Aumento óseo en tibia de conejo utilizando membrana de Cr-Co microfijadas. Estudio preliminar. Oscar A. Decco, Jenifer Barrirero, Sandra Mejía, Andrea C. Cura, Mara L. Ruscio Facultad de Ingeniería, Bioingeniería. Laboratorio de Bioimplantes, odecco@bioimplantes.com.ar, Tel: 0343 -4975100 (Int. 110), C.P.:3100 Resumen— La búsqueda y desarrollo de métodos que permitan AO suficiente para la colocación de implantes dentales representa un área importante en tratamientos de atrofia ósea. El proyecto utiliza membranas de Cr-Co microfijadas, sustitutos óseos y células madre a fin de lograr AO vertical. Al hueso neoformado se le realizaran estudios de densitometría, morfometría e histomorfometría, con el objetivo de determinar la calidad y cantidad del AO. Las técnicas de AO tienen como objetivo principal lograr una repoblación celular selectiva en un sitio, al permitir únicamente el paso a células con potencial osteogénico y moléculas esenciales para la osteogénesis. Los mecanismos básicos que intervienen en este proceso son: la osteogénesis, la osteoinducción y osteoconducción. Con el advenimiento de los materiales y técnicas de membrana, la restauración de la arquitectura y función del hueso son más predecibles. La colocación de membranas tiene como propósito la repoblación celular selectiva para guiar la proliferación de los diferentes tejidos, durante el período de cicatrización posterior al tratamiento de AO. Los objetivos principales de esta técnica son: facilitar el AO en defectos óseos, inducir la regeneración ósea, mejorar los resultados de los injertos óseos y del tratamiento de implante colocados con problemas de supervivencia. Las membranas también favorecen la cicatrización actuando como un colgajo quirúrgico que provee estabilidad y protección adicional al coágulo sanguíneo creando un espacio para el crecimiento de células y vasos sanguíneos desde el defecto óseo. En los resultados se pudo observa mediante los estudios radiológicos que el tejido no presento reacciones adversa, presentando un aumento gradual en su densidad ósea, histológicamente se pudo determinar que le tejido neoformado es de tipo haversiano con presencia de osteoblastos metabólicamente activos. En este estudio preliminar se plantea que la utilización de membranas de Cr-Co con un correcto diseño solas y en combinación con sustitutos óseos y células madres permiten la neoformación de hueso de tipo haversiano en sentido vertical de 5 a 7 mm. — Palabras claves: AO, implantes, membranas de Cr-Co. I. INTRODUCCIÓN L a necesidad de tratar tanto aumento como defectos óseos producidos por diferentes patologías, como así también la magnitud y localización de las mismas, ha orientado la investigación hacia la búsqueda y desarrollo de biomateriales capaces de favorecer una osteogénesis que recupere el tejido óseo perdido. Para ello, el injerto de hueso obtenido del mismo paciente, sería el ideal, pero la obtención de éstos no está exenta de morbilidad, y, además de existir una limitación en la cantidad a obtener, es un tratamiento de alto costo para el paciente. La posibilidad de contar con biomateriales capaces de sustituir hueso y/o provocar el desarrollo del mismo ha permitido la elaboración de métodos para lograr los resultados deseados sin las limitaciones de los autoinjertos. El sustituto óseo debería ser osteogénico, bioabsorbible, biocompaltible, capaz de proporcionar soporte estructural y vehiculizar otras sustancias. Los sustitutos óseos pueden emplearse en el relleno de pequeños defectos. Los mismo utilizados en combinación con un autoinjerto óseo pueden emplearse con la finalidad de provocar el aumento óseo cuando el defecto es grande, o bien utilizándolo conjuntamente con obturadores que permitan la formación de nuevo hueso. Dentro de los sustitutos óseos tenemos los sustitutos