ca2+-CaM, estimula a la bomba de calcio de la
membrana plasmática, conllevando a la disminución de
la concentración del Ca2+ citoplasmático a su nivel de
reposo, preparando así a la célula para responder a una
nueva señal7,18. La CaM presenta 4 sitios de unión para
el calcio los cuales son altamente cooperativos. La unión
del calcio a la proteína incrementa su contenido de αhélice, concomitantemente con su hidrofobicidad14. La
conformación de la proteína depende estrictamente de
cuantos átomos de calcio estén enlazados, lo cual la
transforma en un “sensor” de la concentración
citoplasmática de Ca2+. De esta manera puede reconocer
diferentes enzimas de acuerdo a la concentración de
Ca2+ intracelular presente en un momento dado.
También se ha postulado que la apocalmodulina
(proteína en ausencia de Ca2+), es capaz de reconocer
ciertas enzimas blanco14. La estructura de la CaM ha
sido conservada evolutivamente entre los diferentes
eucariotas6,14. Sin embargo, la CaM de los
tripanosomatidios presenta como excepción 17
sustituciones aminoacídicas con respecto a la proteína
de humanos14. Mas recientemente, se ha demostrado
que la CaM fosforilada por diferentes proteínas-quinasas
cambia su función con respecto a ciertas proteínas
blanco13,14, lo cual incrementa mas aún su plasticidad
como molécula reguladora. Todas estas características
le permiten a la CaM un espectro de acción muy amplio,
en los mecanismos de traducción de señales.
Con respecto a la Ca2+-ATPasa, la CaM incrementa
tanto su Vmax como su afinidad por el calcio y por el
ATP4,7,20. La proteólisis parcial de la enzima mediante
tripsina1,2 o calpaína35 simula el efecto de la CaM, lo cual
ha permitido elaborar un modelo mediante el cual la CaM
removería una compuerta auto-inhibitoria de la enzima
permitiendo así un mayor acceso de los sustratos (Ca2+ y
ATP) al sitio activo1,2,7,17.
La actividad de la enzima también puede ser
incrementada mediante su auto-agregación, lo cual
permite sugerir que la enzima podría presentar una
transición de monómero a dímero23. Los solventes
orgánicos como el dimetilsulfóxido y los poli-alcoholes
(etilenglicol, glicerol) también simulan el efecto
estimulatorio de la CaM3,4, lo cual sugiere que también
actúan removiendo la mencionada compuerta autoinhibitoria7 (Figura 1).
Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática
307
Estimulación por
CaM
Proteólisis controlada
CaM
Ca 2+ -ATPasa
Dominio autoinhibitorio
Solvente orgánico
Estimulación por solventes orgánicos
2+
Figura 1. Modelo de interacción de la Ca -ATPasa de la membrana plasmática con la calmodulina y con solventes orgánicos como el
DMSO. Ver explicación en el texto (Redibujado de Benaim, G. 1993, con autorización).
Regulación de la Ca2+-ATPasa por otros efectores
Estimulación por etanol y por fosfatidiletanol
La Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática también
puede ser estimulada por fosfolípidos acídicos y ácidos
grasos poli-insaturados de cadena larga18. De hecho, se
ha postulado que la proporción de fosfatidilserina
presente en la cara interna de la membrana plasmática
es suficiente para estimular al 50% de la actividad de la
enzima.
El efecto de los fosfolípidos acídicos es más notable
sobre la afinidad de la enzima por el Ca2+, la cual se
incrementa por encima del valor alcanzado cuando es
estimulada por la CaM18. También puede ser estimulada
mediante fosforilación por diferentes proteínas quinasas,
como por la proteína-quinasa A19 y por la proteínaquinasa C36.
Respecto a la estimulación por la proteína quinasa C,
esta ocurre el mismo sitio de unión de la CaM, por lo que
ambos efectores actúan sobre la bomba de calcio de una
manera excluyente, por lo que sus efectos sobre la
enzima no son aditivos. De esta manera, cuando la
enzima ha sido fosforilada por la proteína quinasa C, no
puede unir CaM. De acuerdo con esto, cuando la enzima
tiene enlazada a la CaM, el sitio de fosforilación por la
quinasa esta protegido por la interacción36. Los iones
monovalentes, como el Na+ y el K+, también regulan la
actividad de la Ca2+-ATPasa31,32.
