generalidades de enzimas - CBQ Clases Particulares
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Capítulo 1 Naturaleza y clasificación de enzimas “GENERALIDADES DE ENZIMAS” Autores: Martha Ubalde (Laboratorio de Enzimas hidrolíticas, Facultad de Ciencias) Carolina Villadóniga (Laboratorio de Enzimas hidrolíticas, Facultad de Ciencias) Cecilia Giacomini (Cátedra de Bioquímica, Facultad de Química) Valeria Grazú (Cátedra de Bioquímica, Facultad de Química) Responsable: Prof. Ana María Cantera 2002 1 Capítulo 1 Naturaleza y clasificación de enzimas 1- Naturaleza y clasificación de enzimas. 1.1- Generalidades Excepto por un grupo de moléculas de RNA catalítico, las enzimas son proteínas. Al igual que otros catalizadores son efectivas en muy baja concentración (del orden de nM), se recuperan sin alterar luego de la reacción, no cambian la posición del equilibrio de la reacción que catalizan sino que mediante la formación de un complejo enzima-sustrato, disminuyen la energía de activación aumentando la velocidad a la cual ésta transcurre. En la figura 1 se observa las variaciones de energía libre, ∆Go, a medida que avanza la reacción, en presencia de la enzima la energía del estado de transición, que permite llegar a los productos es menor que sin enzima. TSc1, TSc2, TSc3, TSu son los diferentes estados de transición para el complejo enzima-sustrato, y para la reacción sin enzima respectivamente; ∆G* c y ∆G * u es la variación de energía libre entre el estado inicial y el estado de transición correspondiente. Energía libre estándar reacción sin enzima reacción con enzima estado inicial estado final coordenada de reaccion 1.2- Especificidad y sitio activo A diferencia de los catalizadores inorgánicos las enzimas actúan en condiciones moderadas de pH y temperatura. En su mayoría presentan especificidad por el sustrato aunque en grado variable, por ejemplo glucosa oxidasa (GO) una enzima presente en hongos y bacterias, cataliza la oxidación de D-glucosa a ácido glucónico, pero no oxida L-glucosa. La velocidad de oxidación de α-D-glucosa es 157 mayor que la de oxidación de β-D-glucosa. La especificidad de esta enzima es de tal grado que diferencia los esteroisomeros. Otras enzimas presentan menor grado de especificidad, como la enzima xilosa isomerasa, presente en varias especies bacterianas, que cataliza la isomerización de xilosa en xilulosa, ambas pentosas, pero también cataliza la transformación de glucosa en fructosa, ambas hexosas. 2 Capítulo 1 Naturaleza y clasificación de enzimas El sitio activo de las enzimas consiste en un grupo de 3-12 aminoácidos organizados en una estructura tridimensional, en una zona de la proteína. Este sitio tiene una fuerte afinidad por el sustrato debido a la naturaleza química de los residuos aminoacídicos que la componen. Ejemplos de estos grupos reactivos son el grupo tiol de cisteínas, el anillo imidazol de histidina, el grupo hidroxilo de serina. 1.3- Muchas enzimas necesitan de componentes no enzimáticos Algunas enzimas necesitan de la presencia de componentes adicionales conocidos como cofactores para la actividad. El complejo enzima-cofactor, catalíticamente activo se denomina holoenzima y la proteína en ausencia del cofactor se denomina apoenzima. Los cofactores pueden ser : - iones inorgánicos - coenzimas - grupos prostéticos Iones metálicos inorgánicos pueden ser parte integral de la estructura de la enzima o pueden asociarse con el sustrato, ayudando a la unión con la enzima y aumentando la actividad catalítica. Por ejemplo el Fe +2 se encuentra asociado con el grupo hemo en la peroxidasa y la catalasa encontrándose fuertemente unido a la enzima, mientras que el Mg +2 se complejea con el ATP 4- y es un componente esencial en las reacciones que involucran a esta molécula como aquellas catalizadas por fosfotransferasas. Coenzimas Son sustancias orgánicas de peso molecular relativamente bajo comparado con la proteína. Muchas coenzimas contienen moléculas de vitaminas como parte de su estructura. Se encuentran unidas a la proteína por enlaces débiles y funciona efectivamente como cosustrato de la enzima. Tienen funciones especiales como la transferencia de hidrógeno ( NAD+ en reacciones de deshidrogenación) o la transferencia de grupos acilo (coenzimaA en el metabolismo de ácidos grasos). Muchas enzimas que catalizan reacciones diferentes presentan los mismos coenzimas. Por ejemplo se conocen más de 100 deshidrogenasas que presentan el NAD+ como coenzima. Cuando la coenzima se encuentra fuertemente unida a la molécula de enzima y permanece unida a la enzima luego de finalizado el ciclo catalítico, se denomina grupo prostético. El FAD es otro transportador de átomos de hidrógeno asociado con enzimas oxidantes como la glucosa oxidasa. El grupo hemo de la catalasa y la peroxidasa con su anillo de porfirinas también se conoce como grupo prostético. 3 Capítulo 1 Naturaleza y clasificación de enzimas A continuación se enumeran un grupo de enzimas que requieren cofactores. Enzima Clase Subtilisina hidrolasa (proteasa) Ácido láctico deshidrogenasa oxidoreductasa Glucosa isomerasa Peroxidasa Glucosa oxidasa Cofactores Tipo de cofactor Ninguna --------- NAD+ Coenzima Co +2 ; Mg +2 Isomerasa Oxidoreductasa Grupo hemo conteniendo Fe Oxidoreductasa FAD Fe Ion activador +2 Grupo prostético Grupo prostético Ion activador 1.4- Clasificación y nomenclatura de enzimas. A medida que se iban descubriendo, las enzimas se nombraban agregándole el sufijo asa al nombre del sustrato o a una palabra o frase que describiera su actividad. Así la enzima amilasa cataliza la hidrólisis de amilosa, ADN polimerasa cataliza la síntesis de ADN; sin embargo otras enzimas tienen nombres que no hacen referencia ni al sustrato ni al tipo de reacción que catalizan como tripsina, renina, catalasa. Al ir incrementándose el numero de enzimas conocidas se hizo evidente la necesidad de contar con una guía reconocida para una nomenclatura sistemática. En agosto de 1955, la Asamblea General de la Unión de Bioquímica y Biología Molecular, IUBMB, decide formar una comisión internacional que se aboque a estudiar y establecer los criterios y reglas para la clasificación de enzimas. La Comisión Internacional de Enzimas (Enzymes Commission, EC) comenzó a trabajar en 1956 en conjunto con la Comisión de Nomenclatura de IUPAC. Así se fueron publicando sucesivos informes y documentos donde figuran las recomendaciones y reglas a seguir para nombrar una enzima. 1.4.1- Principios generales de clasificación La nomenclatura de las enzimas y su clasificación están estrechamente relacionadas, por lo cual se tratan conjuntamente. Recomendaciones: • el nombre propuesto para la enzima se refiere exclusivamente a una entidad catalítica individual. En el caso de que intervengan en la catálisis mas de una enzima, debe agregarse el termino “complejo” al nombre, por ejemplo, la descarboxilación oxidativa del piruvato para dar acetilCoA, es catalizada por un grupo de enzimas cada una de ellas con diferentes propiedades catalíticas, que se conoce como “complejo piruvato deshidrogenasa” 4 Capítulo 1 • Naturaleza y clasificación de enzimas la propiedad especifica que diferencia una enzima de otra es la reacción química que cataliza, por lo tanto es lógico que esto sea la base para su nomenclatura y clasificación. Sin embargo la aplicación de este criterio tiene algunas consecuencias, no puede asignársele nombre a una enzima hasta no conocer la reacción que cataliza; también se da el caso de que enzimas que catalizan la misma reacción pero son de diferente origen (bacterianas, vegetales, animales) figuran como una sola en la clasificación, lo mismo ocurre con las isoenzimas, que no están diferenciadas. • en base al tipo de reacción que catalizan las enzimas se clasifican en clases, cada enzima se individualiza según el sustrato sobre el que actúa. Esto exige elegir una dirección para la reacción que se describe, se toma como criterio escribir la reacción en la dirección que se presume de importancia fisiológica. 