coralinos, derivados del componente mineral del mismo, también se cuenta con sustitutos óseos a partir de sulfatos de Calcio y fosfatos de Calcio: como la hidroxiapatita y el fosfato tricálcico, que son los materiales más utilizados como materiales osteoconductivos. La Hidroxiapatita, presenta gran similitud físico química con el tejido óseo, esta se comporta como una estructura osteoconductiva que permite ser invadida por tejido conectivo proveniente del hueso circundante para posteriormente osificarse. El fosfato tricálcico es una cerámica porosa que se convierte de manera parcial en hidroxiapatita una vez implantada en el cuerpo. Este es más poroso y se reabsorbe más rápido que la hidroxiapatita, lo que le da ventaja para favorecer la remodelación ósea, sin embargo, lo hace biomecánicamente más débil a las fuerzas de compresión. En cuanto a los factores de crecimiento (FC), sustancias promotoras del crecimiento, parecen tener un importante papel en la reparación ósea y se localizan en la zona lesionada del sistema esquelético. Entre ellos encontramos: el FC β-transformador, las proteínas morfogenéticas, los FC de fibroblastos, los FC tipo insulina y los FC derivados de plaquetas. Con éstos últimos se ha logrado demostrar experimentalmente en conejos (3,4,5) el efecto estimulador en la reparación de osteotomías, incrementando el volumen y la densidad del callo óseo, aunque sin acompañarse de un incremento en las propiedades mecánicas. La utilización de membranas reabsorbibles se ha popularizado en los últimos años, dando origen al concepto de Regeneración Ósea Guiada, cuando se utilizan para inhibir o retardar la migración apical de epitelio durante la fase de cicatrización. Entre sus ventajas pueden mencionarse que no deben extraerse luego de alcanzado el objetivo, permiten una transferencia gradual y progresiva 2 de tensiones al hueso, son eliminados del organismo promoviendo el restablecimiento de los tejidos originales. Reducen el riesgo de migración posterior y complicación a largo plazo, relacionado con la presencia de material extraño. Los polímeros reabsorbibles en el mercado actual son: ácido poliglicólico, ácido poliláctico, polidioxanona, poligliconato y copolímeros de ácido poliláctico y poliglicólico. En los primeros estudios de regeneración ósea guiada, se aplicaron membranas flexibles, pero la creación y el mantenimiento de espacio suficiente debajo de la barrera es un factor muy importante para un resultado exitoso. Por lo tanto se introdujeron membranas de titanio y PTFE con el fin de incrementar la estabilidad de las barreras. Las propiedades mecánicas de estas membranas previenen su colapso otorgando un volumen constante debajo de las mismas. Además, las áreas de las microporosidades son suficientemente pequeñas para prevenir la penetración de tejido blando a través de la membrana permitiendo la difusión del fluido intersticial (7). El uso de mallas rígidas puede colaborar con la regeneración ósea no habiendo provocado previamente un defecto clínico; así es probable que ésta no interfiera con el flujo sanguíneo a los tejidos subyacentes debido a la presencia de microperforaciones dentro de la membrana. La permeabilidad de las membranas no es requisito para una formación ósea exitosa cuando de Regeneración Tisular Guiada se trata. El mantenimiento de un espacio aislado sobre una superficie ósea herida puede ser condición suficiente para la formación ósea exitosa (8). En la regeneración ósea guiada la cantidad de tejido óseo regenerado bajo las membranas está en relación directa con la cantidad de espacio debajo de la membrana. Éste espacio puede disminuir como resultado del colapso de la membrana (9). Si una membrana o placa reabsorbible es utilizada para ROG, es esencial que ésta conserve su integridad por un tiempo suficiente