A pesar de que el alcohol se ha consumido por todas
las civilizaciones desde que se conoce la historia del
hombre, aún se desconoce el mecanismo mediante el
cual ejerce su efecto farmacológico. Menos se sabe de
las razones que convierten a un individuo en alcohólico y
a otros no. Tampoco se sabe mucho acerca de los
mecanismos de transmisión de señales que en última
instancia definen el estado de ánimo de los seres
humanos. Sin embargo, existen evidencias recientes que
señalan al calcio como responsable de alguno de estos
fenómenos. Así, se ha reportado en estudios realizados
por un grupo de psiquiatras en pacientes maníacodepresivos, que durante la fase maníaca, la
concentración de calcio intracelular es menor que
durante la fase depresiva. Inclusive, el tratamiento con
litio en individuos bipolares, revierte a los pacientes a
una distribución normal de las concentraciones de calcio
intracelular. No es difícil concebir que, como el calcio
regula la liberación de neurotransmisores, una
perturbación en los mecanismos homeostáticos
responsables del mantenimiento de las concentraciones
básales intracelulares de este catión, podría ser
responsable de algunas de estas manifestaciones
clínicas.
En este particular, hemos obtenido evidencias de que
el etanol y otros alcoholes alifáticos de cadena corta
308
Benaim
estimulan la Ca2+-ATPasa de eritrocitos humanos, tanto
en su forma purificada como sobre la enzima in situ10. El
transporte de calcio en vesículas invertidas de eritrocitos
humanos también es estimulado por el etanol de una
manera dosis-dependiente, lo cual permite inferir que
etanol podía estimular esta actividad in vivo10. El
mecanismo de acción de este alcohol es distinto al de
la CaM, ya que su efecto es aditivo con el modulador
proteico natural, tanto con respecto a la velocidad
máxima de la enzima, como sobre su afinidad por el Ca2+
y ATP10. El efecto del etanol sobre la Ca2+-ATPasa es
totalmente revertido al lavar las membranas mediante
centrifugación en un medio sin alcohol, lo cual sugiere
que el efecto inducido por el etanol sobre la Ca2+ATPasa en condiciones farmacológicas, puede ser
revertido una vez que el alcohol haya sido eliminado22.
Por otra parte, siguiendo con este mismo estudio, se
demostró que el efecto del etanol no se confina a la
Ca2+-ATPasa de eritrocitos, sino que es capaz de
estimular también a la enzima homóloga de Leishmania
mexicana9, lo cual sugiere que este efecto podría ser
mas general, ya que la Ca2+-ATPasa de la membrana
plasmática es una enzima, que además de ser ubicua en
células eucarióticas5,6, está bastante conservada
evolutivamente11,17.
Otros resultados de nuestro laboratorio han
demostrado que el fosfatidiletanol es capaz de estimular
la actividad de la Ca2+-ATPasa a niveles mayores que
otros fosfolípidos naturales34, tanto en la enzima
purificada de eritrocitos humanos como sobre la enzima
in situ22 (Figura 2). También hemos demostrado que este
efecto es extrapolable al transporte de Ca2+, en vesículas
invertidas de eritrocitos humanos34. Este efecto es
interesante, ya que este fosfolípido se acumula en la
membrana cuando el etanol esta presente, mediante un
proceso de transfosfatidilación mediado por la fosfolipasa
D28, en el cual el alcohol sustituye al agua, formándose
un fosfatidilalcohol en lugar de ácido fosfatídico.
Actividad Específica
(nmolesPi/mg.min)
40
30
20
10
0
0
100
200
300
400
500
Concentración de fosfatidiletanol, (µg/ml)
2+
Figura 2. Efecto de concentraciones crecientes de fosfatidiletanol sobre la actividad de la Ca -ATPasa de fragmentos de membrana.
2+
La concentración de Ca libre utilizado fue 10 µM. Control (U); 5% (v/v) etanol (S). Tomado de Cervino y Benaim, 2002, con
autorización).
Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática
La acumulación de fosfatidiletanol se ha reportado que
ocurre luego de una ingesta alcohólica, presentando una
tasa de degradación muy lenta28. De hecho, se ha
postulado que parte del efecto del etanol en humanos
puede ser atribuido a la acumulación en la membrana de
fosfatidiletanol28.
Los hallazgos anteriores nos han permitido postular
que la combinación del etanol con el fosfatidiletanol
formado a partir de éste, podría tener un efecto
sinergístico sobre la activación de la Ca2+-ATPasa y el
consecuente transporte de calcio. Este efecto se observa
mas sobre la afinidad de la enzima por el Ca2+ , lo cual
permite especular que cuando la enzima se encuentra
estimulada por ambos efectores, podría disminuir la
concentración basal del catión por debajo a la que se
alcanza en presencia de por ejemplo, CaM. De esta
manera, esto podría conllevar a que a la célula le sería
mas difícil alcanzar un nivel umbral en la [Ca2+]i luego de
una señal adecuada, respondiendo mas tardíamente,
con los consecuentes posibles efectos que esto podría
ocasionar en los mecanismos de transmisión de señales.