1.4.2.- Esquema de clasificación. A cada enzima se le asigna un número clasificatorio de cuatro dígitos separados por un punto y precedido por la sigla EC (Enzyme Commission). Se clasifican en 6 clases indicada por el primer dígito, cada clase se divide en subclases (segundo dígito) que a su vez se divide en sub-subclases (tercer dígito) y dentro de ellas cada enzima se individualiza con el número ordinal que le corresponde dentro de la sub-subclase (cuarto dígito). clase tipo de reacción que catalizan 1. Oxidoreductasas oxido-reducciones 2. Transferasas transferencia de grupos de un compuesto a otro 3. Hidrolasas hidrólisis 4. Liasas adición de un grupo a doble enlace 5. Isomerasas rearreglos intramoleculares 6. Ligasas formación de enlaces utilizando la energía de la hidrólisis de ATP 5 Capítulo 1 Naturaleza y clasificación de enzimas 1.5- Ribozimas Aunque la gran mayoría de las enzimas son proteínas, hoy se sabe que ciertas moléculas de ARN tienen actividad catalítica; estas se conocen como ribozimas. En las células eucariotas, el ADN se transcribe en una molécula de ARN que contiene secuencias no codificantes (intrones) y secuencias codificadoras (exones). Durante el proceso de maduración un intrón cataliza su propia eliminación y la unión de los exones adyacentes, sin la participación de proteínas. La estrategia es similar a la vista en las enzimas clásicas, el plegamiento del ARN con una molécula de GTP genera una estructura tridimensional que facilita la ruptura del enlace fosfodiester entre el intrón y el exón y la subsecuente unión de los exones. Otra ribozima bien caracterizada, la Ribonucleasa P de E. coli, tiene un componente proteico de 17500 Da y un componente ARN de 377 nucleótidos (M1 RNA). Se ha comprobado que la porción M1 RNA es suficiente para la catálisis cortando precursores de t-RNA en la posición correcta, aparentemente la proteína solo se necesita para estabilizar el ARN o facilitar su función en condiciones particulares de las células. El descubrimiento de ARNs catalíticos proporciono nuevos conocimientos y cuestionamientos sobre la función catalítica en general, así como importantes implicancias sobre el origen de la vida y su evolución. 1.6- Referencias IUBMB nomenclature Homepage, http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/ Lehninger, A., Nelson, D., Cox, M. En: Principios de Bioquímica 2 (1993) da Ed.; Ediciones Omega, Barcelona Stryer, L., En: Bioquímica 4ta Ed.; Editorial Reverté, Barcelona, (1995). Teal, A. R., y Wymer, P., En: Enzymes http://www.biochemistry.org/education/basc03.htm 6 and their role in biotechnology; Capítulo 2 Caracterización de enzimas 2- Caracterización de enzimas La medida de la cantidad de enzima presente en una solución por lo general no es expresada en términos clásicos tales como mg/ml, ya que la enzima puede representar una pequeña fracción de la muestra. Es así que las enzimas son cuantificadas en términos de su actividad biológica. La actividad enzimática puede determinarse midiendo la velocidad de desaparición de sustrato o la velocidad de aparición de producto. En general es mejor medirla por aparición de producto ya que es más exacto determinar aparición de pequeñas cantidades de producto que la desaparición de pequeñas cantidades de sustrato. A menudo se utilizan sustratos artificiales que liberan cromóforos que pueden ser determinados colorimétricamente. Una forma común y útil de determinar la actividad enzimática es en término de unidades. Las unidades de enzima en general se definen como: “ La cantidad de enzima necesaria para producir determinada cantidad de producto (milimoles, µmoles etc.) por unidad de tiempo (minutos, segundos etc.) bajo determinadas condiciones de temperatura, pH y concentración de sustrato” Existen muchas definiciones de unidades enzimáticas, esta depende de la enzima estudiada y de como la defina el investigador. La concentración de una enzima en una solución se expresa por lo general como unidades por mililitro. La actividad específica (AE) de una enzima se calcula como el cociente entre la actividad y la concentración de proteínas, y se expresa en general como unidades de enzima por milígramo de proteína (U/mg proteína). Al ser las enzimas moléculas biológicas, su actividad se ve afectada por las condiciones de su entorno tales como, pH, temperatura, concentración de sustrato, fuerza iónica, presencia de cofactores etc. Por lo tanto para trabajar con ellas hay que caracterizarlas. 2.1- Influencia de la concentración del sustrato en la actividad enzimática Para muchas enzimas la velocidad de catálisis (v), varía con la concentración de sustrato [S] de la siguiente forma: Figura 1. Gráfico de velocidad de la reacción enzimática en función de la concentración de sustrato 7 Capítulo 2 Caracterización de enzimas Para una determinada concentración de enzima la velocidad (v) es casi proporcional a la concentración de sustrato [S] , cuando [S] es pequeña. Cuando [S] es elevada , la velocidad de catálisis es prácticamente independiente de [S]. En este caso decimos que estamos en condiciones de saturación. Michaelis y Menten propusieron un modelo sencillo que explica estas características cinéticas. E + k1 S k3 ES E + P k2 La transformación de sustrato en producto implica la formación de un complejo enzima-sustrato (ES) , que ocurre a través del sitio activo de la enzima. Este sitio presenta una estructura tal que permite una unión específica y de alta afinidad con el sustrato, además de proveer de un ambiente que favorece los eventos catalíticos. El complejo ES tiene dos destinos posibles: i) puede disociarse hasta E y S con una constante de disociación k2, o ii) puede continuar hasta formar un producto P con una constante de velocidad k3. Se supone que nada del producto revierte al sustrato inicial, una condición que se cumple en el estado inicial de la reacción, antes de que la concentración de producto sea apreciable. La formación catalítica del producto con regeneración de la enzima, es una reacción simple de primer orden y su velocidad está determinada por la concentración del complejo enzima-sustrato y el valor de k3: v = k3 [ES] Suponiendo que el complejo ES se encuentra en condiciones de estado estacionario, es posible llegar a la siguiente ecuación de velocidad, más conocida como ecuación de Michaelis-Menten: v = Vmax [S] / Km + [S] donde Km = k2 +k3 / k1 y Vmax = K3 [ET] El desarrollo matemático de esta deducción se puede encontrar en cualquier texto de Bioquímica. En términos experimentales Km es numéricamente igual a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la velocidad máxima (Vmax ) Cuando [S]= Km entonces v = Vmax / 2 Km es una característica útil y fundamental de cada enzima y un sustrato en particular. También puede verse como un índice de la afinidad de la enzima por su sustrato bajo condiciones de temperatura, pH y fuerza iónica determinadas. Cuanto menor es el valor de Km mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato. Si el sitio activo de la enzima es capaz de unirse y reaccionar con varias moléculas de estructura similar, entonces 8 Capítulo 2 Caracterización de enzimas hay un número de sustratos potenciales para la enzima, y para cada sustrato, la enzima puede presentar un valor de Km diferente. Por ejemplo la enzima β-galactosidasa presenta diferentes sustratos naturales y artificiales y distintos valores de Km para cada uno de ellos Sustrato Km Lactosa 1 x 10 –3M p-nitrofenil-β-galactósido 2 x 10 –4M p-aminofenil-β-galactósido 4 x 10 –3 M 4 – metil umbelliferil β-galactósido 2 x 10 –4 M Tabla 1. Valores de Km de la enzima β-galactosidasa para distintos sustratos Los valores de Km de los enzimas varían ampliamente. Para la mayoría de los enzimas varían entre 10-1y 10-7 M. Para determinar la actividad enzimática, el sustrato debe estar presente en exceso, de forma de asegurarnos que la enzima se encuentra saturada y que por lo tanto la velocidad enzimática es independiente de la concentración de sustrato (punto C de la Figura 1). Se