para dicha regeneración. Si la degradación es demasiado rápida, o el implante es demasiado débil, los osteoblastos se verán privados de una superficie sobre la cual migrar y secretar una matriz ósea, resultando mas en una reparación mediante tejido fibroso que en una regeneración ósea. Además, una reabsorción demasiado rápida del polímero podría interferir con el proceso de consolidación: durante la reabsorción del PLGA, la osteogénesis en el sitio se ve enlentecida (10). La formación ósea requiere una estructura física a la que los osteoblastos puedan adherirse, por lo que se ha desarrollado la idea de diseñar implantes porosos compuestos de materiales biocompatibles. Así, se trabaja con cerámicas como el óxido de Aluminio y con metales inertes como el Cr-Co y aleaciones de Titanio (10). En el presente proyecto se utilizan células madres como factores osteoinductivos, y el relleno de fosfato tricálcico junto con la membrana no reabsorbible, como factores osteoconductivos; todos ellos en conjunto, potencian la neoformación ósea. La membrana posee un diseño con una concavidad de 1.5 mm, apropiado para el aumento óseo vertical. Debido a que la misma es no reabsorbible, proveerá el espacio adecuado para permitir la osteogénesis a lo largo del período de tiempo necesario. II. MATERIALES Y MÉTODOS A. Materiales: 1. Animales: 7 conejos adultos de raza California. 2. Anestesia general: inyección intramuscular de Ketamina50® (Holliday-Scott S.A, Industria Argentina) 3. Miorelajante: Xilazina® (de uso veterinarioIndustria Argentina) al 2%. 4. Anestesia local: Totalcaína Forte® (Carticaína LAdrenalina). 5. Membranas rígidas: 6 membranas de Cr-Co de 1.5 mm de profundidad, 7 mm de eje menor y 8 mm de eje mayor. 6. Microtornillos: 6 microtornillos de Vitalio estériles. Dimensiones: ancho 1.5 mm y largo 7 mm. 7. Relleno: Fosfato tricálcico CERASORB PARO®, Fábrica: Curasan. (tamaño de la partícula: 63 – 250 um) 8. Suturas: hilo no reabsorbible 4.0. 9. Antiséptico: Pervinox ® (Porovidona Yodo). 10. Antibiótico (Rifosina®). 11. Anticoagulante: Croneparina Syntex® (Heparina Cálcica). B. Procedimiento quirúrgico Se intervinieron 6 conejos separados en 3 lotes de 2 conejos cada uno: LOTE I: Obturador LOTE II: Obturador + Fosfato tricálcico (FTC) LOTE III: Obturador + (FTC) + médula ósea (como factor de crecimiento) Se inyectó la anestesia general y el mio-relajante. Luego, se rasuró la pata en el área a operar. Previo a la intervención, se tomó radiografía digital de la misma en el sector de interés. La zona quirúrgica elegida fue el borde mesial de la metáfisis proximal de la tibia. Esta fue desinfectada con antiséptico, seguidamente se aplicó la anestesia local. Para exponer la superficie ósea, se efectuó una incisión en la piel mediante bisturí y luego se separaron los músculos dejando el hueso al descubierto. Se realizó una colocación de prueba del obturador a fin de verificar su correcto posicionamiento en el hueso. Un defecto óseo fue realizado en la zona mediante fresas redondas de 1 mm de diámetro, se efectuó la perforación para el microtornillo a través de una fresa de tipo lanza, esto se llevó a cabo a 1400 rpm con irrigación continua de solución fisiológica. Sobre el defecto producido se colocó la membrana fijada con microtornillo. Los músculos fueron reubicados, quedando la membrana cubierta por ellos. Finalmente se sutura con hilo no reabsorbible y se coloca antibiótico en la herida. Para el lote II, como graft se utilizó sobre el defecto FTC. En el lote III, se extrajo, desde el interior del defecto, médula ósea para que combinada con el fosfato tricálcico y el anticoagulante, constituyan el graft, siendo este utilizado sobre el defecto. Inmediatamente después de las intervenciones, se toman radiografías digitales. C. Seguimiento Durante el período de