criptosporidiosis

CAPÍTULO 2.9.4.
CRIPTOSPORIDIOSIS
RESUMEN
La criptosporiosis está producida por protozoos parásitos del género Cryptosporidium, de los que
hay 18 especies “válidas”. Se ha descrito que C. parvum, C. andersoni, C. baileyi, C. meleagridis y
C. galli producen mortalidad y brotes de enfermedad en el ganado. Para confirmar el diagnóstico,
se requiere identificación en el laboratorio. La criptosporidiosis causada por Cryptosporidium
parvum produce diarrea en mamíferos jóvenes no destetados, aunque los animales destetados y
adultos también pueden infectarse. Los síntomas varían desde una infección leve y latente a
diarreas graves, y los jóvenes, viejos o inmunodeprimidos son los más susceptibles. La mortalidad
es baja. Generalmente, los animales destetados y los adultos infectados no manifiestan síntomas
de la enfermedad, pero pueden excretar ooquistes que contaminan el medio. La criptosporidiosis
por Cryptosporidium andersoni afecta a las glándulas digestivas del rumen de terneros mayores y
de ganado adulto. Algunos animales muestran un pequeño aumento de peso, pero no desarrollan
diarrea. Las criptosporidiosis por Cryptosporidium baileyi, C. meleagridis y C. galli son
enfermedades de la aves. Cryptosporidium baileyi afecta fundamentalmente a la bolsa de Fabricio
y a la cloaca de las gallináceas, mientras que C. meleagridis afecta al íleon de los pavipollos y
C. galli infecta la superficie y el epitelio ductal y glandular del proventrículo de las gallinas adultas y
de algunas aves silvestres.
Identificación del agente: No hay una prueba prescrita para detectar la infección por
Cryptosporidium. La demostración de ooquistes de especies de Cryptosporidium o de antígeno de
Cryptosporidium en muestras tomadas y enviadas de forma adecuada es suficiente para un
diagnóstico positivo. El diagnóstico se establece microscópicamente por los métodos de tinción
ácido-alcohol resistentes de Ziehl–Neelsen, carbol fuchina o de auramina con fenol utilizando frotis
fecales concentrados o sin concentrar. Los métodos microscópicos para detectar ooquistes y los
enzimoinmunoensayos para detectar antígenos de Cryptosporidium son relativamente insensibles,
pero lo bastante adecuados para detectar casos clínicos. Ni las tinciones con colorantes ni las
basadas en fluorescencia permiten determinar la especie de Cryptosporidium presente. Con estos
métodos se pueden detectar ooquistes en animales con enfermedad clínica, pero, a veces, tales
métodos no son suficientemente sensibles para detectar la infección en animales clínicamente
normales. Las pruebas de detección de ácido nucleico tienen una mayor sensibilidad. Para
determinar algunas o todas las especies/genotipos o subtipos de Cryptosporidium, se puede
utilizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el análisis del polimorfismo de fragmentos
de restricción (RFLP) y/o la secuenciación. Estos sistemas de tipificación y subtipificación
utilizados para las muestras veterinarias (y humanas), también deben utilizarse para muestras
medioambientales con el fin de evitar cualquier confusión debida a la utilización de diferentes
sistemas durante la investigación de los brotes de la enfermedad con implicaciones para la salud
animal y la salud pública. Sin embargo se deberá aumentar la sensibilidad de los sistemas de
subtipificación para poder utilizarlos con muestras clínicas y medioambientales que contengan un
reducido número (<10) de ooquistes. En la actualidad, la limitación de los sistemas de
subtifipicación diferenciadora de especies es que solo son aplicables a C. parvum y C. hominis.
Aún tienen que elaborarse sistemas de subtipificación diferenciadora para los patógenos que no
sean ni “parvum” ni “hominis” (incluyendo la mayoría de los patógenos del ganado).
Las muestras para el diagnóstico preliminar se deben recoger durante la infección aguda y deben
procesarse lo antes posible, preferiblemente en 24 horas. El transporte al laboratorio debe
realizarse de acuerdo con las normas de la Asociación Internacional de Transporte Aéreo, que se
resumen en el capítulo 1.1.1.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
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Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
La demostración en muestras fecales de ooquistes de criptosporidios o de antígeno específico es
la prueba más adecuada en la mayor parte de los casos. Muchas infecciones que causan
morbilidad y/o mortalidad en mamíferos probablemente se deban a la criptosporidiosis causada por
C. parvum. Crystosporidium bovis es una especie muy frecuente que afecta principalmente a
terneros después del destete. Cryptosporidium baileyi, C. meleagridis y C. galli causan morbilidad
y/o mortalidad en las aves. La especie responsable de una criptosporidiopsis se puede determinar
por PCR-RFLP y/o por secuenciación del ADN del ooquiste de Cryptosporidium. No hay
estándares internacionales para la preparación de ooquistes purificados, antisueros, antígenos,
anticuerpos monoclonales o hibridomas, aunque existen en el mercado varios ooquistes
purificados y kits para la detección de coproantígenos en los que se utilizan anticuerpos
monoclonales.
Pruebas serológicas: La criptosporidiosis es a menudo una enfermedad del recién nacido y a
menos que se haya evitado la exposición a ooquistes infectantes, las pruebas serológicas no
ofrecen ningún beneficio.
Requisitos para las vacunas y el material de diagnóstico: No hay programa de control para la
criptosporidiosis, ni vacuna disponible rigurosamente probada y aceptada.
A. INTRODUCCIÓN
Cryptosporidium spp., descrito originalmente en 1907, se consideró como un comensal hasta su asociación con
diarreas en pavos jóvenes en los años 50 (C. meleagridis), y con brotes importantes de diarrea en terneros en los
años 70 (C. parvum). Cryptosporidium es un patógeno importante del ganado doméstico y del hombre, y, desde
los años 80, la criptosporidiosis por C. parvum se considera la causa corriente de gastroenteritis aguda
autolimitada en hospedadores inmunocompetentes. Fayer (9) proporciona una buena descripción de la biología
de Cryptosporidium.
La criptosporidiosis está causada por protozoos parásitos del género Cryptosporidium (familia Cryptosporidiidae,
orden Eucoccidiorida, subclase Coccidiasina, clase Sporozoasida, filum Apicomplexa). Aunque se han descrito
más de 20 “especies” de este parásito en función de los hospedadores animales de los que se aíslan, la
especificidad del hospedador como criterio de especificación parece mal fundamentada, ya que algunas
“especies” carecen de tal especificidad. La definición de especie y la identificación de este género están en
constante cambio, con la adición de “nuevas” especies basada primariamente en criterios moleculares. En la
actualidad, hay 18 especies “válidas” (cuadro 1): C. hominis, encontrado fundamentalmente en humanos
(previamente conocido como C. parvum Tipo 1); C. parvum, en humanos y otros mamíferos (previamente
conocido como C. parvum Tipo 2); C. andersoni y C. bovis, en ganado vacuno; C. canis, en perros; C. muris, en
ratones; C. felis, en gatos; C. wrairi, en cobayas; C. suis, en cerdos; C. fayeri, en canguros rojos (31);
C. macropodum, en canguros grises (28); C. meleagridis, en pavos y en humanos; C. baileyi, en pollos; C. gali,
en gallinas adultas y en algunas aves silvestres (26, 27); C. varanii, en lagartos monitores esmeralda;
C. serpentis, en serpientes y lagartos; y C. molnari, en peces (9). Se ha descrito que C. parvum, C. andersoni,
C. baileyi y C. meleagridis producen morbilidad y brotes de enfermedad en el ganado. Para confirmar el
diagnóstico se requiere la identificación en el laboratorio.
Recientemente se ha descrito Cryptosporidium bovis (10). Anteriormente se identificaba como el genotipo Bovino
B de Cryptosporidium (GenBank AY120911), Los ooquistes de C. bovis son morfológicamente indistinguibles de
los ooquistes de C. parvum (cuadro 1). Cryptosporidium bovis es una especie muy frecuente que infecta
principalmente a las crías de ganado después del destete (10, 11). Los ooquistes de Cryptosporidium bovis no
fueron infectantes para los ratones neonatos BALB/c o para dos corderos expuestos experimentalmente
(<1 semana de edad), pero sí causaron infección en dos terneros que habían sido infectados previamente con
C. parvum. Se detectó Cryptosporidium bovis en dos terneros de 2–7 meses de edad, ninguno de los cuales tuvo
diarrea; también se detectó C. bovis en un cordero de 2 semanas de edad.
Además de las 18 especies válidas, existen más de 40 genotipos de Crystosporidium (9, 48). Es posible que
algunas de ellas empiecen a ser reconocidas como especies a medida que se siga investigando. Se ha descrito
en humanos el genotipo I de Crystisporidium en cérvidos, mofetas y ardilla rayada y los genotipos de C. hominis
en monos. Para confirmar el diagnóstico, se requiere la identificación por el laboratorio.
En hospedadores humanos y no humanos, los métodos moleculares como la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), el polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) y la secuenciación del
ADN han demostrado una variedad de especies de Cryptosporidium mayor que la que se conocía anteriormente.
Se han descrito Cryptosporidium meleagridis, C. canis, C. muris, C. felis y C. suis en pacientes humanos
inmunocompetentes e inmunocomprometidos, así como C. hominis y C. parvum. Por ejemplo, los ooquistes de
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
C. meleagridis purificados de heces humanas no son distinguibles de C. parvum por métodos convencionales
(descritos en este capítulo), pero muestran una identidad genética con el C. meleagridis de los pavos en una
serie de zonas genéticas separadas. Existen pruebas de que C. andersoni también puede infectar a humanos. La
mayor amenaza zoonósica para los humanos proviene de C. parvum y C. meleagridis.
El descubrimiento de diferencias basadas en las secuencias dentro de varios genes (ARN ribosómico [ARNr], la
proteína de choque térmico 70 de Cryptosporidium, la actina, la proteína de las paredes de los ooquistes de
Cryptosporidium [COWP], las proteínas adhesivas 1 y 2) de Cryptosporidium relacionadas con la trombopondina)
y entre aislamientos individuales dentro de una especie “previamente válida”, ha originado la revisión de la
taxonomía del género. Algunos de los más de 40 genotipos de Cryptosporidium descritos en la actualidad
pueden representar diferentes especies (9, 48). Por tanto, en lo que respecta a las especies de Cryptosporidium,
la clasificación actual de los genotipos de Cryptosporidium estará sujeta a modificaciones.
Cuadro 1. Algunas diferencias entre especies del género Cryptosporidium
Dimensiones del ooquiste
(µm)
http://www.nmnh.si.edu/msw/
Lugar de infección
Principal hospedador
Infeccioso
para
humanos
C. hominis
4.5 × 5.5
Intestino delgado
Humanos
Sí
C. parvum
4.5 × 5.5
Intestino delgado
Mamíferos de cría
neonatos, humanos
Sí
C. suis
5.05 × 4.41
Intestino delgado
Cerdos
Sí
C. felis
4.5 × 5.0
Intestino delgado
Gatos
Sí
C. canis
4.95 × 4.71
Intestino delgado
Perros
Sí
4.5–4.0 × 4.6–5.2
Intestino
Pavos
Sí
5.5 × 7.4
Estómago
Roedores
Sí
5.6 × 7.4 (5.0–6.5 × 8.1–6.0)
Estómago
Ganado
No
C. wrairi
4.0–5.0 × 4.8–5.6
Intestino delgado
Cobayas
No
C. bovis
4.7–5.3 × 4.2–4.8
Intestino delgado
Ganado vacuno
No
C. baileyi
4.6 × 6.2
Tráquea, bolsa de
Fabricio, cloaca
Aves de corral
No
C. fayeri
4.5–5.1 × 3.8–5.0
(mean 4.9 × 4.3)
Intestino
Canguro rojo
(Macropus rufus)
No
Canguro gris
(Macropus giganteus)
No
Especies
C. meleagridis
C. muris
C. andersoni
C. macropodum
C. galli
8.0–8.5 × 6.2–6.4
Proventrículo
Pinzones, pollos
No
C. serpentis
5.6–6.6 × 4.8–5.6
Estómago
Reptiles
No
6.3 × 5.5
Intestino
Lagarto monitor
esmeralda (Varanus
prasinus)
No
C. varanii
C. molnari
C. scophthalmi
4.72 × 4.47
Intestino
Pez (dorada)
No
3.7–5.0 × 3.0–4.7
(media 4.44 × 3.91)
Intestino, muy raras veces
en el estómago
Pez (rodaballo)
No
Para muchas de las especies de Cryptosporidium del cuadro 1, el tamaño y la forma del ooquiste son similares.
Esto hace difícil, si no imposible, la identificación de las especies basada en la morfometría del ooquiste
mediante la microscopía de campo claro, debido al solapamiento de los tamaños.
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Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
Cuadro 2. Algunos genotipos de Cryptosporidium, lugar de la infección y su estado de infección
en relación con los humanos
Genotipos de Cryptosporidium
Intestinales
Oso
Ciervos y cérvidos* (×3)
Ciervo
Ciervos y cérvidos
Ciervos, ratones
Pato
Hurón
Zorro (×2)
Ganso (×2)
Caballo
Marsupial (×2)
Mangosta
Mono*
Ratón
Rata almizclera (×2)
Zarigüeya (×2)
Avestruz
Ovino
Cerdo II
Conejo
Mapache
Foca (×2)
Genotipo nuevo de la oveja (×2)
Mofeta*
Serpiente
C. canis coyote
C. canis perro
C. canis zorro
Cuadro cont. Algunos genotipos de Cryptosporidium, lugar de infección y su estado de infección
en relación con los humanos.
Genotipos de Cryptosporidium
Gástricos
Caribú
Lagarto
C. galli pinzón
Genotipo de C. muris en
ratón de campo japonés
Tortuga
Becada
Clave: * infeccioso para los humanos (Datos de las referencias 9, 47, 48).
1.
Síntomas clínicos
La criptoporidiosis por Cryptosporidium parvum origina diarreas en el ganado joven de granja no destetado que
incluye terneros, corderos, cabritos y alpacas. Las fases endógenas infectan a los enterocitos de la porción distal
del intestino delgado, el ciego y el colon. Los mayores cambios patológicos asociados con la enfermedad son la
atrofia de las vellosidades intestinales, el acortamiento de las vellosidades y la disgregación de los enterocitos, y
los animales afectados se recuperan a las dos semanas de mostrar síntomas de la enfermedad. Los animales
destetados y adultos también pueden resultar infectados. Los síntomas pueden variar desde una infección
moderada o asintomática en animales adultos a diarreas graves en animales jóvenes. La mortalidad es baja
excepto si ocurre una infección asociada con otros patógenos entéricos, tales como el rotavirus, E. coli. Los
animales adultos pueden excretar ooquistes que pueden transmitirse a otros hospedadores susceptibles.
Las infecciones del ganado vacuno por Cryptosporidium parvum pueden producir diversos grados de
deshidratación, inactivación, anorexia, fiebre y deterioro del estado físico. La mortalidad puede ser alta.
Raramente producen la deshidratación aguda, el colapso y la elevada mortalidad que se observan con
Escherichia coli enterotoxigénica o con el rotavirus, que pueden ocurrir en paralelo. Se pueden detectar
ooquistes en hospedadores clínicamente normales y en enfermos. Los terneros y los corderos con diarrea
pueden excretar entre 106 y 108 ooquistes por g de heces. El ganado adulto infectado excreta menor cantidad de
ooquistes, aunque en infecciones subclínicas pueden generar concentraciones similares de ooquistes en un
periodo de 12 meses.
Cryptosporidium andersoni coloniza las glándulas digestivas del rumen de terneros mayores y del ganado adulto.
Los microvilli de las glándulas pépticas son destruidos por las fases endógenas, lo que puede explicar la elevada
concentración de pepsinógeno detectada en el plasma de los hospedadores infectados. Algunos animales
infectados muestran un moderado incremento de peso en comparación con los controles no infectados. El
ganado adulto no desarrolla diarrea, pero puede excretar ooquistes durante varios meses.
Cryptosporidium es un patógeno primario en pollos, pavos y codornices, causando enfermedad respiratoria y/o
intestinal, que conduce a la morbilidad y la mortalidad. Actualmente, dos especies (C. baileyi y C. meleagridis)
infectan (21) pollos y pavos, y una tercera no designada (Cryptospodrium sp.) infecta codornices. Las especies
de Cryptosporidium son comunes en el intestino de pollos para consumo en los EE.UU. y en Japón. La
criptosporidiosis por Cryptosporidium baileyi es una enfermedad del epitelio de la bolsa de Fabricio y de la cloaca
de los pollos, aunque la tráquea y la conjuntiva son lugares de infección minoritarios. La criptosporidiosis
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Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
intestinal por Cryptosporidium baileyi normalmente no ocasiona lesiones macroscópicas en pollos ni origina
síntomas claros de enfermedad. La atrofia de las vellosidades, el acortamiento de los microvilli y la separación de
los enterocitos son los principales cambios patológicos asociados con la enfermedad. La criptosporidiosis
respiratoria de Cryptosporidium baileyi en pollos puede producir morbilidad grave y, en ocasiones, mortalidad.
Inicialmente, la enfermedad se acompaña de estornudos y tos, seguida de extensión de la cabeza para facilitar la
respiración. La pérdida de los cilios de las células epiteliales y la hiperplasia, con engrosamiento de la mucosa y
descargas de exudado mucocelular en las vías aéreas, son los cambios patológicos más importantes asociados
con la enfermedad en pollos jóvenes para el consumo. Los síntomas graves de la enfermedad respiratoria
pueden durar hasta 4 semanas después de la infección (7). La criptosporidiosis por Cryptosporidium baileyi en
los pavos es similar a la de los pollos. Los aislamientos de C. baileyi en pollos causan infección en otras aves.
La criptosporidiosis por Cryptosporidium meleagridis es una enfermedad del íleon de los pavos, de otras aves de
corral y de los humanos. La criptosporidiosis por Cryptosporidium meleagridis puede producir diarrea grave en
pavipollos. Los cambios patológicos más importantes asociados con la enfermedad son la atrofia de las
vellosidades, la hiperplasia de las criptas, y el acortamiento de las microvellosidades (7). Se ha descrito la