considera que estamos en condiciones de saturación cuando la concentración de sustrato es mayor o igual a 10 Km. Concentración de sustrato relativa a Km 1000 Km Velocidad observada relativa a velocidad 1.0 Vmax 100 Km 0.99 Vmax 10 Km 0.91 Vmax 3 Km 0.75 Vmax 1 Km 0.50 Vmax 0.3 Km 0.25 Vmax 0.1 Km 0.091 Vmax 0.01 Km 0.01 Vmax 0.001 Km 0.001 Vmax Tabla 2. Relación entre concentración de sustrato y velocidad de la reacción enzimática La Vmax , sin embargo no es una característica fundamental para una enzima y su valor va a depender de la cantidad de enzima presente. Si esto se estandariza a un mol de enzima, el valor teórico de Vmax obtenido es el número de recambio o actividad molar. Esta es una medida útil del poder catalítico de una enzima. Su 9 Capítulo 2 Caracterización de enzimas valor cuantifica el número de moléculas de sustrato transformadas por molécula de enzima por minuto. La anhidrasa carbónica tiene la mayor actividad molar de las enzimas conocidas. El valor del número de recambio de varias enzimas conocidas de se muestra a continuación. Enzima anhidrasa Carbónica Nº de Recambio (min-1) 36 x 10 6 catalasa 5.6 x 10 6 β-galactosidasa 12 x 10 3 quimiotripsina 6 x 10 3 lisozima 60 Tabla 3. Números de recambio de algunas enzimas 2.1.1- Determinación de parámetros cinéticos. La gráfica de velocidad en función de la concentración de sustrato (Figura 1) es una hipérbola rectangular. No es útil en la práctica trabajar con esta curva dado que es difícil dibujar una hipérbola rectangular en forma exacta, colocar las asíntotas correctamente y a su vez detectar desviaciones de la curva esperada. Para determinar los parámetros cinéticos de una enzima conviene entonces reordenar la ecuación de Michaelis-Menten de manera que proporcione una gráfica lineal. Hay varios tipos de linealizaciones de esta ecuación pero la que más se utiliza es una representación doble inversa, también llamada representación de Lineweaver-Burk. 1 v = 1 + Vmax Km x Vmax 1 [S] Figura 2. Representación de Lineweaver-Burk de la ecuación de Michaelis-Menten 10 Capítulo 2 Caracterización de enzimas 2.2- Medida de velocidad Al reordenar la ecuación de Michaelis-Menten de la siguiente forma: v= k3 x [ET] 1 + Km [S] queda claro que la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración de la enzima, siempre y cuando se trabaje en condiciones iniciales; dado que sólo en ese caso se puede hacer la suposición de que la [S] es constante. 2.2.1- ¿Cómo medir velocidades iniciales? Como se dijo anteriormente, la velocidad de la reacción catalizada puede medirse por aparición de producto. Cuando se grafica la concentración de producto de la reacción enzimática en función del tiempo se obtiene el siguiente gráfico: Figura 3. Gráfico de concentración de producto en función del tiempo Entre A y B, la velocidad enzimática es constante (condiciones iniciales). Con el transcurso del tiempo la gráfica de concentración de producto puede curvarse debido a que : i) disminuye la concentración de sustrato, ya no estamos en condiciones de saturación y por lo tanto la velocidad de formación de producto va disminuyendo hasta llegar a cero. ii) puede ocurrir que nuestra enzima se inhiba por producto causando esto una disminución en su actividad. Por lo tanto para medir actividad en condiciones ideales, se tiene que estar en condiciones de saturación y de velocidades iniciales. En estas condiciones nos aseguramos que la medida de actividad enzimática es proporcional a la concentración de enzima (Figura 4). 11 Capítulo 2 Caracterización de enzimas Figura 4. Efecto de la concentración de la enzima en la velocidad de reacción. 2.3- Influencia del pH y la temperatura Las enzimas son moléculas muy sensibles a cambios en el medio circundante. Es así que un cambio en el pH o la temperatura, pueden afectar profundamente la actividad y estabilidad de una enzima. pH o temperatura óptima: es aquel pH o temperatura a la cual la enzima presenta su máxima actividad. Estabilidad térmica y con el pH: es el rango de pH o temperatura en el cual la enzima es capaz de retener su actividad catalítica. 2.3.1- Efecto de la temperatura 2.3.1.1- Actividad enzimática en función de la temperatura La influencia de la temperatura en la actividad de las enzimas se representa generalmente en las llamadas curvas de temperatura optima (Figura 5), en las que se grafica la actividad en función de la temperatura. Figura 5. Gráfico de velocidad en función de la temperatura. 12 Capítulo 2 Caracterización de enzimas Los efectos de la temperatura en la actividad de una enzima son complicados y pueden ser considerados como dos fuerzas que actúan en forma simultanea pero en sentidos opuestos. A medida que la temperatura aumenta, la velocidad de reacción aumenta pero a su vez ocurre una inactivación progresiva (desnaturalización) de la proteína. Este efecto es más pronunciado a medida que aumenta la temperatura. La aceleración de la reacción por aumento de la temperatura es causada porque a mayor temperatura una mayor fracción de moléculas tienen la energía suficiente para proveer la energía de activación de la reacción. Por lo general cada 10º C de incremento en al temperatura, la velocidad de la reacción se duplica. El fenómeno de inactivación es debido a que a altas temperaturas las moléculas de enzima vibran y se tuercen tan rápido que algunos de los enlaces no covalentes se rompe. Cuando la temperatura destruye la estructura terciaria, las moléculas de enzima se inactivan o desnaturalizan. Algunas enzimas se desnaturalizan a temperaturas sólo un poco mayor que la temperatura del cuerpo humano, pero algunas pocas son estables incluso a la temperatura de ebullición del agua. Por lo tanto lo que se observa es una “Temperatura óptima aparente”. La desnaturalización térmica de una enzima es dependiente del tiempo, por lo que el término “Temperatura óptima” tiene muy poco significado a menos que se tome el cuenta el tiempo de exposición. Cuanto más corto sea el tiempo de exposición la temperatura óptima de la reacción enzimática puede aumentar. 2.3.1.2- Estabilidad de la enzima en función de la temperatura El efecto de la temperatura en la estabilidad de una enzima puede ser determinado exponiendo a la enzima en ausencia de sustrato a varias temperaturas por un tiempo determinado. Una vez transcurrido dicho tiempo se mide la actividad remanente de la misma a una temperatura prefijada y se la compara con la actividad inicial a dicha temperatura (Figura 6). 13 Capítulo 2 Caracterización de enzimas 120 % actividad remanente 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Tem peratura (°C) Figura 6. Estabilidad enzimática frente a la temperatura 2.3.1.3– Estabilidad térmica en función del tiempo La inactivación térmica es un efecto progresivo. El decaimiento de la actividad enzimática en función del tiempo a una temperatura presenta un comportamiento exponencial. En el caso de ajustarse a una exponencial simple At= Ao x e –kt At= Actividad a un tiempo dado Ao= Actividad inicial Esta ecuación puede linealizarse graficando logaritmo de la actividad en función del tiempo ln de A/Ao temperatura= cte k tiempo Figura 7. Logaritmo de la actividad enzimática en función del tiempo 14 Capítulo 2 Caracterización de enzimas El coeficiente de inactivación (k) es igual a la pendiente del gráfico de la Figura 8. El coeficiente k no es constante, varía de acuerdo a la temperatura. Otra característica importante en la estabilidad de una enzima (fácil de calcular) es la vida media, la cual significa el tiempo requerido para que la actividad enzimática caiga a la mitad del valor inicial bajo las condiciones dadas. Si la actividad decrece según la Ecuación 1, existe una relación inversamente proporcional entre vida media y el coeficiente de inactivación: t1/2 = ln 0,5 = 0,693 -k k Ecuación 1 2.3.2- Efecto del pH La enzima en solución, el complejo enzima sustrato y/o el sustrato pueden sufrir ionización. Como las enzimas contienen muchos grupos ionizables (por ejemplo: carboxilos de los