cautiverio, los animales fueron examinados una vez por semana. Ingirieron alimento balanceado (de mantenimiento) para conejos. Se tomaron placas radiográficas cada 1 mes. 3 A los 3 meses de la intervención quirúrgica, se sacrificaron los animales mediante eutanasia, y se seccionó la zona de la tibia donde se encontraba el obturador. En el conejo testigo se seccionó la zona correspondiente a la ubicación de los defectos óseos realizados en los demás conejos. D. Estudios morfométricos Tibias de control: Se realizó la observación de llaa zona mediante lupa estereoscópica. Tibias tratadas: Se retiraron los obturadores. Se observaron las muestras óseas macroscópicamente mediante lupa estereoscópica. Se capturaron imágenes con el software específico (Motic ®) para obtener la longitud de los los ejes y la altura, con el fin de calcular el volumen y superficie obtenidos del aumento óseo. Fig. 2. Vista lateral del Tejido óseo neoformado, mediante la técnica de aumento óseo utilizando obturadores no reabsorbibles microfijados, con factores de crecimiento y sustitutos óseo. Fig. 3. 3. Método de medición mediante el software específico (Motic ®) para obtener la longitud de los ejes y la altura. E. Estudio densitométrico Se realizó la densitometría ósea del aumento a los 30, 60 y 90 días, se adquirieron los valores mínimos, medios y máximos de cada uno de los modelos experimentales. Se llevo a cabo el promedio de la densidad mínima, media y máxima de todos los especímenes especímenes,, obteniéndose los histogramas correspondientes a cada una de las muestras y la media del total. F. Estudio histológico La muestras fuero fueron n fijadas en formol al 10% ph 7, descalcificadas en acido nítrico al 7 %, incluidas en parafina y coloreadas mediante la técnica de tinción de hematoxilinahematoxilina-eosina. eosina. III. RESULTADOS Fig. 4. Análisis densitométrico mediante el software Digora® para windondows windondows 1.51, de una de las muestras obtenidas a los 90 días. días Fig. 55.. Resultados de l aanálisis nálisis densitométrico durante los 3 meses de tratamiento del lote II.. Fig. 1. Fotos Fotos de las muestras tomadas a los 90 días después de la cirugía donde se puede observar el tejido óseo neoformado. Fig. 66.. Resultados de l aanálisis nálisis densitométrico durante los 3 meses de tratamiento del lote II. 4 Con estos datos se evidencia que en los os ddiversos versos lotes o es presentados se proporcionaron las condicio condiciones nes adecuadas para laa neoformac neoformación ón de tejido e do óseo de tipo po haversiano havers ano en un per período odo de 3 meses en eel mode modeloo experimental, exper men a con un AO mayor a 1 mm, no hab habiéndose éndose observado reacciones reacc ones adversas a nivel clínico radiográfico. Es Estee proyec proyecto o será comp completado e ado mediante med an e el e estudio es ud o histomorfométrico del aumento óseo. V. REFERENCIAS A. Bibliografía: Bibliografía: Fig. 7. 7. Resultados de l aanálisis nálisis densitométrico durante los 3 meses de tratamiento del lote III. [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] Fig. 8. Promedios de las alturas obtenidas en los diferentes lotes. [8] [9] 1. SHORS SHORS, E E. C C., Co Coraline a ne Bone G Graft a Substitutes, Subs u es Orthop. O hop Clin. C n North Am.1999; 30:599 30:599-613. 613. 2. WH WHITE, TE E E., SHORS SHORS, E E.C., C B Biomaterial oma e a aspects aspec s of o interpore n e po e 200 porous hydroxiapatite. Den Dent.Clin. C n No North h Am Am. 1986; 1986 30:49 30 49 67 3. LANE LANE, JJ.M., M TOM TOMIN, N E E., BOSTROM BOSTROM, M.P.G. M P G Biosynthetyc B osyn he yc bone grafting. Clin. Orthop.1999; 367S:107 367S:107--117. 117. 