transmisión de un aislamiento de C. meleagridis de pavo a pollos y a patos domésticos.
La criptosporidiosis por Cryptosporidium galli es una enfermedad de gallinas adultas y de algunas aves exóticas
y silvestres (26, 27, 30). A diferencia de los ciclos vitales de C. meleagridis y de C. baileyi, los de de C. galli están
limitados a las células epiteliales del proventrículo. Los ooquistes de Cryptosporidium galli (8,0–8,5 × 6,2–6,4 µm)
son más grandes que los de C. baileyi.
Se ha descrito la criptosporidiosis respiratoria e intestinal en codornices criadas comercialmente, producida por
una especie de Crytosporidium descrita inadecuadamente (Cryptosporidium sp.) cuyos ooquistes son más
pequeños que los de C. baileyi y no resultan infectantes para pollos o pavos. Los cambios patológicos son
similares a los descritos para la criptosporidiosis respiratoria e intestinal de pollos por C. baileyi (7).
2.
Dosis infectante
La dosis infectante para C. parvum varía entre distintos aislamientos y entre especies hospedadoras. Para
ratones neonatos (cepa CD-1) la ID50 (dosis infectante media) está entre 87 y 60 ooquistes (19). Diez ooquistes
causaron infección en dos de cada dos primates probados, y cinco ooquistes produjeron enfermedad clínica en
corderos gnotobióticos. La dosis infectante para ganado no es conocida, pero se cree que una baja cantidad de
ooquistes es suficiente. Se desconoce si los aislamientos de C. parvum varían en su capacidad para colonizar
diferentes especies hospedadoras. En voluntarios adultos humanos sanos, la ID50 depende también tanto del
estado del aislamiento como del hospedador inmune. En estudios de infectividad en humanos voluntarios, los
aislamientos de C. parvum difieren en su ID50, su índice de ataque, y la duración de la diarrea que inducen. La
ID50 del aislamiento de C. parvum UCP (Cryptosporidium parvum Ungar, derivado humano, del Dr B. Ungar,
EE.UU.) es de 1.042 ooquistes; el aislamiento IOWA de C. parvum (derivado bovino, de Ames, Iowa, EE.UU.) es
de 132 ooquistes; y el aislamiento de C. parvum TAMU (derivado equino, de la Universidad de Texas A & M,
EE.UU.) es de 9 ooquistes (25). La infección oral con 100 ooquistes de C. baileyi puede producir criptospordiosis
intestinal (7).
3.
Transmisión
La transmisión puede producirse por cualquier vía de ingestión de material contaminado con ooquistes viables
excretados por individuos infectados. Entre las prácticas más probables para aumentar la difusión de la
criptosporidiosis están la cría de terneros, cabritos y corderos caseros y la alimentación y la cría comunal de
neonatos, donde los animales jóvenes susceptibles están en contacto unos con otros y con las heces de
animales infectados. De forma similar, la eliminación de las heces, el abono de granjas u otros deshechos
contaminados acumulados sobre el terreno, cuando van seguidos de períodos de lluvias persistentes o de nieve
que se derrite, puede provocar la contaminación del curso del agua por los ooquistes de C.parvum. Estas
trayectorias se pueden utilizar como fuente de agua para otros animales, y de agua potable para el consumo
humano. Los desechos contaminados incluyen tanto productos líquidos como sólidos derivados de la cría de
animales.
4.
Mantenimiento de la infección
Una variedad de mamíferos salvajes actúan como hospedadores de C. parvum (9, 39, 43, 47), particularmente
los neonatos, pero se sabe poco de la importancia de su implicación en la transmisión de la infección, o de su
mantenimiento, en animales domesticados en ambientes de granja. Tampoco está muy claro su papel en la
epidemiología “de la granja” en especies domesticadas. Los métodos utilizados para diagnosticar la infección en
pequeños mamíferos y en animales salvajes son los mismos que los descritos para los animales de granja. Los
ooquistes son ambientalmente resistentes y pueden sobrevivir durante largos periodos de tiempo (>6 meses) en
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Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
microclimas húmedos y fríos. Existen pruebas de la transmisión de criptosporidiosis de madres clínicamente
normales a neonatos lactantes, pero, en general, sigue sin conocerse la duración del estado de portador.
Algunas especies de aves actúan como hospedadores de C. baileyi.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
No hay ninguna prueba prescrita para el diagnóstico de la infección por Crystosporidium. La detección de
ooquistes de especies de Cryptosporidium o antígenos, en una muestra recogida y manipulada adecuadamente
es suficiente para el diagnóstico positivo, y los métodos preferidos para la recogida de las muestras no son
invasivos. No existen técnicas de cultivo in-vitro reproducibles y disponibles para amplificar el número de
parásitos antes de la identificación, por lo que los métodos elegidos son la detección de los ooquistes (el estadio
de transmisión), del antígeno de Cryptosporidium y/o del ADN a partir de las heces o de líquidos corporales
adecuados. Además de estas pruebas, se puede utilizar la tinción de hematoxilina y eosina para una
confirmación histológica del diagnóstico post mórtem, es útil para el diagnóstico confirmativo y común en todo el
mundo, por lo que no se describirá en este capítulo.
Se pueden realizar análisis adicionales para la identificación de especies y/o del subtipo de C. parvum con el
ADN de Cryptosporidium mediante técnicas moleculares, como la PCR-RFLP y/o la secuenciación de los
productos amplificados de zonas genéticas definidas. Esto no solo confirma el diagnóstico sino que permite
discriminar más de lo que es posible mediante morfología o morfometría en la que se utiliza el microscopio.
Para especies de Cryptosporidium que infectan el tracto gastrointestinal (cuadro 1), el diagnóstico inicial se basa
en la detección de ooquistes en las heces por técnicas convencionales de tinción, colorantes
fluorescentes/inmunofluorescentes o de la presencia de antígenos (coproantígenos) de Cryptosporidium en las
heces por enzimoinmunoensayo (ELISA) o por métodos inmunocromatográficos (IC). La mayoría de los métodos
de diagnóstico se han desarrollado utilizando C. parvum por su importancia comercial y su frecuencia. Existe
evidencia circunstancial que indica que en algunas muestras los métodos que se describen a continuación no
sirven para detectar todos los aislamientos. Se espera que tales métodos detecten la mayoría de las infecciones
por C. parvum, pero se sabe poco sobre su utilidad para detectar otras especies a partir de material clínico.
La comprobación de ooquistes de Cryptosporidium y de antígenos específicos de Cryptosporidium en muestras
fecales es la prueba más apropiada en la mayoría de las ocasiones. Muchas infecciones que causan morbilidad
y/o mortalidad en los mamíferos se deben probablemente a la criptosporidosis por C. parvum. Las especies de
Cryptosporidium responsables se pueden determinar posteriormente por PCR-RFLP o por secuenciación del
ADN aislado. No hay estándares internacionales para la preparación de ooquistes purificados, antisueros,
antígenos, anticuerpos monoclonales (MAb) o hibridomas, aunque existen en el mercado varios ooquistes
purificados y equipos para la detección de coproantígenos utilizando anticuerpos monoclonales.
a)
Diagnóstico de laboratorio
Las propiedades diagnósticas de los ooquistes de C. parvum observables en suspensión, utilizando
microscopía de contraste interdiferencial de Nomarski (DIC), son las siguientes. Los ooquistes son lisos,
con pared celular gruesa, sin color, con formas esféricas o ligeramente ovoides que cuando están
desarrollados (esporulados) contienen cuatro esporozoitos alargados libres (es decir, no contenidos en un
esporocisto) y un cuerpo citoplasmático residual. El tamaño medio de los ooquistes de C. parvum es de
4,5 × 5,0 µm (rango de 4–6 µm).
Normalmente, el diagnóstico se establece por métodos microscópicos convencionales, y se utilizan con
frecuencia el método modificado de Ziehl–Neelsen (mZN) y el de auramina-fenol (AP) en frotis fecales sin
concentrar (5, 6, 32, 37). Cuando se espera un número bajo de ooquistes en las muestras, o cuando se
necesitan ooquistes purificados para investigaciones moleculares, la concentración de los ooquistes de las
muestras fecales puede aumentar la sensibilidad de la detección. Las mejores opciones para concentrar
ooquistes de las heces son soluciones de azúcares (por ejemplo, solución Sheather), sales como el sulfato
de zinc, la formalina-éter (formalina-etil acetato) o técnicas de concentración específicas, tales como la
separación inmunomagnética (32, 33, 37).
b)
Demostración en las heces
Las muestras fecales de los animales clínicamente más enfermos contienen un gran número de ooquistes
con paredes celulares engrosadas y suficiente antígeno de Cryptosporidium, por lo que el empleo de
técnicas estándar de tinción e inmunológicas deben dar un diagnóstico positivo. Se desconoce el número
de animales excretores clínicamente normales y, dada la insensibilidad de los métodos convencionales, los
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Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
que excretan pocos ooquistes pueden no ser diagnosticados por tales técnicas, debido a que el número de
ooquistes está por debajo de sus límites de detección (37, 41, 42). En animales con enfermedad clínica, los
ooquistes se detectan por lo general en frotis de muestras sin concentrar. La utilización de un método de
concentración de ooquistes aumenta la frecuencia de detección. Tanto los métodos de flotación,
preferentemente, como los de sedimentación son adecuados para concentrar ooquistes de Cryptosporidium
spp., y los antígenos de los ooquistes pueden buscarse en las heces después de estos procedimientos de
concentración.
Podrían no detectarse los ooquistes en las muestras clínicas de todos los casos de criptosporidiosis, y la
ausencia de ooquistes en repetidas presentaciones de las muestras de hospedadores sintomáticos, no
indica necesariamente la ausencia de infección. En estos casos, y particularmente cuando la sospecha
clínica es alta, las muestras de heces negativas de ooquistes deben someterse a la detección de antígeno
y/o la detección basada en la PCR, ya que en las heces debe encontrarse suficiente antígeno o ADN de
Cryptosporidium procedentes de formas correspondientes al ciclo de vida asexual (37). Esta es la principal
ventaja de los inmunoensayos de detección de coproantígeno. Se están utilizando de forma creciente las
pruebas de detección de ácido nucleico tales como la PCR, dado que ofrecen un aumento de la sensibilidad
y de la identificación del subtipo/genotipo o de las especies implicadas. Para los métodos basados en la
PCR, es probable que los métodos de la PCR anidada tengan un índice de diagnóstico más elevado (37),
siendo más sensibles que los métodos de PCR directos.
El personal que se está familiarizando con técnicas de tinción y concentración debe disponer de muestras
fecales positivas para Cryptosporidium spp., y se deben incluir frotis de muestras fecales positivas cada vez
que se realiza una prueba. Las muestras con ooquistes de C. parvum pueden guardarse a 4°C en K2Cr2O7
o en formalina al 10% a efectos de referencia. De modo similar, se pueden preparar frotis fecales positivos
para ooquistes, secados al aire y fijados con etanol absoluto, para emplearlos como controles positivos.
Cuando se sospecha una implicación bronco-pulmonar, se pueden realizar pruebas análogas con exudados
o lavados bronquiales y pleurales.
Hay que tener en cuenta que una solución al 2,5% de K2Cr2O7 puede ser inhibidor para la PCR. Las
muestras fecales positivas para ooquistes o los ooquistes parcialmente purificados almacenados en
dicromato potásico y utilizados para la amplificación de ácido nucleico por PCR deberían lavarse en agua
desionizada para eliminar el K2CR2O7 residual antes de la extracción de ADN. Una serie de tres lavados
seguidos cada uno de ellos de centrifugación (3000 g durante 10 minutos), la eliminación del sobrenadante,
y la resuspensión del sedimento en agua desionizada debería minimizar la inhibición de la PCR por el
K2CR2O7. Debe tenerse en cuenta que los factores inhibidores pueden aún estar presentes después de un
largo período de tiempo (>6 meses) de almacenaje.
c)
Seguridad del personal de laboratorio y del operario
Los criptosporidios están incluidos en el grupo 2 de riesgo en el laboratorio y todos los procedimientos de
laboratorio que producen aerosoles infectantes deben llevarse a cabo en una cámara de bioseguridad. Las
muestras para el análisis de Cryptosporidium pueden contener otros organismos patógenos y deberían
procesarse en consecuencia. Para salvaguardar la salud de los trabajadores de laboratorio, se deben
seguir los procedimientos indicados en el capítulo 1.1.2. Bioprotección y seguridad humana en los
laboratorios veterinarios de microbiología y en las instalaciones de los animales.
El laboratorio debería tener un programa de garantía de calidad interna y externa, como se expone en el
capítulo 1.1.3. Gestión de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias.
d)
Recogida y envío de muestras
Siempre que sea posible, se deben recoger las muestras para el diagnóstico primario durante la infección
aguda, y se deben procesar lo antes posible. Lo ideal es seleccionar un sistema de transporte para
asegurar que las muestras llegan al laboratorio en 24 horas. Si no se puede llevar a cabo el examen rápido
para la detección de Cryptosporidium, se puede reducir el deterioro de la morfología de los protozoos y su
enmascaramiento por crecimiento de otros microorganismos, particularmente levaduras, mediante la
adición de formalina acuosa al 10% (v/v), aunque puede interferir con las pruebas de la PCR. Tanto la
morfología del ooquiste para la identificación microscópica como el ADN del esporozoito para el ensayo con
PCR pueden mantenerse en general durante largos periodos de tiempo a 4°C sin formalinización. Las
heces pueden almacenarse congeladas por más de 2 años sin que ello afecte a la capacidad de extracción
del ADN de Cryptosporidium para el análisis molecular. En algunas ocasiones, esto puede mejorar la tasa
de extracción del ADN, posiblemente debido al reblandecimiento de la pared exterior del ooquiste. No es
recomendable la congelación-descongelación repetida de muestras de heces congeladas a fin de evitar la
degradación del ADN liberado.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
7
Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
Los procedimientos utilizados para la recogida y el transporte de muestras son de una importancia crítica
para el éxito en los análisis de laboratorio. Las muestras deberían ser recogidas en un contenedor de
muestras adecuado y hermético, y deben incluirse en paquetes primarios y secundarios de seguridad. Los
procedimientos para empaquetado y envío de muestras son los detallados en las Regulaciones de
Mercancías Peligrosas de la Asociación Internacional de Transporte Aéreo (16). Estas regulaciones se
resumen en el capítulo 1.1.1 Recogida y envío de muestras para el diagnóstico.
e)
Umbral de detección en heces
La mayoría de los métodos de tinción y fluorescencia para la detección de ooquistes y las técnicas ELISA e
IC para la detección de antígenos de Cryptosporidium son relativamente insensibles. Estos métodos
pueden detectar ooquistes en animales clínicamente enfermos, pero pueden no ser lo bastante sensibles
como para detectar la infección en animales clínicamente normales. Anusz et al. (2) han descrito un límite
de detección de 106 ooquistes por ml de heces utilizando la modificación de mZN de Kinyoun en frotis
fecales sin concentrar. La concentración de ooquistes en la muestra puede aumentar la sensibilidad de la
detección. En muestras humanas positivas a ooquistes, se necesitan entre 1 × 104 y 5 × 104 ooquistes por
g de heces sin concentrar para obtener una eficacia de detección del 100%, utilizando el método de tinción
mZN de Kinyoun (41). Las variaciones en la consistencia fecal influyen en la facilidad de la detección,
siendo más fácil detectar ooquistes en concentrados de muestras de diarrea acuosa que de muestras
fecales sólidas (41). Además de técnicas microscópicas, se han descrito en la literatura varios ELISA de
captura de antígeno e IC con límites de detección del orden de 3 × 105–106 ooquistes por ml (2, 29, 37), lo
que indica que no ofrecen una sensibilidad mayor que los métodos microscópicos.
En muestras fecales bovinas, no se detectaron ooquistes en muestras sembradas con 10.000 ooquistes de
C. parvum por g después de la sedimentación por formol-éter y mediante análisis por tinción con AP o por
inmunofluorescencia (IF). Cuando los ooquistes se concentraron utilizando flotación en sacarosa, el nivel de
detección fue de 4.000 ooquistes por g mediante ambos métodos de tinción. Después de la flotación en sal,
se pudieron detectar de forma fiable 4000 ooquistes por tinción con AP, pero el límite de detección aumentó
a 6.000 ooquistes por g utilizando tinción por IF (41). Webster et al. (42) compararon también la microscopía
con la PCR, y encontraron que la PCR, conjuntamente con la separación de los ooquistes de muestras
fecales por partículas inmunomagnéticas (IMS) detectó cinco ooquistes por ml de heces diluidas, que
corresponde a 80–90 ooquistes por g. Incluso considerando la dilución de las muestras fecales sólidas que
se necesita para llevar a cabo la IMS, esto representa un aumento de la sensibilidad de varios órdenes de
magnitud respecto a los métodos convencionales de coprodiagnóstico. Actualmente se dispone de varias
pruebas sensibles basadas en la PCR (véase la sección B.1. Métodos de reconocimiento del ácido
nucleico).