glutamatos, aminas de las lisinas, etc), las mismas pueden existir en diferentes estados de ionización, y la distribución total de la enzima entre los distintas formas iónicas va a depender del pH y de las constantes de ionización de los grupos ionizables. Existen evidencias de que la ionización de grupos de la proteína lejanos al sitio activo tienen poco o ningún efecto en la actividad enzimática, mientras que el estado iónico de grupos cercanos o pertenecientes al sitio activo tienen un efecto profundo. Si se grafica la actividad enzimática en función del pH, se obtiene una curva del tipo gaussiana, donde el máximo corresponde al pH óptimo (Figura 8). Figura 8. Curva de actividad en función del pH Si todas las forma iónicas de la enzima fueran catalíticamente activas, habría actividad enzimática en todo el rango de pH. Sin embargo las curvas de velocidad en función del pH muestran que existe actividad catalítica en un pequeño rango de pH. Parecería ser que las formas iónicas de la enzima o del sitio activo que se 15 Capítulo 2 Caracterización de enzimas encuentran en forma mayoritaria a ese pH son catalíticamente activas. La causa de que la actividad decaiga a ambos lados del pH óptimo puede ser debido a: i) el hecho de la enzima, el sustrato y/o el complejo enzima-sustrato se encuentren mayoritariamente en una forma iónica no activa ii) que el pH afecte la estabilidad de la enzima, ocurriendo desnaturalización irreversible. iii) combinación de ambos efectos. Es necesario por lo tanto comparar estas curvas con las de estabilidad de la enzima en función del pH para eliminar “pHs óptimos falsos”. El efecto del pH en la estabilidad de la enzima es posible determinarlo experimentalmente. Para esto se incuba la enzima en ausencia de sustrato a distintos pH por un período determinado de tiempo. Al cabo del mismo, se procede a medir la actividad de la enzima luego de retornar el pH a un valor de referencia. Si se observa que en los rangos de pH donde la enzima es estable, la misma muestra una disminución de su actividad catalítica, esta disminución sólo puede ser atribuida a formas iónicas no activas. Puede llegar a ocurrir que el pH óptimo para la actividad enzimática no coincida con el rango de pH en que la enzima es más estable. El valor de pH óptimo varía considerablemente de una enzima a otra, y a su vez depende del origen de la enzima (Tabla 4). Enzima lipasa (páncreas) lipasa (estómago) pepsina tripsina ureasa invertasa maltasa amilasa (páncreas) amilasa (malta) catalasa pH óptimo 8.0 4.0-5.0 1.5-1.6 7.8-8.7 7.0 4.5 6.1-7.0 6.7-7.0 4.6-5.2 7.0 Tabla 4. pH óptimos de actividad de distintas enzimas La evolución a relacionado a las enzimas con sus ambientes naturales. Por ejemplo, la enzima pepsina que participa en la digestión de proteínas y se encuentra sólo en el estómago, es más activa a los valores bajos de pH que prevalecen en el estómago luego de una comida. Por el contrario, la amilasa que se encuentra en la saliva trabaja mejor a pH neutros, que es el pH característico de la boca. 16 Capítulo 2 Caracterización de enzimas 2.4- Efecto de los inhibidores sobre las enzimas. Los inhibidores son sustancias que reducen la actividad de una enzima. Los inhibidores pueden ser componentes propios de la célula o extraños a la misma. En el primer caso pueden ser un elemento importante para la regulación del metabolismo celular. Los inhibidores pueden clasificarse en: 2.4.1- Reversibles Cuando reaccionan en forma reversible con la enzima estableciendo un equilibrio entre la enzima libre y el complejo enzima-inhibidor (EI y/o ESI). La constante de equilibrio para la disociación del complejo enzimainhibidor se conoce como KI. KI= [E][I] [EI] Este tipo de inhibición siempre puede ser revertida mediante la eliminación del inhibidor (por ej: por diálisis). A su vez, al tratarse de un equilibrio, que usualmente se alcanza muy rápidamente, el grado de inhibición es aparentemente independiente del tiempo. Existen varios tipos de inhibición reversible; todos ellos implican la unión no covalente de un inhibidor a la enzima pero difieren en los mecanismos por medio de los cuales reducen la actividad enzimática y en la forma en que afectan la cinética de la reacción. i) inhibidor competitivo Es un inhibidor estructuralmente similar al sustrato por lo que puede unirse en forma reversible al sitio activo. Durante la fracción de tiempo en que la molécula de inhibidor está ocupando el sitio activo, la enzima no está disponible para la catálisis. El efecto global es como si la enzima no pudiera unirse al sustrato tan bien cuando está presente el inhibidor. Así pues, cabe prever que la enzima actúe como si su Km se incrementara por la presencia del inhibidor. Por lo que la forma de revertir este tipo de inhibición es desplazando el inhibidor aumentando la concentración de sustrato. Por lo general, los productos de una reacción enzimática son los inhibidores competitivos más comunes. Esto es importarte tenerlo en cuenta en el caso de desarrollar un proceso industrial, debido a que si el producto es un inhibidor competitivo, para poder alcanzar la máxima eficiencia es necesario remover los productos por ejemplo por ultrafiltración. 17 Capítulo 2 Caracterización de enzimas ii) no competitivo Este tipo de inhibidor reversible se une a la enzima en un sitio distinto del sitio activo. La unión del inhibidor no interfiere con la unión del sustrato pero previene su procesamiento, por lo tanto se observa una disminución de la Vmax. Estos inhibidores no tienen porque estar relacionados estructuralmente con el sustrato, por lo que la inhibición no puede ser revertida por incremento de la concentración del mismo. iii) acompetitivo Este tipo de inhibidor se une reversiblemente al complejo ES en sitios diferentes al del sitio activo, dando un complejo ESI inactivo. El inhibidor no se une a la enzima libre, debido a que no tiene un sitio complementario de unión. Es la unión del sustrato con la enzima libre lo que provoca un cambio conformacional que desenmascara o forma el sitio de unión del inhibidor. Este tipo de inhibición es poco común en sistemas con un único sustrato, pero si es un tipo común de inhibición por producto en sistemas con más de un producto y sustrato. En la Figura 9 podemos encontrar las linealizaciones de Lineweaver-Burk correspondientes a los distintos tipos de inhibición reversible. Figura 9. Linealizaciones de Lineveawer-Burk de los distintos tipos de inhibición reversible. Panel A: enzima sin inhibidor; Panel B: inhibición competitiva; Panel C: inhibición no competitiva; Panel C: inhibición acompetitiva. 18 Capítulo 2 Caracterización de enzimas La Tabla 5 es un resumen de las principales características de los distintos tipos de inhibición reversible. Tipo de inhibidor inhibidor competitivo Esquema de reacción k1 E+S + I k4 k5 k3 ES E + P k2 Efecto cinético - Km se ve aumentada - Vmax no es afectada KI = k5 / k4 EI v= Vmax x S / KMapp + S KMapp= KM (1 +I / KI) inhibidor no competitivo E+S + I k4 k5 EI k1 k3 ES + I k2 k4 k1 E + P k5 - Km no es alterada - Vmax disminuye en forma proporcional a la concentración de inhibidor. ESI k2 KI = k5 / k4 v= Vmax app x S / KM + S Vapp app= Vmax / (1 +I / KI) inhibidor acompetitivo E+S k1 k3 ES + I k2 k4 E + P - Km disminuye - Vmax disminuye k5 ESI KI = k4 / k5 v= Vmax app x S / KM app + S Vmax app= Vmax / (1+ I/KI) KM app= KM / (1 +I / KI) Tabla 5. Principales características de los distintos tipos de inhibición irreversible 2.4.2- Irreversibles En el caso de la inhibición irreversible el inhibidor no se encuentra en equilibrio con el complejo enzimainhibidor, por lo tanto no se reactiva la enzima removiendo el inhibidor mediante diálisis y otros métodos, a diferencia de lo que sucede con los inhibidores reversibles. El efecto cinético de un inhibidor irreversible es disminuir la concentración de enzima activa, lo cual lleva a una disminución de la velocidad de la reacción. La inhibición irreversible se caracteriza por un aumento progresivo en el tiempo, llegando