Más recientemente hemos encontrado que el efecto
del etanol es diferente entre las distintas isoformas de la
enzima presentes en humanos21. Así, hemos observado
que el etanol tiene un efecto diferencial sobre cuatro
isoformas diferentes de la Ca2+-ATPasa de membrana
plasmática (PMCA1CI, PMCA2CI, PMCA4CI y
PMCA4CII)21. Estas isoformas son producto de 3 genes
diferentes y difieren en cuanto a estructura y en algunas
de sus propiedades20. Asimismo, estas isoformas se
encuentran expresada de manera diferencial en los
distintos tejidos33. Las isoformas PMCA1CI y PMCA4CII
se encuentran expresadas en las membranas de todas
las células eucariotas estudiadas hasta el momento, la
isoforma PMCA4CI se encuentra principalmente en
tejidos musculares tales como corazón y estomago,
mientras que la isoforma PMCA2CI se encuentra
expresada principalmente en células nerviosas, cerebro
y cerebelo20,33.
Para realizar este estudio, las 4 isoformas fueron
expresadas mediante un sistema de sobre-expresión a
través de baculovirus. Para ello, baculovirus
recombinantes conteniendo el cDNA para cada una de
las isoformas fueron utilizados para infectar una línea
celular de insectos (Sf9). Posterior a la expresión, las
proteínas de interés fueron caracterizadas tanto desde el
punto de vista bioquímico como funcional21. Las 4
isoformas resultaron ser estimuladas por el etanol en una
forma dosis-dependiente, observándose igualmente en
todas ellas un efecto aditivo del alcohol sobre la
estimulación obtenida por la CaM. Sin embargo,
existieron diferencias significativas entre las mismas en
cuanto a la concentración del alcohol a la cual se
alcanzó el máximo efecto estimulatorio (Figura 3).
En este sentido, ha sido muy interesante observar que
la isoforma mas sensible al etanol es la PMCA2CI21, la
cual como se mencionó está ubicada fundamentalmente
en cerebro, cerebelo y tejido nervioso33. La dosis de
etanol con la cual se alcanza el máximo de estimulación
en esta isoforma está precisamente en
el rango
309
farmacológico27, fácilmente adquirible en la sangre luego
del consumo excesivo de alcohol.
Estos resultados nos permiten sugerir que el efecto del
etanol en humanos podría deberse a la estimulación del
transporte de calcio a nivel de estos tejidos, con la
consecuente
disminución
en
la
concentración
citoplasmática
de
este
catión.
Esto
tendría
consecuencias
en
la
liberación
de
ciertos
neurotransmisores, ya que es bien conocido que este
fenómeno esta regulado por los niveles de calcio en las
células de estos tejidos.
Como se mencionó anteriormente, se ha encontrado
en estudios con pacientes maníaco-depresivos, una
correlación
entre
la
concentración
de
calcio
citoplasmático y el estado anímico. Específicamente,
durante la crisis maníaca, los pacientes presentaron una
menor concentración de Ca2+ citoplasmático en los
eritrocitos, que durante la crisis depresiva. El estado de
animo durante la crisis maníaca se asemeja al inducido
por la intoxicación etílica, en cuanto a la manifestación
de un cuadro eufórico. Aún cuando esta relación es
hasta el presente especulativa, es perfectamente
factible, y merece ser investigada con detalle en el
futuro.
En otro orden de ideas, recientemente también hemos
adelantado con respecto a la identificación del sitio de
interacción de la bomba de calcio con el etanol.
Durante el estudio del efecto del etanol sobre las
diferentes isoformas de la Ca2+-ATPasa, pudimos
observar que dos de las isoformas, las cuales son
productos de un mismo gen, las isoformas PMCA4CI y
PMCA4CII, se comportaron de manera diferencial con el
etanol21. Estas isoformas únicamente difieren en cuanto
a la secuencia en la porción C-terminal de la proteína.
Estos hallazgos sugieren que esta región de la enzima
pudiera ser importante para el mecanismo de acción del
etanol. Con el objeto de verificar esta posibilidad,
estudiamos el efecto del etanol sobre dos formas
truncadas de la enzima originadas a partir de la isoforma
PMCA4CII. Una de las formas truncadas carece de los
44 aminoácidos hacia la región C-terminal (PMCA∆44),
mientras que la otra forma presenta una truncación de
139 aminoácidos (PMCA4∆139) hacia esta misma
región. Estas formas truncadas fueron expresadas
mediante el mismo sistema descrito anteriormente21.