1
2
3
4
8
Preparación de frotis fecales (o de líquidos corporales adecuados) sin concentrar (incluir un porta
de control positivo cada vez que se realiza este procedimiento)

Procedimiento de la prueba
i)
Se debe llevar ropa protectora y guantes desechables. Se apunta el número de referencia de la
muestra sobre un porta para microscopio con un marcador de punta de diamante1, y se utilizan portas
separados para cada muestra. Se coloca una gota de solución salina (unos 50 µl) en el centro del
porta.
ii)
Se toma una pequeña muestra de las heces (unos 2 mg) con la punta de una barra aplicadora limpia2
(o con una pipeta después de mezclar bien, si son muestras líquidas) y se emulsiona la muestra en
solución salina mezclando cuidadosamente. Para heces líquidas (u otros fluidos corporales) se pone
una gota directamente sobre el porta. En el caso de heces líquidas, hebras mucosas, exudados o pus,
se pueden mezclar con solución salina sobre el porta de microscopio. Las heces líquidas se pueden
diluir con una gota de solución salina 150 mM.
iii)
Se prepara un medio para hacer el frotis más grueso con áreas de grosor variable. Hay que
asegurarse de que el frotis tiene la transparencia correcta3 .
iv)
Se seca el frotis al aire a temperatura ambiente.
v)
Se fija el frotis4 con metanol durante 3 minutos.
Alternativamente, se puede usar un lápiz para marcar la porción opaca de un porta de vidrio para microscopio.
Para heces consistentes, la muestra debería incluir porciones de la superficie y del interior de las heces.
Para este procedimiento se recomiendan frotis moderadamente gruesos. Si el frotis es demasiado fino o demasiado
grueso, se perderán ooquistes. Se consigue un grosor aceptable cuando se pueden ver las manecillas del reloj o puede
leerse lo que está impreso en esta página si se mira a través de la preparación.
Las muestras secadas al aire y fijadas en metanol se pueden mantener a temperatura ambiente durante >6 meses antes
de la tinción.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
f)
Preparación de frotis fecales (o fluidos corporales apropiados) tras la concentración por flotación
o sedimentación
Ningún método de flotación o sedimentación es específico para los ooquistes de Cryptosporidium spp. Los
líquidos que se emplean para la flotación son más densos que los parásitos que se van a concentrar y se
diseñan para una gravedad específica definida utilizando un hidrómetro adecuado disponible por los
suministradores de material de laboratorio más importantes. Los parásitos concentrados por métodos de
flotación o sedimentación se pueden identificar mediante los métodos descritos en este capítulo. Los
líquidos de flotación/sedimentación pueden interferir a veces con las pruebas de diagnóstico. El exceso de
sacarosa puede reducir tanto la unión de los ooquistes a los portas de vidrio como la posterior unión del
anticuerpo; la exposición prolongada a NaCl puede distorsionar la morfología y la morfometría, y la
formalina puede reducir la sensibilidad de las reacciones de PCR. Cuando se concentran los ooquistes, se
puede eliminar el exceso de líquido de flotación/sedimentación lavando el concentrado en agua y volviendo
a centrifugar. Después se aspira el sobrenadante y se desecha, teniendo cuidado de no alterar el
precipitado. Estos métodos de concentración son adecuados para cualquier líquido corporal que pudiera
contener ooquistes.
1.
Flotación
El principio de la flotación utiliza un medio de suspensión líquido, que es más denso que los ooquistes
que se van a concentrar. Por consiguiente, cuando se mezclan con el líquido de flotación, los
ooquistes suben hasta la superficie y pueden ser tomados de la película superficial y detectados
utilizando el método de referencia. Para que un líquido de flotación sea útil en diagnósticos, en los que
la morfología y la morfometría son factores críticos, el medio de suspensión no solamente debe ser
más pesado que el objeto que va a flotar sino que no debe producir un encogimiento o deformación
capaz de convertir al objeto en algo no diagnosticable (32). Los métodos de flotación en sacarosa, los
de flotación en sulfato de zinc y los de flotación en sal saturada son adecuados para la concentración
de ooquistes de Cryptosporidium. La siguiente es una descripción de los métodos utilizados para
preparar soluciones de flotación y para concentrar ooquistes.
•
Flotación en sacarosa
La solución de sacarosa (gravedad específica: 1,18) se prepara en un vaso de precipitado de vidrio
añadiendo 256 g de sacarosa a 300 ml de agua desionizada. La solución se calienta suavemente
(<60°C) y se agita continuamente con la ayuda de un agitador magnético sobre un agitador con placa
caliente, hasta que la sacarosa se disuelva totalmente. La solución de sacarosa se coloca en hielo o
en una refrigerador hasta que su temperatura se ajuste a 4°C. La solución de sacarosa fría se
transfiere a un cilindro medidor de 500 ml y se ajusta su gravedad específica a 1,18 añadiendo
suficiente agua fría desionizada (4°C). La solución de sulfato de zinc se transfiere a una botella de
vidrio con tapa de rosca, se etiqueta, se pone la fecha, las iniciales y se almacena a 4°C hasta su
utilización.
•
Flotación en sulfato de zinc
La solución de sulfato de zinc (gravedad específica: 1,18) se prepara en un vaso de precipitado de
vidrio añadiendo 100 g de sulfato de zinc a 300 ml de agua desionizada. La solución se calienta
suavemente (<60°C) y se agita continuamente con la ayuda de un agitador magnético sobre un
agitador con placa caliente, hasta que el sulfato de zinc se haya disuelto completamente. La solución
de sulfato de zinc se transfiere a un cilindro medidor de 500 ml y su gravedad específica se ajusta a
1,18 añadiendo suficiente agua fría desionizada (4°C). La solución de sulfato de zinc se transfiere a
una botella de vidrio con tapón de rosca, se etiqueta, se pone la fecha y las iniciales y se almacena a
4°C hasta su utilización.
•
Flotación en sal
Se prepara una solución de sal saturada (gravedad específica 1,2) añadiendo aproximadamente 200 g
de cloruro de sodio a 200 ml de agua desionizada. La solución se caliente suavemente (<60°C) y se
agita continuamente con la ayuda de un agitador magnético sobre un agitador con placa caliente. Se
añaden cantidades pequeñas de cloruro de sodio (aproximadamente 10 g) a intervalos de 10 minutos
hasta que la solución se sature. La solución salina saturada se decanta en una botella de vidrio limpia
y se coloca en hielo o en un refrigerador hasta ajustar la temperatura a 4°C. La solución de sal
saturada fría se transfiere a un cilindro medidor de 500 ml y se ajusta su gravedad específica a
1,2 añadiendo agua fría desionizada (4°C). La solución de sal saturada se transfiere a una botella de
vidrio con tapón de rosca y se etiqueta, se pone la fecha, las iniciales y se almacena a 4°C hasta su
utilización.
La salmuera es una solución acuosa concentrada de NaCl, que tiene una gravedad específica entre
1,120 y 1,200 dependiendo de las impurezas de la sal utilizada. Aunque resulta adecuada para la
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
9
Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
concentración de ooquistes de Cryptosporidium spp., algunos cistos de protozoos pueden llegar a
deformarse o abrirse en este líquido de flotación. El tiempo óptimo para examinar las muestras
obtenidas por flotación en salmuera está entre 5 y 20 minutos tras su recuperación de la flotación.
La flotación en centrifugación se ha utilizado también para recuperar ooquistes de Cryptosporidium (y
otros ooquistes de parásitos y óvulos) de las heces. La mayor parte de los métodos de flotación se
basan en modificaciones de la técnica de Clayton-Lane, en la que los ooquistes se concentran por
flotación y se recogen como gota pendiente en la parte inferior de un cubre de vidrio colocado sobre el
menisco positivo del líquido de flotación. La centrifugación se utiliza para separar las partículas más
densas que el líquido de flotación de los ooquistes y otras partículas que flotarán sobre la superficie
del líquido de flotación. La inclusión de una fase de centrifugación acelera la separación de los
ooquistes de otras partículas (y por tanto, la concentración de ooquistes) y minimiza el riesgo de que
el líquido de flotación afecte adversamente a la morfología y morfometría de los ooquistes. El operador
debería tener en cuenta los temas relacionados con salud y seguridad, incluyendo las heridas por
laceración y pinchazo, asociadas al manejo de los cubres.
Concentración de ooquistes de Cryptosporidium spp. por flotación

Procedimiento de la prueba
i)
Se debe llevar ropa protectora y guantes desechables. Se transfiere con un palillo aplicador
aproximadamente 1–2 g de heces5 a 3 ml de líquido de flotación en un tubo de ensayo de 12 ml y se
mezcla completamente. Si las heces son líquidas, se mezcla completamente, y se colocan 1–2 ml del
líquido dentro del tubo de ensayo.
ii)
Se añade, agitando suavemente el líquido suficiente de flotación para formar un menisco positivo en el
borde del tubo de ensayo. Se elimina cualquier partícula grande de la superficie y, si es necesario, se
añade más líquido de flotación para mantener este menisco positivo.
iii)
Se deja reposar durante 20 minutos, y después, teniendo mucho cuidado de no estropear el menisco
convexo, se retira suavemente con una pipeta desechable y se coloca suavemente sobre un porta de
microscopio6.
iv)
Se seca el frotis al aire a temperatura ambiente.
v)
Se fija el frotis7 con metanol durante 3 minutos.
Concentración de ooquistes de Cryptosporidium spp. por flotación en centrifuga
5
6
7
8
9
10