en última instancia 19 Capítulo 2 Caracterización de enzimas a la inhibición completa aún con el inhibidor muy diluído, siempre que esté en exceso respecto a la concentración de la enzima presente. La efectividad del inhibidor no se expresa como una constante de equilibrio, sino como una constante de velocidad, que determina la fracción de la enzima inhibida en un período determinado de tiempo para una cierta concentración de inhibidor. Los inhibidores de este tipo generalmente causan inactivación por modificación covalente de la estructura de la enzima. En la mayoría de los casos estas sustancias reaccionan con algún grupo funcional del sitio activo para bloquear el lugar de unión del sustrato o para dejarlo catalíticamente inactivo. El cianuro es un clásico ejemplo; el mismo se une covalentemente a la citocromo oxidasa mitocondrial, inhibiendo de esta forma todas las reacciones asociadas con el transporte de electrones. Referencias Cornish-Bowden, A., En: Fundamentals of enzyme kinetics; Portland Press, Ltd., London, (1995). Dixon, M., Webb, E. C., En: Enzymes 3era Ed.; Dixon, M., Webb, . C., (Eds), Academic Press, New York, (1979). Hartmeier, W., En: Immobilized biocatalysists; Springer-Verlag, Berlin, (1988). Mathews, C., y Van Holde, K., En: Bioquímica 2da Ed., McGraw-Hill, Interamericana, Madrid, (1998). Messing, R., En: Immobilized enzymes for industrial reactors; Academic Press, Inc, London, (1975). Purves, W., Orians, G., Craig, H., y Sadava, D., En: Life: the science of biology, W. H. Freeman & Company, (Eds), (1998). Stryer, L., En: Bioquímica 4ta Ed.; Editorial Reverté, Barcelona, (1995). Teal, A. R., y Wymer, P., En: Enzymes http://www.biochemistry.org/education/basc03.htm 20 and their role in biotechnology; Capítulo 3 Extracción y purificación de enzimas 3- Extracción y purificación de enzimas 3.1- Producción de enzimas Las enzimas son producidas a partir de células, donde cumplen su función metabólica. Más de 2500 enzimas diferentes han sido aisladas y caracterizadas hasta el momento, pero esto sólo refleja un 10 % del potencial enzimático existente en la naturaleza. Las células constituyen hasta hoy el único recurso para la obtención de biocatalizadores, aunque no puede descartarse en un futuro su fabricación por síntesis química. Las enzimas pueden proceder de tejidos de organismos diferenciados (células animales y vegetales) y microorganismos (procariotes y eucariotes). Un esquema general de producción de enzimas consiste en cuatro etapas: 1) Generación o producción Fermentación en el caso de enzimas microbianas; producción agropecuaria o cultivo en el caso de enzimas de tejidos 2) Recuperación Separación, concentración, extracción 3) Purificación varía según el tipo de catalizador enzimático que se use; puede incluir varias etapas o no existir 4) Formulación acabado y normalización del producto enzimático Los procesos productivos, de acuerdo al origen de la enzima, difieren principalmente en la etapa de generación. Las etapas restantes, son en cambio esencialmente independientes al mismo, siendo en general más simple la extracción de enzimas de tejidos que la de enzimas intracelulares microbianas, debido a la mayor dificultad de disrupción de la célula. 3.1.1- Generación Es la primer etapa del proceso de producción y es donde hay mayores diferencias dependiendo del origen de la enzima. Las enzimas de origen vegetal se obtienen a partir de subproductos de la actividad agrícola, mientras que las de origen animal de subproductos de matadero. A su vez las enzimas microbianas se obtienen como productos metabólicos en un proceso de fermentación. Por lo general las enzimas microbianas de interés comercial son productos del metabolismo aeróbico y cumplen con una función catabólica, estando su producción asociada al crecimiento. Si bien existe hoy en día un gran auge de las enzimas microbianas, aún se produce para la industria un número importante de enzimas de tejidos animales y vegetales, ya que los esfuerzos por reemplazar estas enzimas por contrapartes de origen microbiano han sido infructuosos (por ejemplo las amilasas para la preparación de mostos de cerveza, etc). 21 Capítulo 3 Extracción y purificación de enzimas 3.1.2- Recuperación Mientras muchas enzimas son retenidas en el interior de la célula e integran compartimientos subcelulares específicos, otras son liberadas al medio circundante. En la Figura 1 pueden observarse las diferencias entre un proceso de recuperación de enzimas extracelulares e intracelulares. Tejidos animales Organos animales Fermentación microbiana enzimas intracelulares enzimas extracelulares separación sólido/líquido Desintegración celular Separación sólido/líquido sólidos DESCARTE líquidos Remoción del ADN Purificación Purificación Formulación PRODUCTO Figura 1: Esquema del proceso de recuperación de enzimas extracelulares e intracelulares Como puede observarse, en ambos esquemas de recuperación son necesarias etapas de separación sólidolíquido. De las disponibles, solo la filtración y la centrifugación son adecuadas para el procesamiento de grandes volúmenes. La filtración es preferible en el caso de microorganismos filamentosos (hongos y 22 Capítulo 3 actinomicetes), Extracción y purificación de enzimas mientras que la centrifugación es utilizada preferentemente con microorganismos unicelulares (levaduras y bacterias). También puede observarse en la Figura 1, la mayor complejidad del proceso de recuperación de las enzimas intracelulares. Esto es debido a que es necesario la disrupción de las células para poder extraer la enzima de interés. Es importante hacer notar que si bien el esquema de recuperación de enzimas extracelulares es más sencillo, tiene el inconveniente de la necesidad obligatoria de una etapa de concentración, la cual puede lograrse por evaporación al vacío o por ultrafiltración. Extracción de enzimas intracelulares Cuando la proteína de interés se encuentra en el medio intracelular, ya sea de una célula animal, bacteriana o vegetal, el primer paso es extraerla en forma soluble en un buffer de pH y fuerza iónica similar al medio donde se encontraba originalmente. Para lograr esto hay descriptos un variado número de protocolos básicos que permiten una extracción sin dañar la proteína buscada, aunque en muchos casos es necesario introducir algunas modificaciones para aumentar el rendimiento de la extracción y mantener la actividad funcional de la proteína. Como primer paso, se debe eliminar todo aquello que contamina la muestra: i) si se va a trabajar con tejidos animales o vegetales estos se lavan con buffer, ii) en el caso de células bacteriana estas deben separarse del medio de cultivo centrifugando, luego se resuspende en buffer y se centrifuga nuevamente. Luego es necesaria la lísis celular para así poder recuperar la enzima. Esta operación es relativamente simple para el caso de tejidos, pues las células animales son extremadamente frágiles por ausencia de pared celular, y aunque las células vegetales tienen gruesas paredes celulósicas, están son rígidas y por lo tanto muy sensibles a fuerzas cortantes. En cambio, la disrupción de células de microorganismos es más compleja debido a la estructura de su pared celular. La disrupción de células de microorganismos es una etapa crítica dentro del proceso, no porque no haya sistemas eficientes de disrupción, sino porque éstos deben compatibilizar una alta eficiencia de ruptura celular con la preservación de la actividad enzimática de interés. Los distintos métodos de disrupción de las paredes celulares microbianas se encuentran divididos entre: a) aquellos que provocan la fragmentación del envoltorio celular por aplicación de fuerzas cortantes y b) aquellos que producen degradación del mismo. A continuación se da una lista de algunos de los posibles métodos de lísis celular. 