Cuando se ensayó el efecto del etanol sobre la actividad
enzimática de la isoforma PMCA4∆44 se observó que el
etanol estimuló a esta proteína de manera similar al
efecto observado sobre la isoforma nativa PMCA4CII.
Por el contrario, cuando se determinó el efecto del
etanol sobre la forma truncada PMCA4∆139 el etanol no
tuvo ningún efecto sobre la actividad de la enzima21.
Estos resultados demuestran que la región relevante en
la Ca2+-ATPasa para el efecto del etanol está ubicada
entre estos 95 aminoácidos diferentes entre las dos
formas truncadas.
Estos estudios merecen ser continuados con el objeto
de caracterizar la secuencia de aminoácidos responsable
del efecto del etanol en esta enzima.
Actividad Ca2+-ATPasa, (%)
Benaim
Actividad Ca2+-ATPasa, (%)
310
400
300
200
100
PMCA1CI
0
0
1
2
3
4
5
6
400
300
200
100
PMCA4CII
0
0
2
400
300
200
100
PMCA2CI
0
0
1
2
3
4
6
8
10
12
Et-OH, % (v/v)
Actividad Ca2+-ATPasa, (%)
Actividad Ca2+-ATPasa, (%)
Et-OH, % (v/v)
4
5
6
Et-OH, % (v/v)
400
300
200
100
PMCA4CI
0
0
2
4
6
8
10
12
Et-OH, % (v/v)
2+
Figura 3. Efecto del etanol sobre la actividad hidrolítica de las distintas isoformas expresadas de la Ca -ATPasa. La concentración de
2+
Ca libre fue 10 µM. (A) isoforma PMCA1CI, (B) isoforma PMCA2CI, (C) isoforma PMCA4CI y (D) isoforma PMCA4CII. (○) representa la
curva de control y (●) en presencia de 5 µg/ml CaM. El 100 % de actividad para la isoforma PMCA1CI corresponde a una actividad
específica de 1.40 nmolPi/mg.min, para la isoforma PMCA2CI es de 4.36 nmolPi/mg.min, para la PMCA4CI es de 6.19 nmolPi/mg.min y
para la PMCA4CII es de 7.95 nmolPi/mg.min. (Tomado de Cervino y col. 1998, con autorización).
Regulación de la Ca2+-ATPasa por otros lípidos naturales
El efecto del etanol sobre la actividad hidrolítica de
ATP y sobre el transporte de calcio asociado es mayor
que el reportado hasta el presente mediante el uso de
otros efectores naturales o artificiales10,34, lo cual índica
que la bomba de calcio de la membrana plasmática debe
ser estimulada fisiológicamente mediante otros
mecanismos desconocidos hasta el presente. En este
sentido nos propusimos identificar la posible existencia
de estos efectores naturales. Entre los candidatos que
decidimos
estudiar,
tomando
en
cuenta
sus
características físico-químicas y su estructura molecular
(compuestos anfifílicos con grupos "hidroxilo" libres) se
encuentran los esfingolípidos. Estos compuestos cuya
función era bastante oscura en el pasado (de ahí su
nombre), han sido reconocidos recientemente como un
importante grupo de segundos mensajeros, involucrados
en procesos celulares tan relevantes como la
proliferación celular, la diferenciación y la muerte celular
programada, mejor conocida como apoptosis30. La
ceramida se forma a partir de la esfingomielina por
acción de una esfingomielinasa, y a su vez es
transformada en esfingosina por una ceramidasa. Ambos
esfingolípidos presentan dos grupos “hidroxilo” libres
(Figura 4) y a su vez, ambos son susceptibles de ser
fosforilados a través de quinasas específicas, las cuales
los transforman en ceramida-1-P y esfingosina-1-P, los
cuales constituyen a su vez otro grupo de señales con
funciones diferentes a sus precursores30. A pesar de la
importancia que han revestido recientemente este nuevo
grupo de señales, poco se sabe respecto a su
mecanismo de acción, y menos aún respecto a su
relación con otros mensajeros, en particular con el Ca2+.