Procedimiento de la prueba
i)
Se debe llevar ropa protectora y guantes desechables. Se transfieren con un palillo aplicador
aproximadamente 1–2 g de heces8 a 3 ml de líquido de flotación en un tubo de centrífuga de 12 ml y
se mezcla completamente. Si las heces son líquidas, se mezcla completamente, y se colocan 1–2 ml
de la mezcla resultante en el tubo de centrífuga.
ii)
Se añade, agitando suavemente, el suficiente líquido de flotación para formar un menisco convexo en
el borde del tubo de centrífuga. Se retira cualquier partícula grande de la superficie y, si es necesario,
se añade más líquido de flotación para mantenerlo.
iii)
Se coloca el tubo de centrífuga en una centrífuga de mesa con cubetas oscilantes, y se coloca un
cubre de vidrio de 22 mm × 22 mm en el borde del tubo de centrífuga, de forma que aplane el menisco
positivo. Se añade un tubo de equilibrio si es necesario, y se centrifuga a 1.100 g9 durante 5 minutos.
iv)
Una vez parada la centrífuga, se recoge el cubre de vidrio, entre el dedo índice y el pulgar, por lados
opuestos del cubre. Se habrá formado una gota pendiente sobre la parte inferior del cubre. Colocar
cuidadosamente el cubre, con la gota pendiente hacia abajo sobre un porta de microscopio de vidrio.
2.
Sedimentación en centrífuga
Para heces consistentes, la muestra debería incluir porciones de la superficie y del interior de las heces.
Se recomiendan frotis relativamente gruesos para este procedimiento. Si el frotis es demasiado fino o demasiado grueso,
se perderán los ooquistes. Se puede conseguir un grosor adecuado cuando se pueden ver las manecillas del reloj de
pulsera o se puede leer el texto impreso en esta página a través de la preparación. Marcar el número de referencia de la
muestra sobre un porta de microscopio con un marcador de vidrio, y utilizar portas de microscopio distintos para cada
muestra. Alternativamente, se puede usar un lápiz para marcar la porción opaca de un porta de vidrio de microscopio.
Los frotis secados al aire, fijados con metanol, se pueden guardar a temperatura ambiente durante 6 meses antes de la
tinción.
Para heces consistentes la muestra debería incluir porciones de la superficie y del interior de las heces.
No es recomendable la centrifugación a velocidades superiores a 1.100 g durante periodos de tiempo más largos
(>5 minutos) ya que algunos parásitos pueden deformarse y/o quebrarse y colapsarse.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
Los parásitos se depositarán más rápidamente si la suspensión de heces se somete a centrifugación;
sin embargo, las partículas de alimentos sedimentarán también más rápidamente y pueden
enmascarar la presencia de parásitos en la película examinada. Para superar este problema potencial,
se pueden eliminar las partículas de alimento más grandes filtrando las heces emulsionadas antes de
la centrifugación a través de un tamiz con un tamaño de poro lo bastante grande para que los
parásitos pasen a su través, pero que retenga las partículas más grandes de alimento. Como este
procedimiento es más eficaz que la sedimentación por gravedad, una muestra fecal más pequeña
(500 mg–1g: el tamaño de un guisante) es suficiente para examen. La eficacia de la detección
aumenta añadiendo formalina para la fijación y el mantenimiento de los parásitos, y éter para eliminar
las grasas y los aceites. Tanto la formalina al 10% como el éter son bactericidas. Después de la
centrifugación, se puede ver un tapón graso en la interfase entre los dos líquidos, que puede adherirse
a las paredes interiores del tubo. La capa de éter, el tapón graso y la formalina de debajo se
desechan, y se retiene el precipitado completo para su examen.
Se han realizado muchas modificaciones de este procedimiento, y el protocolo siguiente es el método
típico utilizado en laboratorios de diagnóstico. Con este método se producen menos deformaciones en
los ooquistes de los protozoos que con la flotación en sulfato de zinc. Este método logra una
concentración de 15–50 veces mayor, dependiendo del parásito escogido, y proporciona un buen
concentrado de ooquistes de protozoos y de huevos de helmintos, que es satisfactorio desde el punto
de vista del diagnóstico. Todos los pasos que pueden generar aerosoles (excluyendo la
centrifugación) deben llevarse a cabo en una cabina de seguridad para la protección del operador.
Concentración de ooquistes de Cryptosporidium spp. mediante sedimentación en centrífuga (formol/éter)

Procedimiento de la prueba
i)
Se debe llevar ropa protectora y guantes desechables. Se muestrean aproximadamente 500 mg–1 g
de heces10 con un palillo aplicador11 y se colocan en un tubo de centrífuga limpio de 12–15 ml que
contenga 7 ml de formalina al 10%. Si las heces son líquidas, se colocan unos 750 µl en el tubo de
centrífuga.
ii)
Se rompe la muestra completamente y se la emulsiona utilizando un palillo aplicador.
iii)
Se filtra la suspensión resultante a través de un tamiz dentro de un vaso de precipitado, y después se
vierte el filtrado de nuevo dentro del mismo tubo de centrífuga12.
iv)
Se añaden 3 ml de dietil éter (o acetato de etilo13) a la solución con formalina, se sella el cuello del
tubo con un tapón de goma (o con el dedo pulgar enguantado sobre la parte alta del tubo) y se agita la
mezcla vigorosamente durante 30 segundos. Se invierte el tubo varias veces durante ese
procedimiento y se libera la presión desarrollada retirando el tapón de goma suavemente (o el dedo
pulgar) lentamente.
v)
Se centrifuga el tubo a 1.100 g14 durante 2 minutos.
vi)
Se desprende el tapón graso con un palillo de madera pasando el palo entre la pared interior del tubo
y el tapón. Se desecha el tapón y el líquido superior e inferior invirtiendo el tubo, permitiendo que solo
caigan de nuevo dentro del tubo la última o las dos últimas gotas. Se elimina este líquido, que contiene
dietil éter y formalina, en un contenedor de desechos líquidos marcado.
vii)
Se suspende de nuevo el precipitado mediante agitación15. Se vierte todo o la mayor parte del
precipitado resuspendido en un porta para microscopio, o se transfiere al porta con una pipeta
desechable y se seca al aire.
Existe un dispositivo comercial para concentrar huevos de helmintos, larvas y quistes y ooquistes de
protozoos que utiliza el método de la formalina-éter. Es un sistema cerrado que se vende como el
10
11
12
13
14
15
El equivalente al tamaño de un guisante.
Esta muestra debe incluir porciones de la superficie y del interior de las heces consistentes.
Un tamaño de poro de 425 µm, 38 mm de diámetro, es equivalente al Estándar Británico de malla 36 (BS 410-86) o al
Estándar Americano de malla 40 (ASTM E11-81). El borde del tamiz debe ajustar perfectamente en el borde del vaso de
precipitado. Los restos atrapados en el tamiz se eliminan invirtiendo el tamiz y pasando una corriente de agua del grifo a
través de la malla. Tanto el tamiz como el vaso de precipitado deben lavarse totalmente con agua corriente entre cada
muestra.
El acetato de etilo, aunque menos inflamable que el dietil éter es, sin embargo, inflamable, por lo que el procedimiento
debe llevarse a cabo en áreas bien ventiladas, asegurándose de que no hay llamas libres. Evitar respirarlo durante
mucho tiempo o el contacto con la piel.
No se aconseja la centrifugación a velocidades superiores a 1.100 g durante periodos más largos (5 minutos), ya que
algunos parásitos pueden deformarse y/o romperse y colapsarse.
Un precipitado demasiado grande indica una o más de las siguientes causas: centrifugación superior a la velocidad y/o
tiempo recomendado, agitación insuficiente (paso iv), o muestra fecal demasiado grande.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
11
Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
“concentrador fecal de parásitos”16 y consiste en dos tubos de polipropileno, uno de fondo plano para
emulsionar las heces, y otro cónico utilizado para la centrifugación, con un filtro interconectado. El método
explicativo indica que se pueden utilizar tanto muestras fecales frescas como conservadas (10% de
formalina, mertiolato-ioduro-formalina, alcohol polivinílico y acetato sódico-formalina).
g)
Métodos convencionales de tinción
Tanto el método mZN como el AP son eficaces para detectar ooquistes de Cryptosporidium en heces (5, 6,
32, 37). Los portas teñidos con mZN deben examinarse con una lente objetivo ×40 y los potenciales
ooquistes se deben confirmar y medir con la lente objetivo ×100 (morfología y morfometría) utilizando un
microscopio de campo claro con un ocular de ×10. Los portas teñidos con AP necesitan un microscopio de
epifluorescencia equipado con un filtro para isotiocianato de fluoresceína (FITC) (excitación a 490 nm;
emisión a 510 nm). Un filtro UV (excitación a 355 nm, emisión a 450 nm) puede ayudar a visualizar los
esporozoitos teñidos con AP. Los portas teñidos con AP se pueden analizar con lentes de objetivo de ×20 y
los ooquistes con morfología típica se pueden confirmar con lentes de objetivo ×40. El objetivo ×100 debe
utilizarse para todas las medidas morfométricas (tamaño). Los ooquistes teñidos con AP observados con
los filtros para FITC o UV pueden medirse incrementando lentamente el voltaje (intensidad luminosa) de la
fuente luminosa de campo claro, de modo que las imágenes por fluorescencia y por campo claro se puedan
ver a la vez. El objeto se puede medir entonces con el calibrador ocular.

Calibración del tamaño utilizando los micrómetros ocular y objetivo
El diagnóstico de organismos intactos necesita a menudo la medida del tamaño y forma del organismo en
cuestión (morfometría), para asegurar que entra dentro del rango aceptado de parámetros estándar (por
ejemplo, tamaño y forma) de la especie determinada. A nivel microscópico, la medida de los objetos <1mm
se consigue por medio de un micrómetro objetivo utilizado en conexión con un micrómetro ocular.
Los objetos se miden en unidades del Sistema Internacional (SI) y la unidad estándar de medida para
microscopía convencional es la micra (µ= 0,001 mm).
El micrómetro objetivo es un porta de vidrio de 76 × 26 mm, en el que se ha grabado 1 mm dividido en
100 partes iguales (1 parte es igual a 10µm). El micrómetro ocular es un disco de vidrio o de plástico
transparente con una escala graduada. Cuando el microscopio de enfoca sobre el objeto a medir, se enfoca
simultáneamente tanto la escala del micrómetro ocular como la imagen del objeto. La escala estándar en el
micrómetro objetivo suele ser 1 o 2 mm.
Cuando se va a medir, se escoge la lente objetivo adecuada, que depende del aumento requerido, y se
determina el número de divisiones correspondientes a la longitud o anchura de la imagen del objeto en la
escala del micrómetro ocular. La medida observada se traduce a longitud real (que corresponde al número
de divisiones del micrómetro ocular que representan el parámetro a medir que se ha elegido) sustituyendo
el objeto por el micrómetro objetivo y determinando el número de divisiones en el micrómetro ocular que
corresponde a un número definido de divisiones de la escala milimétrica del micrómetro objetivo, al mismo
aumento.
Recuérdese que el cálculo del valor de la división de la escala del micrómetro ocular, en longitud real, solo
es válida para el aumento de la lente objetivo escogida. Hay que calcular el valor de una división del
micrómetro ocular para cada objetivo a aumentos diferentes del microscopio.
Como la morfometría es un componente importante del diagnóstico parasitológico, se tienen que realizar
medidas repetidas de objetos similares presentes en una muestra, o de distintos objetos de tamaño variable
en distintas muestras, que requieren utilizar varios aumentos. Determinando el valor micrométrico de la
escala ocular para cada lente objetivo usada, se puede evitar el intercambio constante entre objetos y
micrómetros oculares. Esto facilita el cálculo morfométrico rápido en milímetros o fracciones de milímetro
con cualquiera de las lentes objetivo disponibles.
El retículo graduado se coloca en el ocular desmontando el componente inferior del ocular y colocándolo en
el tubo. Debe asentarse correctamente antes de volver a ajustar el componente inferior del ocular. Hay que
asegurarse de que el diámetro de la pieza que lleva el retículo graduado es similar al diámetro interno del
tubo que lleva la lente. No debe tocarse la superficie de la pieza que lleva la graduación, y hay que
sostenerla por sus bordes, asegurándose de que esté libre de polvo y grasa. La lente ocular se enfoca
sobre la graduación ajustándola hasta que la escala se vea de forma nítida.
La determinación se lleva a cabo como se indica a continuación:
16
12
FPC, Evergreen Scientific, 2300 East 49th Street, P.O. Box 58248, Los Angeles, California 90058, USA;
http://www.evergreensci.com/micro/hfpc.htm
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
i)
Se inserta el micrómetro ocular en el microscopio, con la escala ya enfocada, comprobando que la
escala graduada está en posición correcta.
ii)
Se selecciona la lente objetivo de menor aumento (por ejemplo, objetivo de ×10) y se enfoca el
microscopio en el micrómetro objetivo, rotando el ocular y posicionando el micrómetro objetivo hasta
que las escalas del micrómetro ocular y del micrómetro objetivo se superpongan.
iii)
Se cuenta el número de divisiones del micrómetro objetivo que corresponden exactamente a un
número entero de divisiones del micrómetro ocular.
iv)
Se divide el valor observado en el micrómetro objetivo por el número de divisiones contado en la
escala del micrómetro ocular para determinar el valor de cada división en la escala del micrómetro
ocular.
v)
Se repite lo anterior para cada lente objetivo17.
vi)
Se mantiene cerca o acoplado al microscopio (por ejemplo, en una tabla pegada en el frontal del
microscopio) un registro permanente del cálculo del valor de cada división del micrómetro ocular para
cada lente objetivo.

Ejemplo
Para lente objetivo:
x divisiones oculares = y µm (en el micrómetro objetivo)
1 división ocular = y/x µm.

Examen microscópico de una muestra
La muestra debe examinarse de manera sistemática. La observación debería comenzar utilizando la lente
objetivo más baja para asegurar la visión de la muestra completa. Un esquema sugerido es el siguiente:
comenzar por el ángulo superior izquierdo de la muestra, moviéndose por el porta de izquierda a derecha,
con una anchura de campo visual cada vez, hasta alcanzar el ángulo superior derecho. Bajar una altura de
campo y continuar moviéndose por el porta de derecha a izquierda, campo a campo, hasta el borde
izquierdo de la muestra. Continuar de esta manera hasta llegar al fin de la muestra (esquina inferior
derecha). Durante este período de observación debe ajustarse continuamente el enfoque fino de modo que
se observe también la muestra en profundidad. Cuando se localiza un objeto sospechoso, se examina a
mayor aumento y se considera o se ignora. Si el aumento de la imagen del objeto es insuficiente para
visualizar características morfológicas con la lente objetivo superior (seca), debe utilizarse entonces la lente
objetivo de inmersión (× 100). Se pueden sellar montajes en húmedo con esmalte para uñas o con un
sellador permanente.
Ni el tamaño de los ooquistes, que oscila entre 4 y 6 µm (véase el cuadro 1), ni las tinciones con colorantes
ni las basadas en fluorescencia permiten determinar la especie de criptosporidio presente. Para los
mamíferos domésticos, se admite que la mayoría de las infecciones se deben a C. parvum, de modo que
puede hacerse un diagnóstico inicial de criptosporidiosis por C. parvum. Sin embargo, la presencia de
ooquistes de ese tamaño no indica necesariamente que la especie infecciosa sea C. parvum. De modo
similar, en el caso de las aves, se puede hacer un diagnóstico preliminar de criptosporidiosis por C. baileyi,
C. meleagridis o C. galli dependiendo del sitio de la infección y del tamaño de los ooquistes. La
identificación molecular de la especie/genotipo/subtipo se puede realizar con posterioridad.