23 Capítulo 3 Sistema sonicación molienda homogeinizador mecánico homogeinizador manual french press digestión alcalina digestión enzimática Extracción y purificación de enzimas Principio de ruptura Materia prima adecuada Aplicación a gran escala Cavitación suspensiones celulares nula Compresión y esfuerzo cortante Esfuerzo de corte, cavitación bacterias, tejidos vegetales reducida mayoría de tejidos animales y vegetales más amplia Esfuerzo de corte, cavitación Compresión, esfuerzo de corte Hidrólisis pared celular tejidos vegetales -------- bacterias, levaduras, células vegetales bacterias, levaduras poco probable bacterias, levaduras más amplia hidrólisis pared celular y ruptura osmótica muy reducida Tabla 1. Distintos métodos de lísis celular El sonicador crea vibraciones que rompen las células, estas deben estar en solución en un medio con baja viscosidad, el tiempo de lísis va de 5 a 10 minutos. En la molienda se utiliza junto con un tampón que ya es el medio para la extracción, un abrasivo como alúmina o arena, es muy apropiado para romper paredes de células vegetales, 15 minutos suele ser suficiente para la extracción del contenido celular. En el caso de la French press o French Pressure Cell la muestra se somete a alta presión e inmediatamente a presión atmosférica, este cambio rápido en las condiciones causa que la células estallen y se obtiene así el extracto con el que se continua trabajando. El extracto obtenido luego de la lísis, homogenato, se centrifuga para eliminar los restos de pared celular o los coadyuvantes para la lísis que se utilizan en algunos casos. Dependiendo del material de partida las condiciones de centrifugación van desde 10 minutos a 15000xg hasta 1 hora a 100000xg, en lo posible se utilizan centrifugas refrigeradas que permiten mantener el extracto a 4 ºC. El sobrenadante es el extracto crudo que se separa del resto del material que no interesa, pellet. Muchas veces el extracto crudo se filtra por algodón o lana de vidrio para eliminar partículas en suspensión. 3.1.3- Purificación. Las enzimas se encuentran generalmente en asociación con otras proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos y lípidos. Existe una gran variedad de métodos usados para remover material contaminante, de esta manera la enzima es purificada y su actividad específica aumenta (Tabla 2). Los distintos métodos de purificación pueden agruparse en tres categorías: i) separación en base a solubilidad, ii) separación en base a tamaño, y iii) separación por retención selectiva (cromatografía). 24 Capítulo 3 Método Extracción y purificación de enzimas Grupo Denaturación selectiva i) Precipitación por fuerza iónica Precipitación por solventes orgánicos miscibles Diálisis i) Ultrafiltración Cromatografía de absorción Cromatografía de exclusión molecular Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía de afinidad Cromatografía hidrofóbica i) Principio Selecti- Aplicación a vidad gran esacala Coagulación diferencial Media Reducida por condiciones ambientales extremas “ Salting-out” Baja Factible Magnificación de fuerz- Media as coulómbicas de atracción// Factible Difusión a través de Nula membrana semipermeable ii) Filtración molecular a Baja presión a través de membrana semipermeable iii) Retención selectiva por Media interacciones de Van der Waals y otras fuerzas de corto alcance ii), iii) Retención selectiva por Alta difusión de moléculas de menor PM al interior de una matriz porosa y exclusión de moléculas de mayor PM iii) Retención selectiva por Muy interacción iónica entre alta aminoácidos cargados y residuos de carga opuesta en el soporte iii) Retención selectiva por Muy interacción específica alta entre un soporte activado y grupos biológicamente reactivos en la enzima iii) Retención selectiva por Alta interacción de tipo apolar entre aminoácidos no polares y el soporte. Reducida ii) Factible Factible Comentario Aplicación restringida a enzimas con resistencias anómalas a pH y temperaturas extremas. De aplicación muy difundida, matemáticamente modelable y escalable. Alto rendimiento. Bajo rendimiento si no se trabaja a temperaturas extremadamente bajas. Operación de apoyo cuyo objeto es eliminar microsolutos contaminantes. Amplia aplicación como método de concentración. Como fraccionamiento ofrece dificultades (polarización por concentración). Resultados poco predecibles, principios físicos involucrados poco claros. Método tradicional. Reducida El fraccionamiento se produce por elución diferencial, por desplazamiento con tampón sin aplicación de gradientes. Soportes de alto costo. Reducida El fraccionamiento se produce por elución diferencial, mediante la aplicación de gradientes de pH o fuerza iónica. Soportes de alto costo. El fraccionamiento se produce por elución diferencial inespecífica (pH o Fuerza iónica), o por gradientes específicos (adición de sustrato, cofactor, inhibidor). Soportes de alto costo Sistema reciente desarrollado solo a escala de laboratorio. Promisorio. Soportes de alto costo. Muy reducida Nula Tabla 2. Sistemas de purificación enzimática 25 Capítulo 3 Extracción y purificación de enzimas Un único paso de purificación rara vez es adecuado para purificar una enzima completamente. Por lo general, si se quiere alcanzar un alto grado de pureza, es necesario recurrir a varios métodos diferentes que se basen en diferentes propiedades de la enzima en cuestión. Desafortunadamente, el establecimiento de un protocolo de purificación es un problema de prueba y error: hay que probar procedimientos y luego seleccionar. Una aproximación es partir de protocolos ya probados aunque las condiciones experimentales deben ajustarse para cada muestra en particular. Aparentemente los distintos métodos pueden usarse en cualquier orden y el mejor orden se determina experimentalmente. Sin embargo, existen ciertas restricciones que hacen que haya un orden lógico. En general se empieza por métodos que tienen una alta capacidad, que son rápidos y fáciles de desarrollar, y se sigue con métodos de baja capacidad y alta resolución. La capacidad se refiere a la cantidad de muestra que puede procesarse y la resolución se refiere a la habilidad de un método para separa la proteína de interés de otras presentes en el extracto. Normalmente a medida que aumenta la resolución de la técnica el tiempo que insume también aumenta y la capacidad disminuye (Tabla 3). Método Decrece capacidad diferencia de solubilidad • intercambio iónico • adsorción • hidrofobicidad • electroforesis • HPLC Excepciones • • Generalmente aumenta resolución aumenta tiempo y esfuerzo • gel filtración (baja capacidad, baja resolución) cromatografía de afinidad (depende del ligando) Tabla 3. Cuadro comparativo de la capacidad y resolución de distintas técnicas de fraccionamiento proteico Generalmente los métodos de precipitación (salina, por solventes orgánicos e isoeléctrica), son utilizados en las etapas iniciales del proceso de purificación; debido a que permiten concentrar la muestra y por lo tanto disminuir su volumen. En cambio, los procedimientos cromatográficos (intercambio iónico, cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de adsorción, etc), son utilizados luego que la enzima a sido parcialmente purificada por una técnica de precipitación. 