Implementación de una técnica de coloración para el diagnóstico

IMPLEMENTACIÓN DE UNA TÉCNICA DE COLORACIÓN PARA EL DIAGNÓSTICO
SIMULTÁNEO DE COCCIDIOS Y MICROSPORIDIOS
Combol, A.; Fernández, N.; Figueredo, E.; Acuña, A.M; Zanetta,
E.
Sección Enteroparasitosis. Dpto. de Parasitología y Micología. Instituto de
Higiene
Facultad de Medicina. Universidad de la República.Montevideo. Uruguay
Firmado
digitalmente por Dra.
Nora Fernandez
INTRODUCCIÓN
OBJETIVO
Los coccidios y microsporidios son protozoarios emergentes, agentes de una gran variedad
de entidades clínico-patológicas; por frecuencia las alteraciones del tubo digestivo son las
mas importantes, siendo la diarrea el síntoma principal y el hilo conductor
del
diagnóstico.
La diarrea se presenta fundamentalmente en individuos inmunocomprometidos por lo que
son considerados agentes oportunistas. Por otro lado, en inmunocompetentes son agentes
de diarrea del viajero. Cryptosporidium parvum es causa de diarrea aguda infantil y para los
microsporidios se establecido la portación asintomática.
Los elementos infectantes se eliminan con las heces: ooquistes en el caso de los coccidios
Cryptosporidium parvum e Isospora belli y esporas en el caso de los microsporidios Enterocytozoon
bieneusi y Encephalitozoon intestinalis.
La técnica de coloración Ziehl Neelsen modificado en frío o Kinyoun es la utilizada
habitualmente para el diagnóstico confirmatorio de coccidios; en tanto para el
diagnóstico de microsporidios en heces se recomienda la Tricrómica modificada.
METODOLOGÍA
CUADRO 1: REACTIVOS
Se procesaron un total de 50 muestras de heces
seleccionadas de nuestro laboratorio, las
cuales estaban preservadas en formol al 10% a
razón de 1: 3.
De ellas, 25 eran negativas para enteroparásitos
y 25 positivas correspondiendo: 18 a M, 3 a Cp y 1
a Ib. En 2 muestras se efectuó una mezcla de heces
1:1con M + Cp y en 1 se mezcló Cp + M + Ib.
Se confeccionaron frotis finos y se fijaron en
metanol.
Se colorearon en dos pasos, en primer lugar se
utilizó carbol fucsina para teñir los ooquistes
de coccidios y en segundo lugar la coloración
Tricrómica modificada por Didier para teñir
esporas de microsporidios.
Las láminas se observaron al MO con 1000
aumentos, durante 10 minutos . Cuadros 1 y 2
RESULTADOS
FIGURA 1
Ooquistes de Isospora
belli
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA
Solución de carbol-fucsina
25 ml de solución saturada de fucsina
alcohólica (2.0 g de fucsina básica en 25
ml de etanol 96º)
25 gr. de fenol, 500 ml de agua destilada
Decolorante
acido clorhídrico al 0.5 %
Tricrómica modificada por Didier
6.0 g Chromotrope 2R (Sigma)
0.5 g de azul de anilina
0.7 g de ácido fosfotúngstico
3 ml de ácido acético
Dejar a temperatura ambiente durante 30
minutos
Agregar 100 ml de agua destilada y
ajustar el pH a 2.5 con HCl 2N
Decolorante
4.5 ml de ácido acético en 995.5 ml de
Implementar una técnica de
coloración para el diagnóstico
s i m u lt á n e o d e c o c c i d i o s
Cryptosporidium parvum (Cp) e Isospora belli
CUADRO 2 : TÉCNICA
0
1-Sumergir en carbol-fucsina 1
minutos
2-Lavar con agua de la canilla
3-Decolorar con alcohol-ácido
clorhídrico 30
segundos
4-Lavar con agua de la canilla
3 0
5-Sumergir en Tricrómica a 37ºC
minutos
6-Lavar con agua de la canilla
7-Decolorar con alcohol-ácido
acético 10
segundos
0
8-Lavar con etanol 95º 3
segundos
Con esta técnica se han confirmado las muestras negativas y las muestras positivas de nuestro laboratorio.
Esta técnica permitió el diagnóstico simultáneo de Cryptosporidium
parvum, Isospora
belli y esporas de
microsporidios. Figura 1
Los ooquistes de Isospora belli así como los de Cryptosporidium parvum se observaron de color fucsia brillante, en
tanto, las levaduras nunca presentan esa apariencia brillante.
Al igual que en el Ziehl Neelsen algunos ooquistes de Cryptosporidium parvum se tiñen parcialmente. Figura 2
Las esporas de microsporidios se observaron de color rosado, con una vacuola y una raya pálida diagonal o
FIGURA 2
Ooquistes de Cryptosporidium parvum
MO x 1000
FIGURA 3
Esporas de microsporidios
MO x 1000
La técnica combinada de Fucsina y Tricrómica modificada por Didier, permite detectar
coccidios y microsporidios en forma simultánea, insume 45 minutos, es de bajo costo y fácil
realización.
Se puede realizar en cualquier laboratorio que tenga una estufa a 37º y requiere de
1. Acuña, A.M; Combol, A.; González, M.; Fernández, N.; Perera, P.; Zanetta, E. Enteroparásitos oportunistas en población VIH-SIDA en Uruguay. Libro
de Resúmenes del XVII Congreso
Latinoamericano de Parasitología. 2005. Tomo II. 189
2. Fernández N, Combol A, Zanetta E, Acuña A, Gezuele E. Primer diagnóstico de microsporidiosis humana en Uruguay. Rev Med Uruguay 2002. 18 (3): 251255.
3. Ignatius R, Lehmann M, Miksits K, Regnath T, Arvand M, Engelmann E, Futh U, Hahn H, Wagner J. A new acid-fast trichrome stain for simultaneous
detection of Cryptosporidium
parvum and
Microsporidial species in stool specimens. J Clin Microbiol 1997. 35 (2):446-449.
4. Didier ES, Orenstein JM, Aldras A, Bertucci D, Rogers LB, Janney FA. Comparison of three staining methods for detecting microsporidia in fluids. J
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5. Zanetta E, Bonifacino R, Carmona C, Acuña A, Guerrero J. Primeros hallazgos en Uruguay de un nuevo agente de diarrea aguda infantil
(Cryptosporidium sp). Arch Pediatr Uruguay 1987.
58 (1): 37-45.