Descripción de los resultados del examen microscópico
Las muestras negativas deben describirse como “No se observan ooquistes de Cryptosporidium”.
Las muestras positivas deben describirse como “Se observan ooquistes de Cryptosporidium”.
Para muestras positivas se puede utilizar un sistema indicativo basado en el número de ooquistes
observados con la lente objetivo de ×40. No obstante, el examen microscópico no puede considerarse
como una determinación cuantitativa, ya que el número de ooquistes varía considerablemente a lo largo de
la infección.
+ = menos de 5 ooquistes por porta
++ = de 1 a 10 ooquistes por campo visual
+++ = 11 o más ooquistes por campo visual
17
Hay que tener en cuenta que el valor calculado en milímetros para cada división del micrómetro ocular es diferente para
lentes objetivos de diferente aumento, con valores calculados de longitud real menor para cada división del micrómetro
ocular a medida que incrementa el aumento.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
13
Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis

Método de Ziehl—Neelsen modificado (mZN)
Fucsina fenicada fuerte: Disolver 20 g de fucsina fenicada en 200 ml de metanol absoluto y mezclar con
una agitador magnético hasta su disolución. Añadir con cuidado 125 ml de fenol líquido (GPR [80% p/p en
agua destilada]) hasta que se mezcle bien y llevar el volumen final a 1.675 ml con agua desionizada.
Mezclar exhaustivamente. Filtrar antes de usar a través de papel de filtro Whatman No. 1 para eliminar
restos, y conservar en una botella de reactivo stock. Marcar con fecha e iniciales. Guardar el reactivo stock
en la oscuridad a temperatura ambiente.
También se dispone de preparaciones comerciales. A menudo la concentración de fucsina básica puede
variar entre límites aceptables de 1–3%.
1% de metanol ácido: Se añaden cuidadosamente 20 ml de ácido clorhídrico (GPR/SLR) a 1.980 ml de
metanol absoluto y se mezcla. Se pasa a una botella de reactivo stock, y se marca con la fecha e iniciales.
0,4% de verde malaquita: Se añaden 2 g de verde malaquita a 480 ml de agua desionizada y se mezcla con
un agitador magnético. Se filtra a través de papel de filtro Whatman No.1, se pasa a una botella de reactivo
stock, y se marca con la fecha e iniciales.

Procedimiento de la prueba
Cada vez que se realiza el proceso, se incluye un porta de control positivo.
i)
Se debe llevar ropa protectora y guantes desechables. Se fijan los frotis secados al aire o los
concentrados18 con metanol durante 3 minutos.
ii)
Se sumerge el porta en fucsina fenicada fuerte en frío y se tiñe durante 15 minutos.
iii)
Se lava el porta con agua del grifo.
iv)
Se decolora con 1% de metanol ácido durante 10–15 segundos19.
v)
Se lava el porta con agua del grifo.
vi)
Se da coloración de contraste con 0,4% de verde malaquita durante 30 segundos.
vii)
Se lava el porta con agua del grifo.
viii) Se seca el porta al aire (el frotis puede examinarse con o sin cubre. Se extiende sobre el frotis un poco
de aceite de inmersión y se observa con lentes secas o con aceite de inmersión, sin la adición de
cubre. Un método alternativo es añadir el cubre y el medio de montaje y examinar después el frotis).
ix)
Se detecta la presencia de ooquistes examinando el porta con la lente objetivo de ×40 en un
microscopio de campo claro. Se confirma la presencia de ooquistes con la lente objetivo de aceite de
inmersión.
x)
Se miden la forma y el tamaño de los cuerpos coloreados de rojo20.

Características diagnósticas de ooquistes de Cryptosporidium spp. teñidos con mZN
Los ooquistes de Cryptosporidium spp. se tiñen de rojo en un fondo verde pálido. El grado y proporción de
la tinción varían con los ooquistes individuales. Además, las estructuras internas toman el colorante con
distinta afinidad. Algunos pueden aparecer amorfos mientras que otros contienen las formas características
de los esporozoitos. Los ooquistes de Cryptosporidium parvum se presentan como discos con 4–6 µm de
diámetro. Las levaduras y los restos fecales se tiñen de rojo mate. Algunas esporas bacterianas pueden
retener también el color rojo, pero son muy pequeñas y no originan confusión.

Auramina-fenol
Auramina-fenol (AP): Se disuelven 3 g de fenol en 100 ml de agua desionizada y se añade lentamente 0,3 g
de Auramina O. Se filtra por papel de filtro Whatman No.1 y se pasa a una botella de reactivo stock. Se
marcan la fecha y las iniciales del reactivo. Se guarda a temperatura ambiente en una botella de vidrio
18
19
20
14
Para este procedimiento, se recomiendan frotis moderadamente gruesos
Debe evitarse la decoloración excesiva.
Los ooquistes de Isospora spp. se tiñen de rojo y aparecen como cuerpos ovoides alargados, estrechados al final y
conteniendo un zigoto granular o dos esporoblastos. Los ooquistes de Cyclospora spp. se tiñen de rosa y aparecen como
discos circulares (de 8–10 µm de diámetro) con una mórula central. El grado y proporción de la tinción varía en ooquistes
individuales. En muestras fecales, el ooquiste suele verse generalmente no esporulado.
Para este procedimiento se recomiendan frotis moderadamente gruesos.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
protegida de la luz con un tapón hermético. También son adecuados colorantes comerciales, como el
reactivo de Lempert.
3% de metanol ácido: Se añaden cuidadosamente 60 ml de ácido clorhídrico (GPR/SLR) a 1940 ml de
metanol absoluto y se mezcla. Se pasa a un frasco de reactivo stock, y se marca con la fecha e iniciales.
0,1% de permanganato potásico: Se añaden 0,5 g de permanganato potásico a 499,5 ml de agua
desionizada y se mezcla con un agitador magnético. Se filtra por papel de filtro Whatman No.1, se pasa a
un frasco de reactivo stock y se marca la fecha y las iniciales del reactivo.

Procedimiento de la prueba
Cada vez que se realiza el proceso, se incluye un porta de control positivo.
i)
Se ha de llevar ropa protectora y guantes desechables. Se fijan los frotis secados al aire o los
concentrados21 con metanol durante 3 minutos.
ii)
Se sumergen los portas en colorante AP durante 10 minutos.
iii)
Se lavan con agua del grifo para eliminar el exceso de colorante.
iv)
Se decoloran con 3% de alcohol ácido durante 5 minutos.
v)
Se da la tinción de contraste con 0,1% de permanganato potásico durante 30 segundos.
vi)
Se seca el porta al aire a temperatura ambiente22 (véase el paso (viii) del Ziehl–Neelsen modificado
(mZN), arriba).
vii)
Se examina la presencia de ooquistes en un microscopio de epifluorescencia equipado con filtros para
FITC, observando el porta con la lente objetivo ×20. Se confirma la presencia de ooquistes con la lente
objetivo ×40.
viii) Se mide la forma y el tamaño de los cuerpos fluorescentes23.

Características diagnósticas de los ooquistes de Cryptosporidium spp. teñidos con AP.
Los ooquistes de Cryptosporidium spp. parecen circulares u ovoides y muestran una fluorescencia típica
verde-manzana sobre un fondo oscuro. Los ooquistes de Cryptosporidium parvum son circulares o con
forma anular, con diámetro de 4–6 µm. Si es posible, se examina la preparación con un filtro para UV
(excitación a 355 nm, emisión a 450 nm), ya que los esporozoitos son visibles más fácilmente bajo UV que
con el filtro para FITC. Con el filtro para UV, los ooquistes son de color verde pálido y los esporozoitos,
amarillo verdosos.

Cultivo
No hay un método reproducible para el cultivo de Cryptosporidium spp. de líquidos corporales. Se han descrito
técnicas de cultivo celular in vitro para ooquistes infectantes semipurificados, pero no se han probado lo
suficiente con aislamientos y materiales inhibidores como para ser recomendadas con fines rutinarios.

Métodos inmunológicos
Han resultado útiles tres sistemas de detección inmunológica de ooquistes de Cryptosporidium y se han
comercializado varios kits. Cada uno tiene un nivel similar de sensibilidad y puede emplear muestras fecales
concentradas y no concentradas, dependiendo del número probable de ooquistes en la muestra. Los equipos
basados en la inmunoflorescencia, en los que se utiliza MAb anti-Cryptosporidium conjugado con isotiocianato de
fluorescina que reconoce los epítopos expuestos en la superficie de los ooquistes (FITC-C-MAb), son más
específicos, y pueden ser más sensibles a la hora de detectar ooquistes de Cryptosporidium en los frotis de
heces que las técnicas de tinción convencionales. Comparados con las técnicas de tinción convencionales, los
equipos de detección basados en anticuerpos (inmunofluorescencia, ELISA e inmunocromatografía) parecen
caros, si se tienen en cuenta que a muchos de ellos se les atribuye un umbral de detección similar.
21
22
23
Se recomiendan frotis moderadamente gruesos para este procedimiento.
No secar los portas con papel secante, ya que algunos papeles secantes contienen fibras fluorescentes
Los ooquistes potenciales se determinan aumentando lentamente el voltaje (intensidad de luz) de la fuente luminosa, de
modo que se puedan ver al mismo tiempo las imágenes en fluorescencia y en campo claro. Los objetos pueden medirse
entonces con el micrómetro ocular.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
15
Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
a)
Inmunofluorescencia directa
En la inmunofluorescencia directa, un anticuerpo marcado con FITC contra epítopos superficiales
específicos del género se une a los ooquistes de los criptosporidios presentes en la muestra. Utilizando un
sistema de filtro para FITC, la excitación con luz UV (longitud de onda de máxima excitación 490 nm,
longitud de onda media de emisión 530 nm) causa que los ooquistes marcados muestren una fluorescencia
verde-manzana brillante. Los materiales incluidos en los equipos de diagnóstico comerciales varían, pero
normalmente incluyen controles positivos y negativos de ooquistes de C. parvum, MAb anti-Cryptosporidium
marcado con FITC (suministrado a la dilución de trabajo) y un medio de montaje con glicerol que incorpora
un inhibidor de la foto-decoloración. En cada prueba deben incluirse siempre muestras conocidas positivas
y negativas.
Los frotis fecales secados al aire o los concentrados fecales se fijan con metanol absoluto (o con acetona,
dependiendo de las instrucciones del fabricante) y se secan. A menudo en los portas que se incluyen en el
equipo están escavados pocillos en los que se ponen tanto las muestras como los reactivos. Deben
seguirse las instrucciones del fabricante. No conviene diluir los reactivos suministrados para incrementar el
volumen de la prueba. El MAb anti-Cryptosporidium específico de género y marcado con FITC (MAb antiCryptosporidium) se aplica a la dilución de trabajo predeterminada sobre la muestra seca y fijada en el
porta. Se incuba horizontalmente en la oscuridad en una cámara húmeda. El exceso de anticuerpos se
elimina por un ligero lavado y se seca. Se coloca sobre la muestra medio de montaje y se aplica un cubre,
asegurándose de no retener burbujas de aire. Si no se suministra medio de montaje, resulta adecuada una
mezcla de 50% de glicerol no fluorescente y 50% de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (v/v). Las
muestras se observan con el objetivo ×20 y los ooquistes se confirman empleando la lente objetivo ×40,
realizando un recuento del número de ooquistes presentes. Los números se expresan como se ha indicado
anteriormente. En ausencia de un método comercializado, el método siguiente produce resultados
satisfactorios.
Se puede utilizar el fluorógeno nuclear, 4’6-diamidino-2-fenil indol (DAPI; [C16H15N5.2HCl, peso 350,2]),
para resaltar los núcleos de los esporozoitos dentro de los ooquistes fluorescentes, lo que suministra una
confirmación morfológica adicional (13, 34). El DAPI es un intercalante inespecífico del ADN, de modo que
el ADN de otras células que interfieren, como bacterias y levaduras, también será marcado. A una
concentración de trabajo de 0,4 µg/ml el DAPI resulta particularmente útil cuando se buscan ooquistes en
muestras no fecales (por ejemplo, en agua y alimentos). El DAPI se intercala en el núcleo de los
esporozoitos en ooquistes viables y no viables y origina una fluorescencia azul.
Se utiliza un filtro azul (excitación a 490 nm; emisión a 510 nm) para visualizar la localización del FITC-CMAb y una excitación ultravioleta (UV) (excitación a 355; emisión a 450 nm) para determinar la presencia de
los núcleos de los esporozoitos teñidos con DAPI.

Procedimiento de la prueba
Se incluye un porta de control positivo y negativo cada vez que se realiza el proceso. Los portas positivos y
negativos se suministran con la mayoría de los equipos de diagnóstico de inmunofluorescencia, y los
ooquistes de C. parvum pueden comprarse a proveedores comerciales24.
Otras fuentes diferentes a C. parvum pueden estar disponibles en los laboratorios veterinarios de
diagnóstico o en institutos o instalaciones de investigación. Los distribuidores locales también pueden
suministrar ooquistes obtenidos comercialmente.
24
25
26
16
i)
Se ha de llevar ropa protectora y guantes desechables. Se fijan los frotis secados al aire o los
concentrados con metanol durante 5 minutos25.
ii)
Se colocan 50 µl de MAb anti-Cryptosporidium a la dilución de trabajo en el pocillo de cada porta.
Debe asegurarse un recubrimiento completo del pocillo26.
iii)
Se coloca el porta preparado en una cámara húmeda por encima del material absorbente utilizado
para generar humedad. Se comprobar que el material absorbente está húmedo.
iv)
Se coloca la cámara húmeda en un incubador a aproximadamente 37°C durante el tiempo indicado
por el fabricante (normalmente 30–60 minutos)22.
Por ejemplo, a Kate Miller, Sterling Parasitology Laboratory, University of Arizona, Dept of Veterinary Science and
Microbiology, Building 90, Room 308, Tucson, Arizona, 85721, USA; millerk@email.arizona.edu o Geoff and Sue
Pritchard, Bunch Grass Farm, 1301 Drury Road, Deary, Idaho, 83823, USA. pritchard@turbonet.com
Alternativamente, dejar evaporar el metanol hasta que se produzca sequedad a temperatura ambiente.
Los volúmenes, los tiempos, etc. pueden variar según las instrucciones de los fabricantes. Deben seguirse siempre
dichas instrucciones.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
v)
Con un aspirador tipo Büchner, se aspira suavemente el exceso de MAb de cada pocillo. Se mueve la
placa hacia el operador con un ángulo de 45º de la horizontal y se aspira el líquido que queda en el
fondo del pocillo colocando la punta del aspirador cerca del líquido, pero sin tocarlo. La succión del
aspirador eliminará el líquido. Se repite esta operación en cada pocillo de portas que contengan una
muestra.
vi)
Se colocan 50µl de PBS en cada pocillo y se dejan así durante 2 minutos a temperatura ambiente 22.
vii)
Se aspira suavemente el PBS de cada pocillo como se ha indicado en el paso (v). Se añaden otros
50µl de PBS a cada pocillo y se dejan otros 2 minutos antes de aspirar suavemente el PBS como se
ha descrito 22.
viii) Se añaden a cada pocillo 50 µl de DAPI 1/5000 en solución de PBS y se deja durante 2 minutos a
temperatura ambiente. La solución de trabajo de DAPI se prepara diluyendo una solución stock de
2 mg/ml de DAPI a 1/5000 en PBS (150 mM, pH 7,2). La solución de trabajo debe prepararse cada día
que se necesite. La solución stock de DAPI (2 mg/ml en metanol) puede guardarse en la oscuridad a
4°C indefinidamente.
ix)
Se aspira suavemente la solución de DAPI de cada pocillo como se describe en el paso (v).
x)
Se añaden 50 µl de agua desionizada a cada pocillo y se dejan durante 1–3 segundos a temperatura
ambiente; después se aspira suavemente el agua desionizada de cada pocillo como se describe en el
paso (v).
xi)
Se depositan 50 µl de medio de montaje en el centro de cada pocillo de cada porta, luego se aplica
suavemente un cubre en el porta para microscopía.
xii)
Se deja asentar el cubre antes de analizar el porta27.
xiii) Se observa la preparación para ooquistes con el objetivo de ×20 y se confirma con el objetivo de ×40
de un microscopio de epifluorescencia equipado con un filtro para FITC. Se miden los ooquistes con el
objetivo ×10028. Si es necesario, se pueden guardar los portas en la oscuridad a temperatura
ambiente hasta su lectura.