26 Capítulo 3 Extracción y purificación de enzimas Control de la purificación Para evaluar que tan efectivo fue un proceso de purificación en su conjunto o en cada una de sus etapas, se definen dos parámetros que cuantifican la eficacia del proceso, porcentaje de recuperación o rendimiento (%R) y factor de purificación (FP). El porcentaje de recuperación indica cuanta proteína de interés había en el extracto original y cuanto hay al final del proceso o en cada una de las etapas, esto es bastante fácil en la purificación de enzimas ya que estos cálculos se realizan respecto a la enzima activa. % R = actividad total de la fracción x 100 actividad total del extracto El factor de purificación es la relación entre la cantidad de proteína de interés frente a la cantidad de proteínas totales en el extracto original y lo obtenido al final del proceso o en cada una de las etapas, el caso de enzimas es la relación entre la actividad específica en el crudo y lo obtenido al final; indica cuanta proteína contaminante se pudo eliminar. FP = actividad específica (AE) de la fracción actividad específica (AE) del extracto Estos resultados suelen mostrarse en forma de tabla o cuadro de purificación (Tabla 4). Los aspectos cualitativos de un proceso de purificación se analizan en una elecroforesis, donde se “ve” efectivamente si hay o no otras proteínas. Proteínas Etapa de la purificación vol. mg/mL mg totales Actividad U/mL U totales %R FP AE Tabla 4. Cuadro de purificación Por lo general un proceso de purificación consiste en una secuencia de operaciones o etapas en las cuales los contaminantes (especialmente proteicos) van siendo subsecuentemente removidos aumentando la actividad 27 Capítulo 3 Extracción y purificación de enzimas específica de la enzima. Cada etapa de purificación significa, sin embargo, una pérdida de actividad enzimática. Por lo tanto se ha de llegar a un compromiso entre el factor de purificación y el rendimiento deseado. A nivel industrial, la tendencia es sacrificar pureza en beneficio de rendimiento; en usos analíticos o médicos , a la inversa, el rendimiento tendrá una importancia relativa menor. Criterios de homogeneidad Cuando una purificación enzimática ha alcanzado la etapa donde posteriores purificaciones o pasos no producen un incremento en la actividad específica, pueden investigarse con métodos analíticos la homogeneidad y pureza de la preparación obtenida. Pueden utilizarse métodos cromatográficos, electroforesis, ultracentrifugación, focalización isoeléctrica, espectrometría de masas, identificación del residuo amino terminal. La obtención de un único pico proteico es indicativo de homogeneidad, si esto ha sido comprobado por varios de los métodos mencionados. Protección de la actividad enzimática durante el proceso de purificación Es importante que se retenga la máxima actividad durante el proceso de purificación de la enzima de interés. Dado que las enzimas son sustancias relativamente frágiles es esencial evitar condiciones en las cuales son inestables. Es así que las purificaciones deben llevarse a cabo sin pérdidas inútiles de tiempo, y lo más conveniente, en general, es guardar las preparaciones en heladera. Si el fin de la purificación es estudiar las propiedades funcionales y estructurales de la enzima, es necesario obtenerla y mantenerla en su forma nativa. Si en cambio la enzima purificada va a ser utilizada para estudiar su secuencia aminoacídica, la desnaturalización tiene una mínima influencia. Con el fin de mantener a la enzima en su forma activa, deben evitarse: - altas temperaturas y acidez o alcalinidad extrema: durante el aislamiento y la purificación conviene, en general, trabajar entre 0 y 4ºC, y evitar pH mayor que 9 o menor que 5. - formación de espuma: esto es un indicador de desnaturalización proteica. Es así que cuando se transfiere una solución de enzima de un recipiente a otro debe ser vertida por las paredes del recipiente. - proteólisis: esto es más probable que ocurra en las primeras etapas de extracción y purificación cuando las proteasas endógenas responsables del recambio proteico en las células vivientes aún se encuentran presentes. La mejor forma de evitar la proteólisis es remover las proteasas contaminantes rápidamente o inhibir su actividad proteolítica. Mientras esto no se hace, es importante mantener las preparaciones enzimáticas a baja temperatura. - contaminación: manteniendo la limpieza del material utilizado, dado que las proteínas en soluciones acuosas son excelentes sistemas nutritivos para los microorganismos 28 Capítulo 3 Extracción y purificación de enzimas 3.1.4- Formulación Esta etapa es necesaria en el caso de un proceso de producción enzimática a nivel industrial. Consiste en el acabado y normalización del producto enzimático. El acabado tiene por objeto dar forma definitiva al producto enzimático y preservar su actividad durante su período de almacenamiento y comercialización. El mismo incluye las operaciones de desalinización, esterilización, concentración y/o secado, estabilización por adición de preservantes, y recubrimiento. Dentro de los preservantes habituales se encuentran: sales inorgánicas, proteínas inertes, polialcoholes, azúcares y glicoles. Existen además preservantes específicos como sustratos, cofactores e inhibidores disociables, agentes quelantes, inhibidores de proteasas, reactivos sulfhidrilo para el caso de enzimas que tengan en su sitio activo grupos oxidables (como es el caso de la ß-galactosidasa); y agentes antimicrobianos. La normalización consiste en especificar la estabilidad de almacenamiento y la actividad específica del producto enzimático, utilizando la unidad internacional (UI) como medida de la actividad enzimática. A su vez la estabilidad deberá especificarse en función del tiempo de vida media a determinada temperatura. Referencias. Bollag, D., Rozycki, M., Edelstein, S., En: Protein Methods, 2 da edición, Wiley- Liss Inc, (1996). Grazú, V., En: “β-galactosidasas: distribución, propiedades y aplicaciones”, Trabajo Especial I de la Licenciatura en Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de la República Oriental de Uruguay, (1997). Illanes, A., En: Biotecnología de Enzimas, Monografía Nº 35 de la OEA, Ediciones Universitarias de Valparaíso de la Universidad Católica de Valparaíso, (1994). Jakoby, W., En: Enzyme purification and related techniques. Methods in Enzimology Vol XX Secc VIII: Large Scale Methods, Academic Press, New York, (1981). Teal, A. R., y Wymer, P., En: Enzymes http://www.biochemistry.org/education/basc03.htm 29 and their role in biotechnology; Capítulo 4 Aplicaciones industriales de las enzimas 4- Aplicaciones de las enzimas. La producción y aplicación de enzimas es una de los principales intereses de la biotecnología moderna. El uso de enzimas en procesos industriales es cada vez más importante. Las aplicaciones comerciales e industriales de las enzimas se realizan desde hace siglos. Actualmente, debido a la expansión de su uso y a los avances biotecnológicos, se cuenta con un mayor numero de enzimas disponibles a un costo relativamente más bajo y un mayor conocimiento de sus cualidades y aplicaciones potenciales. Un ejemplo de esto, es el caso de las proteasas (enzimas que hidrolizan proteínas) de origen pancreático que fueron patentadas para ese uso en el lavado de ropa en 1913 pero presentaban baja estabilidad en la preparación. En 1953-64, las Industrias Novo de Dinamarca han optimizado la producción industrial de la proteasa alcalina, subtilisina, secretada en grandes cantidades por Bacillus subtilis, para su uso en detergentes bioactivos. Sus propiedades de alta estabilidad a pH alcalinos en la presencia de fosfato y otros ingredientes de los detergentes y mantener su actividad proteolítica hasta la temperatura de 60ºC la hacen particularmente adecuada para este fin. Las aplicaciones más importantes de las enzimas son en las siguientes áreas: • Industria alimentaria y agrícola • Industria farmacéutica • Industria química • Métodos analíticos • Investigación médica. Los principales usos de las enzimas en éstas áreas se resumen en la tabla I. 30 Capítulo 4 Aplicaciones industriales de las enzimas Enzima Industriales α-amilasa Reacción Fuente Aplicación Hidrólisis de almidón Bacillus sp. Amiloglucosidasa Hidrólisis de dextrinas. Aspergillus sp. Conversión del almidón en glucosa y dextranos en industria alimentaria. Producción de glucosa monomérica. Producción de jarabes de fructosa. Detergentes Maceración de cueros. Glucosa isomerasa Conversión de glucosa en fructosa. Subtilisina Hidrólisis de proteínas. Tripsina y Hidrólisis de proteínas. quimiotripsina Quimosina Hidrólisis de proteínas. Papaína Hidrólisis de proteínas. β-galactosidasa Hidrólisis de lactosa de la leche a glucosa y galactosa Hidrólisis de l-aminoácidos acilados Aminocilasa Medicos l-asparaginasa Streptomyces sp. Bacillus sp. Páncreas Estómagos de animales jóvenes Látex de Carica papaya Aspergillus sp, E. coli, Kluyveromyces lactis Aspergillus sp. Coagulación de la leche en la producción de quesos. En la elaboración de cerveza Hirólisis de lactosa en leche y lactosuero. Resolución de mezclas racémicas. Eliminación de l-asparagina Escherichia coli esencial para crecimiento de tumores. Activación del Orina humana plasminógeno Quimioterapia para cáncer, especialmente en leucemia. Analíticas Glucosa oxidasa Oxidación de la glucosa Aspergillus niger Luciferaza bioluminiscencia Peroxidasa Oxidación de un colorante usando H2O2 Hidrólisis de urea a CO2 y NH3 Bacterias marinas / libélula Rábano Detección de glucosa en sangre. Ensayos bioluminiscencia para ATP, etc. Cuantificación de hormonas o anticuerpos Medición de urea en fluidos corporales Uroquinasa Ureasa Manipulativas Lisozima Nucleasas Hidrólisis de enlaces glucosídicos 1-4 Hidrólisis de enlaces fosfodiester de ácidos nucleicos Habas Clara de huevo de gallina. Bacterias Tabla 1. Aplicaciones de las enzimas. 