4. NASH NASH, T T.J., J HOWLETT HOWLETT, C C.R., R MARTIN, MART N C., C STEELE, STEELE J., J JOHNSON, JOHNSON K.A., K A HICKLIN, H CKL N D.J., D J Effect E ec of o platelet p a e e de ved g ow h factor on tibial osteotomies in rabbit rabbits. s. Bone Bone.1994; 1994 15 15:203 203 208 5. BOSTROM BOSTROM, M M.P.G., PG SALEH SALEH, K.J., KJ EINHORM, E NHORM T.A., TA Os Osteoinductive eo nduc ve ggrowth ow h factors ac o s in n ppreclinical ec n ca fracture ac u e and long ong bone defects models. Orthop. O hop Clin. C n North No h Am.1999; Am 1999 30:647 30 647 658 6. GARZA GARZA, M M., CEPEDA BRAVO BRAVO, J.A., J A Regeneración Regene ac ón ósea guiad gu ad adaa de ca caraa aal año 2000 2000: Cons Consideraciones de ac ones clínicas c n cas y biológicas. b o óg cas ADM.2000. Vol. 57.4:147 57.4:147-153 153 7. WATZ WATZINGER NGER F F, LUKSCH JJ, M MILLESI LLES W, W SCOPPER C, C NEUGEBAUER JJ, MOSER D D, EWERS R. R Guided Gu ded bone regeneration egene a on w with h titanium an um memb membranes: anes a clinical c n ca study. s udy B sh Journal of O Oral a and Max Maxillofacial o ac a Su Surgery. ge y 2000; 2000 38:312 38 312 315 8. SCHM SCHMID D JJ., C C.H.F. H F HAMMERLE CHF, CHF OLAH AJ, AJ LANG NP. NP Memb Membranes anes pe permeability meab y iss unnecessa unnecessaryy for o guided gu ded generation gene a on of o new bone. C Clinical n ca O Oral a Implantology mp an o ogy Research. Resea ch 1994:125 1994 125 130 9. DECCO, O, ENGELKE, W, et a 2/ 125-128 125 128 [10] 10.G GIL L ALBAROVA ALBAROVA, JJ.; GARR GARRIDO DO LAHIGUERA, LAH GUERA R.; R GIL GL ALBAROVA ALBAROVA, R R.; MELGOZA G GIL, L M. M Materiales Ma e a es para pa a laa reparación y sustitución ósea. Fa Factores cctores o es de ccrecimiento ec m en o y terapia e ap a gené genética ca en ccirugía ug a O Ortopédica opéd ca y T Traumatológica. auma o óg ca Mapfre Map e Medicina. Med c na 2003; 14:51-65. 14:51 65. B. Bibliografía Bibliografía de consulta [1] Fig. 9. Promedios de los volúmenes obtenidos en los diferentes lotes. [2] [3] IV. CONCLUSIONES Luego del análisis macroscópico de todas las muestras, mediante el software Motic®, se observ observóó que en todas ellas hubo un aumento óseo promedio de 1,4 1,4225 225 mm de espesor, con un volumen de formación ósea promedio de 14 145 5,,2606 2606 mm3. Mediante el análisis densitométrico, con el sistema Dígora®, se advirtió un aumento en el rango de la densidad ósea, tanto la mínima como máxima, obteniendo una densidad promedio media general de 157,62, 157,62, luego de tres meses de tratamiento tratamiento. Mediante el análisis histol histológico ógico se pudo observar en los 3 lotes una buena formación de hueso compacto, con evidencia de muy buena disposición de osteocitos en laminillas concéntricas constituyendo osteonas en las cuales se evidencian claramente canalículos óseos, conductos de Haver Havers, s, fibras colágenas y porciones de hueso con índices de mineralización densa. [4] [5] [6] [7] AL RUHA RUHAIMI M K A A. Bone G Graft a Substitutes: Subs u es A Comparative Compa a ve Qua Qualitive ve H Histologic s o og c Rev Review ew oof Cu Current en Osteoconductive Os eoconduc ve Grafti G a ng Ma Materials. e a s Int. n JJ. oof O Oral a and Max Maxillofac o ac Implants. mp an s 2001; 2001 16:105 16 105 114 AMANO Y Y, OTA M M, SEK SEKIGUCHI GUCH K, K SHIBUKAWA SH BUKAWA Y, Y YAMADA S. Evaluation of a poly poly-ll-lactic lactic ac c ac acid d memb membrane ane and memb membrane ane fixing x ng ppin n for o gu guided ded tissue ssue regeneration egene a on on bone defects de ec s in dogs. Oral Su Surg g O Oral a Med O Oral a Pa Pathol ho Oral O a Radiol Rad o Endod, Endod 2004;97:155 2004;97:155--63. 