Características diagnósticas de los ooquistes de Cryptosporidium spp. teñidos con MAb antiCyptosporidium marcado con FITC
Los ooquistes de Cryptosporidium spp. son redondos o ligeramente ovales y exhiben una fluorescencia
verde-manzana brillante con filtro para FITC. Sus medidas (largo × ancho) se presentan en el cuadro 1. A
menudo la fluorescencia tiene más intensidad en la circunferencia del ooquiste, sin roturas visibles de la
pared celular teñida. Si en el equipo se incluye el colorante azul de Evans, que reduce la fluorescencia
inespecífica, la fluorescencia de fondo será roja. La fluorescencia inespecífica es amarilla. Se ha de
observar siempre el control positivo para asegurarse de que el tamaño, la forma y el color del posible
ooquiste coincide con los del control positivo. El DAPI se intercala en los núcleos de los esporozoitos de
ooquistes viables y no viables originando una fluorescencia azul celeste. Con lentes de objetivo de
inmersión de ×100, el núcleo del esporozoito es esférico o subesférico, con aproximadamente 1 micra de
diámetro. En el caso de un ooquiste distorsionado, la demostración de cuatro núcleos fluorescentes en un
objeto de tamaño comparable al ooquiste ayuda a su identificación (13, 34).
b)
Detección de antígenos de Cryptosporidium spp. por enzimoinmunoensayo
En el ELISA se busca la presencia de antígenos de criptosporidios en las heces (coproantígeno).
Dependiendo del material comercial, los coproantígenos de Cryptosporidium se capturan y desarrollan con
una mezcla de anticuerpos mono y policlonales. Si se exceptúan el aumento del número de muestras y la
automatización, los equipos de detección de antígenos no ofrecen más sensibilidad ni ventajas que los
métodos descritos.
Los equipos de detección de antígeno por ELISA en “sandwich” que están comercializados contienen filas
de pocillos con anticuerpo fijado anti-Cryptosporidium para capturar los coproantígenos de Cryptosporidium,
anticuerpos anti-Cryptosporidium para desarrollar la reacción que están conjugados a un enzima
27 Estos montajes temporales pueden convertirse en semi-permanentes sellando los bordes del cubre con esmalte claro de
uñas. Dejar asentarse el cubre durante aproximadamente 30 minutos o 1 hora antes de sellar. Utilizando la brocha que
acompaña al esmalte de uñas, se aplica cuidadosamente el esmalte a lo largo del perímetro del cubre asentado, utilizando
la anchura de la brocha como guía para la anchura del esmalte aplicado. Debe asegurarse un recubrimiento uniforme por
todo el perímetro del cubre sin dejar huecos. Se deja secar el esmalte a temperatura ambiente antes de marcar el porta de
modo adecuado con un número propio de identificación. Si es necesario, se utiliza un escalpelo para quitar con cuidado el
exceso de esmalte secado y endurecido.
28 Los ooquistes potenciales se determinan aumentando lentamente el voltaje (intensidad de luz) de la fuente luminosa, de
modo que se puedan ver al mismo tiempo las imágenes en fluorescencia y en campo claro. Los objetos pueden medirse
entonces con el micrómetro ocular.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
17
Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
(frecuentemente la peroxidasa de rábano), substrato, un sistema para desarrollar el cromógeno/substrato y
solución de parada (que cuando se añade a la mezcla de reacción inhibe la catálisis enzimática posterior).
Se han elaborado para detectar antígenos de C. parvum en heces, pero también son capaces de detectar
epítopos comunes en infecciones no debidas a C. parvum. En las preparaciones comerciales se incluyen
muestras positivas y negativas, y normalmente contienen todos los reactivos necesarios para realizar el
análisis y las instrucciones del fabricante, que deben seguirse. No resulta conveniente diluir los reactivos
suministrados por el fabricante para aumentar la capacidad de la prueba. Normalmente, se incluye un
método explicativo y una fórmula para calcular el valor de corte y asignar resultados positivos o negativos a
las muestras. Los reactivos se guardan por lo general a 4°C cuando no se usan. Todos los reactivos deben
alcanzar la temperatura ambiente antes de utilización. El técnico deberá determinar siempre si existen
contraindicaciones derivadas del uso de una prueba comercial y del fijador de heces/muestras utilizado.
Debido a la variación en los métodos descritos para diferentes pruebas de tipo comercial, en este capítulo
no se incluye ningún método ELISA o IC de detección de coproantígeno.
c)
Detección de antígenos de Cryptosporidium mediante inmunocromatografía
En vez de apoyarse en la difusión molecular para estipular la tasa de unión al antígeno mediante el
anticuerpo de captura como en el formato ELISA, que normalmente tarda aproximadamente una hora por
cada reacción, en la inmunocromatografía de flujo lateral (IC), la velocidad de unión del antígeno al
anticuerpo de captura ligado a la fase sólida se aumenta por la acción de la absorción. Esto atrae
rápidamente a todos los fluidos a través de una membrana incluida en la cajita para inmunocromatografía y
reduce el tiempo requerido para el análisis de horas a minutos o segundos. Los antígenos solubles de
Crystosporidium en la muestra de prueba son atraídos dentro de la membrana y entran en contacto y se
unen a los anticuerpos inmovilizados obtenidos contra los antígenos de Cryptosporidium, lo cual aumenta
drásticamente la velocidad de la interacción del anticuerpo-antígeno. Las reacciones positivas son
cualitativas y se ven como una banda de color en un lugar específico de la membrana, normalmente
identificado por una línea en la caja inmunocromatográfica. El formato de ensayo puede variar de unos kits
comerciales a otros. Con respecto a la detección del antígeno mediante el ELISA, el técnico debe
determinar siempre si existen algunas contraindicaciones relacionadas con el uso de una prueba comercial
y el uso de algún fijador.
IC es un método alternativo apropiado para la detección del antígeno de criptosporidios en muestras de
heces y se ha informado de que la especificidad es alta (98–100%). Continúa el debate sobre si la IC (o el
ELISA) tiene una sensibilidad menor, igual o mayor que la de los métodos de tinción de ooquistes. Al igual
que ocurre con los métodos ELISA, los ensayos de IC pueden ser muy valiosos en casos de infección en
los que no hay presencia de ooquistes detectables. Debido a la variedad de los métodos descritos para
diferentes pruebas comerciales, en este capítulo no se incluye ningún método para la detección de
coproantígeno por IC.

Métodos de reconocimiento del ácido nucleico
La PCR es más sensible que los métodos convencionales y las pruebas inmunológicas para detectar ooquistes
en las heces, aunque la sensibilidad de los métodos publicados varía entre 1 y 106 ooquistes. A menudo estas
técnicas están restringidas a los laboratorios especializados. Se requiere atención al elegir los cebadores, pues
algunos amplifican ADN específico de género (amplicones) mientras otros amplifican ADN específico de especie.
Antes de su adopción rutinaria en el laboratorio clínico, deben resolverse la variabilidad de los métodos y las
dificultades inherentes a la amplificación de ácidos nucleicos de muestras fecales por la PCR.
Las muestras fecales pueden contener inhibidores de la PCR. Además de la bilirrubina y de las sales biliares, los
polisacáridos complejos son inhibidores potentes. Para evitar esta interferencia, la ebullición de muestras fecales
en 10% de polivinilpolipirrilidona (PVPP) antes de la extracción puede reducir la inhibición.
La mejor información sobre especie/genotipo/subtipo deriva del estudio de tres regiones genéticas (dos
correspondientes al ARNr 18S [18, 24, 45, 46] y una a la proteína de la pared del ooquiste de Cryptosporidium
[COWP] [15, 38]), de fragmentos génicos por PCR-RFLP y/o por secuenciación de amplicones. La amplificación
por PCR del ADN de criptosporidios utilizando los cebadores de ARNr 18S (CPB-DIAGF/R) de Johnson et al.
(18) origina productos cuya longitud varía de 428 a 455 pb. Se comentan los cebadores de Johnson et al. (9)
porque se han evaluado en reacciones cruzadas en un total de 23 organismos y los cebadores funcionan en una
variedad de matrices. La modificación por Ward et al. (40) del cebador inverso de Johson et al. (18) (substitución
de CPB-DIAGR por PW99R [TAA-GGA-ACA-ACC-TCC-AAT-CTC], que produce un amplicón de
aproximadamente 420 pb) es más sensible que CPB-DIAGR/R (18) tanto en las pruebas de PCR directas como
en las anidadas. Se requieren más estudios en diferentes matrices antes de que PW99R (40) se pueda
recomendar por completo para reemplazar a CPB-DIAGR. La prueba anidada con ARNr 18S (Nichols-Johnson;
24) también parece ser muy sensible.
18
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
Es esencial un enfoque multilocal para la caracterización de los aislamientos de Cryptosporidium spp. Una PCR
múltiple específica para alelos (MAS-PCR) basada en la secuencia del gen de la dihidrofolato reductasa
diferencia C. hominis (357 pb) de C. parvum (190 pb) en una reacción de un paso, que se puede distinguir en gel
de agarosa, sin necesidad de digestión de la endonucleasa y el análisis del RFLP, con lo que se reduce
considerablemente la duración del ensayo (12). La MAS-PCR es tan sensible como otras pruebas diagnósticas
orientadas al gen 18S del ARNr para la detección de C. hominis y C. parvum, y puede detectar más infecciones
por especies mixtas (C. hominis y C. parvum) que las pruebas del gen 18S de ARNr (12). Sin embargo, con la
MAS-PCR no se detectó el ADN de C. felis, C. canis, C. muris ni del genotipo I porcino de Cryptosporidium en
muestras de humanos (17), y no se ha establecido su utilidad para determinar la gama de especies patógenas
encontradas en muestras de ganado.
Actualmente no hay ninguna zona genética “estándar” recomendada para identificar especies, pero la RFLP o la
secuenciación de las zonas del gen de 18S del ARNr (44) suministran información de más especies que la zona
del gen COWP. Para detectar un pequeño número de ooquistes (< 100) de modo consistente, se necesita una
PCR anidada. En el laboratorio del autor se han probado extensamente dos técnicas PCR orientadas al gen 18S
del ARNr (24, 45, 46) y los cebadores de Nichols-Johnson (24) parecen ser más sensibles, sobre todo con
números bajos (< 10) de ooquistes de C. parvum, C. hominis, C. felis, y C. muris (24). La prueba de Xiao et al.
(45, 46), aunque es menos sensible, tiene la ventaja de que se pueden detectar todas las especies por RFLP,
particularmente C. parvum y C. hominis, cosa que no se puede hacer con la prueba de Nichols-Johnson (24).
El cuadro 3 contiene las especies de Cryptosporidium y los genotipos determinados por RFPL del amplicón
definido por los cebadores CPB-DIAGR/F tras la digestión simultánea con los enzimas de restricción VspI, DraI y
DdeI (24), que pueden identificar cinco especies importantes. El cuadro 4 contiene el resultado del RFLP de los
mismos amplicones digeridos separadamente con los enzimas de restricción Vspl/Asel, Sspl y Ddel según las
secuencias parciales/completas del gen 18S del ARNr disponibles en el GenBank (ref. 24 y datos no publicados).
El cuadro 5 contiene las especies y genotipos de Cryptosporidium determinados por el RFLP del amplicón
definido por los cebadores XR2/XF2 después de la digestión con los enzimas Asel y Sspl (45).
No todas las especies/genotipos de Cryptosporidium se pueden identificar mediante PCR-RFPL de las zonas del
18S del ARNr; sin embargo, la mayoría de las especies conocidas con impacto comercial en los animales
domésticos se identifican por PCR-RFPL. Se ha utilizado la secuenciación para diferenciar C. parvum de C. bovis
o el genotipo de Cryptosporidium de los cérvidos, pero también se les puede distinguir fácilmente mediante la
digestión con MboII (11). La secuenciación del amplicón puede ofrecer una mejor información que la PCR-RFPL,
pero es más costosa y lleva más tiempo. Actualmente, la disponibilidad de la secuenciación es muy variable en
distintas partes del mundo y, para las especies más importantes que afectan a los animales domésticos, la
prueba PCR-RFPL aún tiene que jugar un papel importante.
Una prueba de PCR-RFPL anidada en tubo único (15), que amplifica un fragmento del gen que codifica la
COWP, distingue entre C. hominis y C. parvum. Esta prueba se recomienda frente a la de la referencia 38 porque
es más sensible y ofrece una solución a la frecuente contaminación en las técnicas de la PCR anidada debida a
la re-amplificación de los productos de PCR. En esta prueba de la PCR anidada en tubo único, los cebadores
internos y externos se añaden a la mezcla inicial de reacción. La optimización de concentraciones de cebadores
y las temperaturas de anillamiento originan la amplificación preferencial de solo un tamaño en el producto,
definido por los cebadores internos.
No existe un método recomendado para extraer el ADN de ooquistes de Cryptosporidium, y no se ha establecido
por completo la sensibilidad de la mayoría de los métodos. El ADN de Cryptosporidium puede extraerse después
de la purificación parcial de los ooquistes utilizando una de las técnicas de flotación/sedimentación descritas
arriba o de los ooquistes de las heces tras la extracción mediante bolas de zirconio (20). Si el método de
concentración usual en el laboratorio es por sedimentación con formol-éter, los concentrados de ooquistes
adecuados para la lisis y la amplificación por la PCR se pueden preparar sustituyendo agua desionizada por la
formalina al 10% utilizada en el método descrito. Utilizando columnas comerciales de purificación, la pérdida de
ADN puede ser una consecuencia de la purificación, pero normalmente debe haber un número de ooquistes
presentes en la muestra para extraer suficiente ADN de Cryptosporidium para un análisis por PCRRFPL/secuenciación. La selección de una técnica de extracción del ADN adecuada es el paso más importante en
la determinación de la sensibilidad final de la detección del ADN del ooquiste.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
19
Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
Cuadro 3. Análisis estructural del gen 18S del ARNr definido por los cebadores CPB-DIAGR/F tras la digestión
simultánea con los enzimas de restricción VspI o AseI y DraI (tomado de la ref. 24)
Especies de Cryptosporidium
(longitud del amplicón en pb)
Número de sitios de
VspI/AseI
(ATTAAT)
Número de sitios
de DraI
(TTTAAA)
Fragmentos de
longitud en pb
C. hominis (438)
2
Ninguno
222; 112; 104
C. parvum (435)
2
Ninguno
219; 112; 104
C. muris (431 o 432)
1
Ninguno
319; 112
C. felis (455)
2
1
189; 112; 104; 50
C. baileyi (428)
2
1
128; 112; 104; 84
C. meleagridis (434)
3
Ninguno
171; 112; 104; 47
Cuadro 4. Especies de Cryptosporidium y genotipos determinados por el RFLP de los amplicones definidos por los
cebadores CPB-DIAG tras la digestión con los enzimas VspI o AseI, SspI y DdeI, según las secuencias
completas/parciales del gen 18S del ARNr disponibles del GenBank.
Especies de Cryptosporidium
(longitud del amplicón en pb)
VspI / AseI
SspI
DdeI
No. de acceso a
GenBank
C. hominis (438)
222, 104,112
264,111, 40,12, 11
204, 166,68
L16997
C. parvum (435)
219, 104,112
264, 108, 40,12, 11
201, 166, 68
L16996
C. muris (432)
320, 112
395, 37
224,166, 42
AF093498
C. andersoni (431)
319, 112
394, 37
265, 166
L19069
C. felis (455)
239, 104,112
401, 40,14
221, 166, 68
AF087577
C. baileyi (428)
212, 104,112
264, 164
262, 166
L19068
C. meleagridis (434)
171, 104,112, 47
264, 119, 40,11
200, 166, 68
AF112574
C. serpentis (430)
318, 112
380, 36,14
264, 166
AF093502
C. wrairi (435)
219, 104,112
264, 109, 40,11,11
201, 166, 68
AF115378
Cryptosporidium suis(435)
219, 104,112
375, 40, 11, 9
201, 166, 68
AF108861
C. saurophilum (432)
216, 108,112
264, 109, 40,19
198, 166, 68
AF112573
Cryptosporidium muris(439)
175, 104,112,48
264, 112, 40,12,11
205, 166, 68
AF108863
Cryptosporidium hurón (438)
174, 103,113, 48
264, 111, 40,23
204, 166, 68
AF112572
Cryptosporidium canis(429)
213, 104,112
264, 105, 40,20
195, 166, 68
AF112576
Cryptosporidium koala (436)
220, 104,112
264, 109, 63
202, 166, 68
AF108860
Cryptosporidium canguro (436)
220, 104,112
373, 63
202, 166, 68
AF112570
Cryptosporidium mono (436)
220, 104, 112
264, 109, 52, 11
202, 166, 68
AF112569
20
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
Cuadro 5. Especies de Cryptosporidium y genotipos determinados por RFLP de los amplicones definidos por los
cebadores XR2 / XF2 tras la digestión con los enzima AseI and Ssp1 (Reproducidos de la ref. 45).
Especies de Cryptosporidium
VspI
SspI
C. hominis
561, 104, 102, 70
449, 254, 111, 12, 11
C. parvum gen tipo A
628, 104, 102
449, 254, 108, 12, 11
C. parvum gen tipo B
625, 104, 102
449, 254, 119, 9
C. muris
731, 102
448, 385
C. andersoni
731, 102
448, 385
C. felis
476, 182, 104, 102
426, 390, 33, 15
C. baileyi
620, 104, 102
572, 254
C. meleagridis
456, 171, 104, 102
449, 254, 108, 11, 11
C. serpentis
729, 102
414, 370, 33, 14
C. wrairi
628, 104, 102
449, 254, 109, 11, 11
Cryptosporidium pig
632, 104, 102
453, 365, 11, 9
C. saurophilum
628, 104, 102
418, 255, 109, 33, 19
Cryptosporidium ratón
457, 175, 104, 102
449, 254, 112, 12, 11
Cryptosporidium hurón
457, 174, 104, 102
449, 254, 111, 12, 11
Cryptosporidium canguro, koala
631, 104, 102
441,254, 109, 33
Cryptosporidium perro
633, 102, 94
417, 254, 105, 33, 20
Cryptosporidium mono
559, 104, 102, 70
461, 254, 109, 11
El método siguiente es eficaz para extraer ADN de un número pequeño de ooquistes parcialmente purificados
(aproximadamente 10), y se utiliza en el laboratorio del autor (22, 24). Los ooquistes parcialmente purificados se
suspenden en 100 µl de tampón de lisis (50 mM de Tris/HCl, pH 8,5, 1 mM de ácido etilén diamino tetraacético,
pH 8,0, 0,5% de dodecil sulfato sódico [SDS]; Sigma-Aldrich®) y se someten a 15 ciclos de congelación y
descongelación (1 minuto en nitrógeno líquido; 1 minuto a 65°C). A continuación se transfieren las muestras a un
baño a 55°C, se añade proteinasa K (a una concentración final de 200 µg/ml) y se incuba durante 3 horas. Se
desnaturaliza la proteinasa K por calor (90°C, 20 minutos), se enfrían las muestras en hielo durante 1 minuto, se
centrifugan (16,000 g, 5 minutos) y se extraen 70 µl del sobrenadante para la amplificación por PCR. El SDS es
un inhibidor de la polimerasa Taq a concentraciones tan bajas como 0,01%; por tanto, es necesario neutralizar el
SDS del ADN extraído. La adición de Tween 20 al 2% neutraliza hasta el 0,05% de SDS.
Se depositan los reactivos para la reacción de PCR en tubos de pared fina de 0,5 ml. Cada tubo contiene 90 µl
de reactivos ya mezclados (200 µM de cada uno de los cuatro dNTPs, 200 nM de cada uno de los cebadores
CPB-DIAGR y CPB-DIAGF, seroalbúmina bovina a una concentración final de 400 µg/ml, 3,5 mM de MgCl2,
2,5 U de polimerasa Taq en tampón para PCR y Tween 20 a una concentración final de 2% para inactivar el SDS
al 0,05%). Finalmente, se introducen 10 µl de ADN molde y después 40 µl de aceite mineral. Las muestras se
someten a 39 ciclos de amplificación y los productos se visualizan después de teñir geles de agarosa al 1,4%
con bromuro de etidio (9).
En el cuadro 6 se presentan los cebadores y los protocolos de los pasos de ciclos para amplificar el fragmento
génico correspondiente al ARNr 18S (24, 45, 46) o al de COWP (15).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
21
Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis

Descripción de los resultados del análisis por PRC-RFLP/secuenciación
Las muestras negativas deben describirse como “NO se ha detectado ADN de Cryptosporidium”.
Las muestras positivas deben describirse como “Se ha detectado ADN de Cryptosporidium”, y, después de la
identificación de la especie respectiva a partir de los perfiles de RFLP presentados en el cuadro 2, se inserta la
especie/genotipo/subtipo identificados (véanse los cuadros 3 y 5).
Cuadro 6.Protocolos de los ciclos de la PCR para el gen 18S del ARNr (referencias 24, 45, 46) y de la PCR anidada
en tubo único para COWP (referencia 15)
Cebadores
Protocolo de pasos de ciclos
Ref.
CPB-DIAGF
AAG-CTC-GTA-GTT-GGA-TTT-CTG
CPB-DIAGR
TAA-GGT-GCT-GAA-GGA-GTA-AGG
80°C, 5 minutos; 98°C, 30 segundos
1 ciclo
55°C, 30 segundos; 72°C, 1 minuto; 94°C, 30 segundos 39 ciclos
72°C, 10 minutos
1 ciclo
4°C
absorber
24
XF1 (externo)
TTC-TAG-AGC-TAA-TAC-ATG-CG
XR1 (externo)
CCC-ATT-TCC-TTC-GAA-ACA-GGA
XF2 (interno)
GGA-AGG-GTT-GTA-TTT-ATT-AGA-TAA-AG
XR2 (interno)
AAG-GAG-TAA-GGA-ACA-ACC-TCC-A
94°C, 3 minutos
1 ciclo
94°C, 35 segundos; 55C, 45 segundos; 72°C, 1 minuto 35ciclos
72°C, 7 minutos
1 ciclo
4°C
absorber
45,
46
oocry3 (externo)
AGA-TTA-ACA-GAA-TGC-CCA-CCA-GGT-A
oocry4 (externo)
CCA-TGA-TGA-TGT-CCT-GGA-TTT-TGT-A
oocry1 (interno)
CCT-GGA-TAT-CTC-GAC-AAT
Oocry2 (interno)
GCG-AAC-TAA-TCG-ATC-TCT-CT
94°C, 5 minutos
94°C, 1 minuto; 67°C, 1 minuto; 72°C, 1 minuto
94°C, 1 minuto; 54°C, 1 minuto; 72°C, 1 minuto
72°C, 10 minutos
4°C
15
a)
1 ciclo
20ciclos
35 ciclos
1 ciclo
absorber
PCR cuantitativa en tiempo real
Los métodos de la PCR cuantitativa en tiempo real utilizan tecnologías patentadas (por ejemplo TaqMan™,
Applied Biosystems y LightCycler™, Roche Molecular Biochemicals). En ambas tecnologías se incorporan
tintes fluorogénicos al amplicón durante la PCR, y de esta manera aumenta la fluorescencia del amplicón a
medida que se genera más producto de la PCR. Con los dos sistemas se pueden detectar los productos de
la PCR durante los ciclos iniciales de la reacción de la PCR cuando la amplificación es exponencial, con lo
que se facilita el análisis cuantitativo del producto fluorescente. Se han utilizado métodos de la PCR
cuantitativa en tiempo real para identificar diferentes especies de Cryptosporidium mediante el
aprovechamiento del polimorfismo genético del gen 18S del ARNr para diseñar sondas con diferentes
temperaturas de fusión, y para la detección cuantitativa de los ooquistes de Crypstosporidium en muestras
de agua del medio ambiente y en aguas residuales. El aumento de la sensibilidad de la PCR en tiempo real
garantiza el aumento en la rapidez de detección y la calidad del diagnóstico mientras que la naturaleza
cuantitativa del ensayo será de gran valor en la estimación de los niveles de contaminación. El formato del
ensayo en “tubo cerrado” disminuye el peligro de contaminación durante el “transporte” (36). La PCR
cuantitativa en tiempo real será una herramienta muy útil en el futuro una vez que se haya superado la
problemática que afecta a la inhibición del efecto matriz. Actualmente no existen métodos estándar de la
PCR cuantitativa en tiempo real.
b)
Tipificación y subtipificación de la enfermedad y el rastreo de su origen
No se debe sobreestimar el valor de la caracterización de la diversidad genética de Cryptosporidium con
diferentes niveles de especificidad ni la importancia del análisis adecuado del ácido nucleico. Las
herramientas moleculares para la discriminación entre especies y dentro de las especies son diferentes (4)
y la publicación de las secuencias genómicas completas de C. parvum (1) y C. hominis (49) han servido de
ayuda para elaborar herramientas para la tipificación y subtipificación adecuadas (4). Los marcadores
genéticos se diferencian por el contenido de su información y se debe considerar cuidadosamente la
naturaleza del fragmento de ADN seleccionado para detectar y caracterizar Cryptosporidium y Giardia
(véase el cuadro 4 más adelante). Para detectar las especies, se requiere un análisis de las regiones de
codificación moderadamente conservadas o muy conservadas (ej. el ADN ribosómico del 18S, los genes
guardianes y estructurales), mientras que las investigaciones sobre la transmisión de genotipos y subtipos
22
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
mediante la identificación de las fuentes de infección y de los factores de riesgo, requiere el uso de un
mayor número de técnicas de determinación discriminatoria de huellas moleculares, que pueden identificar
aislamientos individuales o linajes clonales (4, 35).
Los sistemas de tipificación y subtipificación utilizados con las muestras veterinarias (y de humanos)
también deberían utilizarse en las muestras medioambientales, especialmente para el rastreo de la
enfermedad y su origen, con el fin de evitar cualquier confusión originada por el uso de diferentes sistemas
para hospedadores humanos, no humanos y muestras medioambientales en las investigaciones
veterinarias o médicas de los brotes de enfermedades (4, 35). La determinación de las especies debe
basarse en el análisis de al menos dos lugares ya que proporciona una información más consistente. Al
menos un lugar debe ser el 18S del ARNr, y, si es posible, el otro debe ser adecuado para la identificación
de la especie y el análisis ulterior de subtipificación. Para Cryptosporidium, se han utilizado la tipificación del
microsatélite y del minisatélite, la secuenciación del GP60 y el análisis de un elemento de ADN de doble
cadena para la subtificación de C. parvum and C. hominis, y esos procedimientos pueden ofrecer suficiente
discriminación de la subespecie en el curso de la investigación veterinaria o médica, de forma separada o
combinada (revisado en las referencias 4 y 35). Se requiere un desarrollo posterior de estos sistemas de
subtipificación, por ejemplo la secuenciación del gp60 muestra variabilidad dentro de las poblaciones de
C. parvum pero no de las de C. hominis. El objetivo sería encontrar identificadores comunes en los
aislamientos. También existen pruebas de que las infecciones mixtas de especies ocurren tanto en
humanos como en poblaciones de animales. Por tanto, es importante que los sistemas de tipificación y
subtipificación de especies sean capaces de identificar diversas infecciones para proporcionar un
diagnóstico y una información precisos. Un trabajo reciente ha confirmado la utilidad de marcadores
minisatélites y microsatélites en el estudio de la estructura de la población de Cryptosporidium, y en la
comprensión de la dinámica de la transmisión de la infección (revisada en las referencias 4, 8 y 35). En el
cuadro 7 se ofrece una lista de los ensayos de la PCR más utilizados para la detección y la tipificación de
Crystosporidium.
Cuadro 7. Lista de objetivos, tipo de ensayo y principal uso de las técnicas basadas en la amplificación para
Cryptosporidium (refs.4 y 35)
Objetivo de la
amplificación
Tipo de ensayo
Aplicación principal
PCR, PCR anidada, secuenciación, PCR-RFLP, PCR
en tiempo real, microarray
Identificación de especies y genotipos
Hsp70
PCR, PCR anidada, secuenciación, PCR en tiempo
real, microarray
Identificación de especies y genotipos
COWP
PCR, PCR anidada, secuenciación, PCR-RFLP,
microarray
Identificación de especies y genotipos
Actina
PCR, PCR anidada, secuenciación
Identificación de especies y genotipos
PCR, PCR anidada, secuenciación, PCR-RFLP
Identificación de especies y genotipos
PCR, PCR anidada, secuenciación
Identificación de subgenotipos
Microsatélites
PCR, PCR anidada, secuenciación, tipificación del
fragmento
Identificación de subgenotipos
Minisatélites
PCR, PCR anidada, secuenciación, tipificación del
fragmento
Identificación de subgenotipos
ARN de doble cadena
extra-cromosómico
Transcriptasa inversa, PCR, secuenciación, ensayo
de movilidad del heterodúplex
Identificación de subgenotipos
18S ADNr
-tubulina
GP60
Clave: RFLP = polimorfismo de longitud del fragmento de restricción; Hsp70 = proteína de choque caliente 70;
COWP = proteína de la pared del ooquiste de Cryptosporidium ; GP60 = glicoproteína 60.
2.
Pruebas serológicas (y/o pruebas de inmunidad celular si son relevantes)
A menudo la criptosporidiosis es una enfermedad del recién nacido y a falta de evidencia que excluya la
exposición a ooquistes infecciosos, las pruebas serológicas no ofrecen ninguna ventaja. Las pruebas serológicas
se pueden utilizar para análisis seroepidemiológicos: la mayoría se basan en técnicas de ELISA en las que se
utilizan extractos acuosos de ooquistes de C. parvum (por ejemplo, en la referencia 14). Las pruebas de
inmunidad celular no parecen ofrecer ventajas específicas, y no están disponibles.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
23
Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO
No hay ningún programa de control para la criptosporidiosis, ni existen vacunas disponibles que hayan sido
rigurosamente probadas y aceptadas.
REFERENCIAS
1.
ABRAHAMSEN M.S., TEMPLETON T.J., ENOMOTO S., ABRAHANTE J.E., ZHU G., LANCTO C.A., DENG M., LIU C.,
WIDMER G., TZIPORI S., BUCK G.A., XU P., BANKIER A.T. DEAR P.H., KONFORTOV B.A., SPRIGGS H.F., IYER L.,
ANANTHARAMAN V., ARAVIND L. & KAPUR V. (2004). Complete genome sequence of the apicomplexan,
Cryptosporidium parvum. Science, 304, 441–445.
2.
ANUSZ K.Z., MASON P.H., RIGGS M.W. & PERRYMAN L.E. (1990). Detection of Cryptosporidium parvum oocysts
in bovine feces by monoclonal antibody capture enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol., 28,
2770–2774.
3.
BLAGBURN B.L., LINDSAY D.S., HOERR F.J., ATLAS A.L. & TOIVIO-KINNUCAN M. (1990). Cryptosporidium sp.
infection in the proventriculus of an Australian diamond firetail finch (Staganoplura bella: Passeriformes,