31 Remoción de coágulos de fibrina. Rompe los mucopeptidos de la pared celular bacteriana Manipulación genética. Capítulo 4 Aplicaciones industriales de las enzimas De los cientos de enzimas utilizadas industrialmente, más del 50% provienen de hongos y levaduras, por encima del 33% son bacterianas y el resto se divide entre las de origen animal (8%) y vegetal (4%). 4.1- Enzimas microbianas. Las enzimas provenientes de hongos, levaduras y bacterias pertenecen a un numero limitado de éstos microorganismos, predominando Aspergillus sp., Bacillus sp. y Kluyveromyces sp. Las causas de esta preferencia son varias: • Las enzimas animales y vegetales son más difíciles de recolectar y almacenar. El crecimiento de microorganismos y la producción de enzimas es fácilmente controlado. Es posible manejar la capacidad de los fermentadores de acuerdo a las fluctuaciones en la demanda del producto. • En general resulta más económico producir enzimas microbianas que animales o vegetales. • Los microorganismos pueden utilizar para crecer un amplio rango de sustratos. Se pueden incorporar moléculas inductoras a los fermentadores para inducir la síntesis de enzima. La inhibición de la síntesis de enzima por retroalimentación puede evitarse al tener la posibilidad de limitar la acumulación del producto y de reemplazar los nutrientes que se consumen más rápidamente. • Se pude realizar mutaciones para producir cambios menores en la estructura de la enzima que resulten en una característica alterada de la enzima como por ejemplo insensibilidad a un inhibidor natural. Esto permite la producción potenciada de enzima en grandes cantidades. Un ejemplo de enzimas microbianas aplicadas en procesos industriales es la β-galactosidasa, la enzima que hidroliza la lactosa. Esta enzima se produce comercialmente para su uso en la industria láctea. La lactosa, o azúcar de la leche, es relativamente insoluble resultando un problema en muchos productos lácteos. En la producción de helado, la hidrólisis de lactosa, mejora las propiedades de textura, dulzor y tendencia a cristalizar. Algunas personas carecen de β-galactosidasa, la enzima que hidroliza la lactosa en el intestino delgado, por lo tanto no pueden digerir la lactosa de la leche o de los productos lácteos que contengan lactosa. El pre-tratamiento de la leche genera un producto libre de lactosa adecuada para el consumo por parte de la población intolerante a éste carbohidrato. 4.2- Enzimas animales. Las enzimas animales son poco aplicadas en procesos industriales. Ellas son utilizadas frecuentemente en la producción de agentes terapéuticos o reactivos analíticos. Como ejemplo se puede citar los activadores del plasminógeno. Es un grupo de enzimas proteolíticas que actúan sobre una molécula precursora inactiva presente en la sangre llamada plasminógeno que al ser 32 Capítulo 4 Aplicaciones industriales de las enzimas removida parte de su secuencia se libera la enzima activa plasmina. La plasmina destruye la red de fibrina de un coágulo sanguíneo. La uroquinasa es el activador del plasminógeno humano más conocido pero su producción es muy cara. Para realizar un tratamiento sería necesario extraer uroquinasa de 500 L de orina. Los activadores de plasminógeno producidos por tejidos son más específicos en su acción y pueden ser producidos en cultivo de células humanas. Aunque esto representa una alternativa, para la producción de una droga más económica y eficiente, los cultivos de células animales presentan mayores problemas que los de microorganismos. La estreptoquinasa, una enzima bacteriana, también puede ser utilizada como activador del plasminógeno, pero es relativamente inespecífica en su acción y puede producir reacciones inmunológicas severas en el paciente. 4.3- Enzimas recombinantes. Los recientes desarrollos de la genética microbiana han creado un nuevo potencial para la producción de enzimas. Pueden usarse técnicas de ingeniería genética para manipular el DNA de forma que pueden generarse copias múltiples de un gen particular que codifique para una enzima de interés comercial. Esto se logra insertando el gen que interesa a una pequeña molécula de DNA bacteriana (plásmido) que puede replicarse independientemente de los cromosomas. El gen es integrado dentro del plásmido formando una molécula de DNA recombinante que puede ser insertada en un huésped adecuado. Los plásmidos pueden replicarse a una velocidad superior que el DNA cromosomal produciendo varios cientos de copias por célula. Pueden producirse grandes cantidades de la proteína codificada por el gen clonado. Los genes procarióticos pueden ser expresados en células bacterianas si se encuentran presentes las secuencias reguladoras adecuadas antes de la secuencia codificante. Los genes eucariotas también pueden ser clonados en células bacterianas pero no siempre ocurre la producción de proteínas activas debido a que muchas de éstas enzimas para estar activas deben ser modificadas luego de la traducción. Los procesamientos post-traduccionales pueden involucrar glucosidaciones o hidrólisis de secuencias peptídicas que las células procariotas no pueden realizar. Existe la alternativa del uso de células de levaduras y hongos como huéspedes para el clonado que sí pueden realizar este tipo de procesamiento debido a que son células eucariotas. Actualmente, son producidas en células de levadura enzimas recombinantes de mamíferos biológicamente activas entre las que se destacan: lisozima, quimiosina y el activador del plasminógeno. El clonado de genes también permite re-diseñar enzimas en un forma racional (ingeniería genética). Se altera un aminoácido preciso de la enzima nativa para mejorar sus características. Existen métodos que permiten cambiar una base específica en una hebra de DNA (mutagénesis dirigida) y luego clonar el gen y expresarlo en un huésped adecuado para producir la enzima re-diseñada. 33 Capítulo 4 Aplicaciones industriales de las enzimas Estos desarrollos han sido aplicados a enzimas de interés industrial. La quimosina es una de las proteasas más importantes en la industria alimentaria. Esta enzima produce la coagulación de la leche en la manufactura del queso mediante proteólisis limitada. Tradicionalmente, la quimosina era obtenida del estómago de terneros jóvenes, pero se encuentra en baja concentración. Esto ha llevado al uso de sustitutos, generalmente de origen microbiano. Actualmente se produce de forma recombinante. La α-amilasa de B.subtilis se desnaturaliza por calentamiento. Esta enzima cataliza la conversión de almidón en glucosa que se ve acelerada a altas temperaturas. Se ha obtenido una α-amilasa recombinante termoestable mediante clonado en B. subtilis del gen de la α-amilasa de un organismo termoestable. La subtilisina, utilizada actualmente en detergentes bioactivos, se ha mejorado genéticamente obteniéndose una enzima con mayor resistencia a la oxidación. Bibliografía. Enzimas-campos de aplicación. En: Folleto Técnico de Novo-Nordisk a/s (1989). Dinamarca. Teal, A. 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