63. ARTZ ARTZI Z Z, DAYAN D D, ALPERN Y, Y NEMCOVSKY CE. CE Ve ca ridge dge augmen augmentation a on us using ng xenogen xenogenicc material ma e a supported suppo ed by a con configured gu ed titanium an um mesh mesh: cclinicohistopathologic n coh s opa ho og c and histochemical h s ochem ca study. Int. J Or Oral aal Max Maxillofac. o ac Implants, mp an s 2003;18(3): 2003 18 3 440 6 BECKER W W, LYNCH SE SE, LEKHOLM U, U BECKER BE, BE CAFESSE R R, DONATH K K, SÁNCHEZ R R. A compa comparison son of o ePTFE membranes memb anes aalone one oor in n comb combination na on w with h pplatelet a e e derived de ved growth g ow h factors ac o s and insulinlike growth factor factor--1 1 or demineraliz demineralized ed freeze eeze d ed bone n ppromoting omo ng bone formation o ma on aaround ound inmediate nmed a e extraction ex ac on socket socke implants. J Periodontol 1992;63:929 1992;63:929--40 40-FUJ FUJIBAYASHI BAYASH S S, NEO M M, K KIM M HM HM, KOKUBO T, T NAKAMURA T T. Os Osteoinduction eo nduc on oof po porous ous bbioactive oac ve titanium an um metal. me a Biomaterials, B oma e a s 2004; 25:443-45 25:443 45 450. 0. GOTFREDSON K K.; WENNERBERG A.; A JOHANSSON C.; C SKOVGAARD L.T.; HJØRTING HJØRTING-HANSEN HANSEN E E. (1995) 1995 “Ancho “Anchorage age of TiO2 TiO2-blasted, blasted, HA HA--coated, coa coated, ed and mach machined ned implants: mp an s An expe experimental men a sstudy udy w with h rabbits” abb s” Jou Journal na of o Biomedical B omed ca Materials Ma e a s Research Volume 29, Issue 10 , Pages 1223 – 1231. 1231 ISHIZAWA SH ZAWA H H.; FUJ FUJINO NO M M.; OGINO OG NO M. M (1998) 1998 “H “Histomorphometric s omo phome c eva evaluation ua on oof the he thin h n hydroxyapatite hyd oxyapa e layer aye formed o med through h ough anod anodization za on followed o owed by hydrothermal hyd o he ma treatment” ea men ” Jou Journal na oof B Biomedical omed ca Ma Materials e a s Resea Research ch Volume Vo ume 35, 35 Issue ssue 2 , Pages 199 – 206 5 [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] KASSEM M, BLUM W, RISTELLI J, et al. GH stimulates the proliferation and diferentiation of normal oste oblast like cells in vitro. Calcif Tissue Int 1993; 52: 222-226. KLUG CN, MILLESI-SCHOBEL GA, MILLESI W, WATZINGER F, EWERS R. Preprosthetic vertical distraction osteogenesis of the mandible using an L-shaped osteotomy and titanium membranes for guided bone regeneration. J. of Oral and Maxillofac Surgery, 2001;50:1302-1308. LEVINE SS, PREWETT AB, COOK SD. The use of a new form of allograft bone in implantation of osseointagrated dental implants. A preliminary report. J Oral Implantol 1992;4:366-71. LUNDGREN AK, LUNDGREN D, HAMMERLE CH, NYMAN S, SENNERBY L. Influence of decortication of the donor bone on guided bone augmentation. An experimental study in the rabbit skull bone. Clin. Oral Implants Res. 2000; 11(2):99-106. LYNCH SE, GENCO RJ, MARX RE. Aplication in Maxillofacial and Periodontics. Tissue Engineering. Ed. Quintessence Publishing Co. 1999. China. MARX R, MELTZER A. Donde no hay hueso, no hay implantes. Rev Esp Odontoestomalógica de Implantes 2000; 8 (1): 32-3. MORI H, MANABE M, KURACHI Y, NAGUMO N. Ossointegration of dental implants in rabbit with low mineral density.Int J Oral Maxillofac Implants 1997: 55,351-61. ROLDAN JC, JEPSEN S, MILLER J, et al. Bone formation in the presence of platelet-rich plasma vs bone morphogenetic protein7.Bone. 2004;34(1):80-90SLOTTE C, LUNDGREN D, BURGOS PM. Placement of autogeneic bone chips or bovine bone mineral in guided bone augmentation: a rabbit skull study.Int J Oral Maxillofac Implants.2003;18(6):795-806 NYMAN, R, MAGNUSSON,M et al. :Membrane guide bone regeneration: Segmental radius defects studied in the rabit 1995 Acta Orthopaedia 66:2,169-173 BARÓN ZÁRATE-KALFÓPULOS, ALEJANDRO REYESSÁNCHEZ. Injertos óseos en cirugía ortopédica Cir Ciruj 2006;74:217-222 DR. YOVANNY FERRER LOZANO, DR. JULIO JORGE VERGARA PAGES, DR. PABLO OQUENDO VÁZQUEZ. Hidroxiapatita como sustituto del tejido óseo. 2008 Hospital Clínico-quirúrgico Territorial Docente de Cárdenas Julio M Aristegui Villamil.