Estrildidae). Avian Dis., 34, 1027–1030.
4.
CACCIÒ S.M., THOMPSON R.C.A., MCLAUCHLIN J. & SMITH H.V. (2005). Unravelling Cryptosporidium and
Giardia epidemiology. Trends Parasitol., 21, 430–437.
5.
CASEMORE D.P. (1991). Laboratory methods for diagnosing cryptosporidiosis. Broadsheet 128. J. Clin.
Pathol., 44, 445–451.
6.
CASEMORE D.P., ARMSTRONG M. & SANDS R.L. (1985). Laboratory diagnosis of cryptosporidiosis. J. Clin.
Pathol., 38, 1337–1341.
7.
CURRENT W.L. (1997). Cryptosporidiosis. In: Diseases of Poultry, Tenth Edition, Calnek B.W., Barnes H.J.,
Beard C.W., McDougald L. R. & Saif Y.M. eds. Mosby-Woolfe, Mosby International, Lynton House, 7–
12 Tavistock Square, London WC1H 9LB, UK, 883–890.
8.
ENEMARK H.L., AHRENS P., JUEL C.D., PETERSEN E., PETERSEN R.F., ANDERSEN J.S., LIND P. & THAMSBORG S.M.
(2002). Molecular characterization of Danish Cryptosporidium parvum isolates. Parasitology, 125, 331–341.
9.
FAYER R. (2008). General biology of Cryptosporidium. In: Cryptosporidiosis of Man and Animals, Fayer R. &
Xiao L. eds. CRC Press and IWA Publishing, 1075 Boca Raton, FL, USA, 1–42.
10. FAYER R., SANTIN M. & XIAO L. (2005). Cryptosporidium bovis n. sp. (Apicomplexa: Cryptosporidiidae) in cattle
(Bos taurus). J. Parasitol., 91, 624–629.
11. FENG Y., ORTEGA Y., HE G., DAS P., ZHANG X., FAYER R., GATEI W., CAMA V. & XIAO L. (2007). Wide
geographic distribution of Cryptosporidium bovis and the deer-like genotype in bovines. Vet. Parasitol., 144,
1–9.
12. GILES M., WARHURST D.C., WEBSTER K.A., WEST D.M. & MARSHALL J.A. (2002). A multiplex allele specific
polymerase chain reaction (MAS-PCR) on the dihydrofolate reductase gene for the detection of
Cryptosporidium parvum genotypes 1 and 2. Parasitology, 125, 35–44
13. GRIMASON A.M., SMITH H.V., PARKER J.F.W., BUKHARI Z., CAMPBELL A.T. & ROBERTSON L.J. (1994). Application
of DAPI and immunofluorescence for enhanced identification of Cryptosporidium spp. oocysts in water
samples. Water Res., 28, 733–736.
14. HILL B.D., BLEWETT D.A., DAWSON A.M. & WRIGHT S.E. (1990). Analysis of the kinetics, isotype and specificity
of serum and coproantibody in lambs infected with Cryptosporidium parvum. Res. Vet. Sci., 48, 76–81.
15. HOMAN W., VAN GORKOM T., KAN Y.Y. & HEPENER J. (1999). Characterization of Cryptosporidium parvum in
human and animal feces by single-tube nested polymerase chain reaction and restriction analysis. Parasitol.
Res., 85, 707–712.
24
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
16. INTERNATIONAL AIR TRANSPORT ASSOCIATION (2003). Dangerous Goods Regulations, 44th Edition. International
Air Transport Association, 800 Place Victoria, P.O. Box 113, Montreal, Quebec H4Z 1M1, Canada, 815 pp.
17. JIANG J. & XIAO L. (2003). An evaluation of molecular diagnostic tools for the detection and differentiation of
human-pathogenic Cryptosporidium spp. J. Eukaryot. Microbiol. 50, Suppl: 542-547.
18. JOHNSON D.W., PIENIAZEK N.J., GRIFFIN D.W., MISENER L. & ROSE J.B. (1995). Development of a PCR protocol
for sensitive detection of Cryptosporidium in water samples. Appl. Environ. Microbiol., 61, 3849–3855.
19. KORICH D.G., MARSHALL M.M., SMITH H.V., O’GRADY J., BUKHARI Z., FRICKER C.R., ROSEN J.P. & CLANCY J.L.
(2000). Inter-laboratory comparison of the CD-1 neonatal mouse logistic dose-response model for
Cryptosporidium parvum oocysts. J. Eukaryot. Microbiol., 47, 294–298.
20. MCLAUCHLIN J., PEDRAZA-DIAZ S., AMAR-HOETZENEDER C. & NICHOLS G.L. (1999). Genetic characterization of
Cryptosporidium strains from 218 patients with diarrhea diagnosed as having sporadic cryptosporidiosis. J.
Clin. Microbiol., 37, 3153–3158.
21. MORGAN U.M., MONIS P.T., XIAO L., LIMOR J., IRSHAD S., RAIDAL S., O’DONAGHUE P., GASSER R., MURRAY A.,
FAYER R., BLAGBURN B.L., LAL A.A. & THOMPSON R.C.A. (2001). Molecular and phylogenetic characterisation
of Cryptosporidium from birds. Int. J. Parasitol., 31, 289–296.
22. NICHOLS R.A.B., CAMPBELL B.M. & SMITH H.V. (2003). Identification of Cryptosporidium spp. oocysts in UK still
natural mineral waters and drinking waters using a modified nested PCR-RFLP assay. Appl. Environ.
Microbiol., 69, 4183–4189.
23. NICHOLS R.A.B., CAMPBELL B.M. & SMITH H.V. (2006). Molecular fingerprinting of Cryptosporidium species
oocysts isolated during water monitoring. Appl. Environ. Microbiol., 72, 5428–5435.
24. NICHOLS R.A.B. & SMITH H.V. (2004). Optimisation of DNA extraction and molecular detection of
Cryptosporidium parvum oocysts in natural mineral water sources. J. Food Protect., 67, 524–532.
25. OKHUYSEN P.C, CHAPPELL C.L., CRABB J.H., STERLING C.R. & DUPONT H.L. (1999). Virulence of three distinct
Cryptosporidium parvum isolates for healthy adults. J. Infect. Dis., 210, 1275–1281.
26. PAVLASEK I. (1999).Kryptosporidie: biologie, diagnostika, hostitelské spektrum, specificita a vztah kživotnímu
prostředí (Cryptosporidia: biology, diagnosis, host spectrum, specificity and the environment). Remedia Klin.
Microbiol., 3 (9), 290–301 (in Czech).
27. PAVLASEK I. (2001). Nálezy kryptosporidií ve žlaznatém žaludku u slepic a u volně žijících a exotických ptáků
odchycených z volné přírody (Findings of cryptosporidia in the proventriculum of hens and in wild and exotic
birds). Veterinářství, 3,103–108 (in Czech).
28. POWER M. & RYAN U.M. (2008).
29. ROBERT B., GINTER A., COLLARD A. & COPPE P. (1990). Diagnosis of bovine cryptosporidiosis by enzymelinked immunosorbent assay. Vet. Parasitol., 37, 1–8.
30. RYAN U.M., XIAO L., READ C., SULAIMAN I.M., MONIS P., LAL A.A., FAYER R., & PAVLASEK I. A (2003).
Redescription of Cryptosporidium galli Pavlasek, 1999 (Apicomplexa: Cryptosporidiiae) from birds. J.
Parasitol.. 89, 809-813.
31. RYAN U.M., POWER M. & Xiao L. (2008). Cryptosporidium fayeri n. sp. (Apicomplexa: Cryptosporidiidae) from
the Red Kangaroo (Macropus rufus). J. Eukaryot. Microbiol., 55, 22–26.
32. SMITH H.V. (1992). Intestinal protozoa. In: Medical Parasitology: a Practical Approach, Hawkey P.M. &
Gillespie S.H., eds. IRL Press at Oxford University Press, Oxford, UK, 79–121.
33. SMITH H.V. (1998). Detection of parasites in the environment. Parasitology, 117, S113–S141.
34. SMITH H.V., CAMPBELL B.M., PATON C.A. & NICHOLS R.A.B. (2002). Significance of enhanced morphological
detection of Cryptosporidium sp. oocysts in water concentrates using DAPI and immunofluorescence
microscopy. Appl. Environ. Microbiol., 68, 5198–5201.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
25
Capítulo 2.9.4. - Criptosporidiosis
35. SMITH H.V., CACCIÒ S.M., TAIT A., MCLAUCHLIN J. & THOMPSON R.C.A. (2006). Tools for investigating the
abiotic transmission of Cryptosporidium and Giardia infections in humans. Trends Parasitol., 22, 160–166.
36. SMITH H.V. & NICHOLS, R.A.B. (2007). Cryptosporidium. In: Foodborne Diseases, Simjee, S.A. ed. Humana
Press Inc., New Jersey 07512-1165, USA, 233-276.
37. SMITH H.V. (2008). Diagnostics. In: Cryptosporidium and Cryptosporidiosis, Second Edition, Fayer R. & Xiao
L. eds. CRC Press and IWA Publishing, 1075 Boca Raton, FL, USA, 173-208.
38. SPANO F., PUTIGNANI L., MCLAUCHLIN J., CASEMORE D.P. & CRISANTI A. (1997). PCR-RFLP analysis of the
Cryptosporidium oocyst wall protein (COWP) gene discriminates between C. wrairi and C. parvum, and
between C. parvum isolates of human and animal origin. FEMS Microbiol. Lett., 150, 209–217.
39. STURDEE A.P., CHALMERS R.M. & BULL S.A. (1999). Detection of Cryptosporidium oocysts in wild mammals of
mainland Britain Vet. Parasitol., 80, 273–280.
40. WARD P.I., DEPLAZES P., REGLI W., RINDER H. & MATHIS A. (2002). Detection of eight Cryptosporidium
genotypes in surface and waste waters in Europe. Parasitology, 124, 359–368.
41. WEBER R., BRYAN R.T., BISHOP H.S., WALQUIST S.P., SULLIVAN J.J. & JURANEK D.D. (1991). Threshold of
detection of Cryptosporidium oocysts in human stool specimens: evidence for low sensitivity of current
methods. J. Clin. Microbiol., 29, 1323–1327.
42. WEBSTER K.A., SMITH H.V., GILES M., DAWSON L. & ROBERTSON L.J. (1996). Detection of Cryptosporidium
parvum oocysts in faeces: comparison of conventional coproscopical methods and the polymerase chain
reaction. Vet. Parasitol., 61, 5–13.
43.
WWW.KSU.EDU/PARASITOLOGY/ Click
on ‘Host checklist for C. parvum’
44. XIAO L., ESCALANTE L., YANG C., SULAIMAN I., ESCALANTE A. A., MONTALI R.J., FAYER R & LAL A.A. (1999).
Phylogenetic analysis of Cryptosporidium parasites based on the small-subunit rRNA gene locus. Appl.
Environ. Microbiol., 65, 1578–1583.
45. XIAO L., MORGAN U., LIMOR J., ESCALANTE A., ARROWOOD M., SHULAW W., THOMPSON R.C.A., FAYER R. & LAL
A.A. (1999). Genetic diversity within Cryptosporidium parvum and related Cryptosporidium species. Appl.
Environ. Microbiol., 65, 3386–3391.
46. XIAO L., SING A., LIMOR J., GRACZYK, T.K., GRADUS S & LAL A.A. (2001). Molecular characterisation of
Cryptosporidium oocysts in samples of raw surface water and wastewater. Appl. Environ. Microbiol., 67,
1091–1101.
47. XIAO L., FAYER R., RYAN U. & UPTON S.J. (2004). Cryptosporidium taxonomy: recent advances and
implications for public health. Clin. Microbiol. Rev., 17, 72–97.
48. XIAO L., RYAN U.M. (2008). Molecular epidemiology. In: Cryptosporidium and Cryptosporidiosis, Second
Edition, Fayer R. & Xiao L. eds. CRC Press and IWA Publishing, 1075 Boca Raton, FL, USA, 387-410.
49. XU P., WIDMER G., WANG Y., OZAKI L.S., ALVES J.M., SERRANO M.G., PUIU D., MANQUE P., AKIYOSHI D., MACKEY
A.J., PEARSON W.R., DEAR P.H., BANKIER A.T., PETERSON D.L., ABRAHAMSEN M.S., KAPUR V., TZIPORI S. & BUCK
G.A. (2004). The genome of Cryptosporidium hominis. Nature, 431, 1107–1112.
*
* *
26
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008