Utilizando como sistema de estudio a la Ca2+-ATPasa
purificada de eritrocitos humanos, demostramos que la
ceramida tiene un notable efecto estimulatorio sobre la
actividad de esta enzima24. Este efecto es aditivo al
obtenido en presencia de CaM, y curiosamente también
al obtenido en presencia de etanol, lo cual indica que
Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática
311
actúan a través de mecanismos distintos (Figura 5). El
efecto observado se manifiesta también en un
incremento significativo en la afinidad de la enzima por el
Ca2+. En este estudio también ensayamos el efecto de
este esfingolípido sobre la expresión funcional de la
Ca2+-ATPasa, el transporte de Ca2+, encontrando que es
capaz de estimular la acumulación del catión en
vesículas invertidas de eritrocitos humanos24, también de
una manera aditiva a la CaM (Figura 6). La esfingosina,
a diferencia de la ceramida, tiene un marcado efecto
inhibitorio sobre la actividad de la Ca2+-ATPasa, tanto en
presencia como en ausencia de CaM, compatible con el
frecuente efecto antagónico que estos dos esfingolípidos
presentan entre si en diferentes sistemas30. Por otra
parte, ni la ceramida-1-P, ni la esfingosina-1-P mostraron
tener efecto sobre la actividad de esta enzima24. Estos
estudios permiten enlazar a la Ca2+ -ATPasa con los
esfingolípidos en la red de transmisión de señales.
OH
+
CH2OPO3-CH2CH2N(CH3)3
NH
O
Esfingomielina
esfingomielinasa
Ceramida
OH
CH2OH
NH
ceramida quinasa
Ceramida-1-fosfato
OH
CH2OPO3-H2
NH
O
O
ceramidasa
Esfingosina
OH
CH2OH
+NH3
esfingosina quinasa
Esfingosina-1-fosfato
OH
CH2OPO3-H2
+NH3
Figura 4. Diagrama de la ruta de síntesis y degradación de los esfingolípidos. Las enzimas principales involucradas están señaladas.
Benaim
Actividad Ca2+-ATPasa
(µmoles Pi/mg.min)
312
6
4
2
0
0
10
20
30
40
Concentración de ceramida, (µM)
50
2+
Figura 5. Efecto de concentraciones crecientes de ceramida sobre la actividad de la Ca -ATPasa purificada de eritrocitos humanos. La
2+
concentración de Ca libre utilizado fue 10 µM. Control (○); Calmodulina (●).5% (v/v) etanol (U); 5% (v/v) etanol mas calmodulina (S).
Modificada con permiso de C. Colina, V. Cervino y G. Benaim, (2002) Biochem. J. 362: 247-251. The Biochemical Society
ATP
ATP
Ceramida
Ceramide
CaM
CaM
CaCl 2
2.5 µM
seg
100 sec
A23187
A-23187
2+
2+
Figura 6. Transporte de Ca inducido por ceramida en vesículas de eritrocitos humanos. El transporte de Ca se determinó mediante
Arsenazo III en un espectrofotómetro de doble longitud de onda (675-685 nm) en vesículas invertidas de eritrocitos humanos. El
transporte de Ca2+ se evidencia como una disminución en la señal debida a la disminución del Ca2+ extravesicular, luego de su captura a
2+
través de la bomba. La adición del ionóforo de Ca A-23187 conlleva a la liberación del catión, lo cual demuestra que había sido
acumulado en las vesículas. (S). Modificada con permiso de C. Colina, V. Cervino y G. Benaim, (2002) Biochem. J. 362: 247-251. The
Biochemical Society.
Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática
313
Como
continuación
de
este
estudio,
mas
recientemente hemos obtenido resultados que apoyan
que el diacilglicerol, otro lípido con un grupo “hidroxilo”
libre, también es capaz de estimular la Ca2+-ATPasa,
incluso a niveles superiores a los alcanzados por otros
efectores naturales, reproduciendo parcialmente el
efecto del etanol sobre esta enzima37. Como se
mencionó anteriormente, el diacilglicerol es un
importante segundo mensajero que se forma mediante la
activación de receptores por ciertas hormonas y
neurotransmisores, lo cual conlleva a la hidrólisis del
precursor fosfatidilinositol 4,5, -bisfosfato15 y a la
producción simultanea del promotor de la liberación de
Ca2+ del retículo endoplasmático, el inositol-(1,4,5) trisfosfato. Los resultados obtenidos hasta el presente
indican que el efecto del diacilglicerol sobre la actividad
de la enzima es aditivo respecto a la estimulación por la
CaM y por la proteína quinasa C, lo cual constituiría una
vía alterna de regulación de la Ca2+-ATPasa.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido financiado por el FONACIT
(Proyecto S1-1999000058 y Proyecto de Grupo G2001000637) y por el C.D.C.H-U.C.V. PI-03-33-4798/00.
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