HBsAg

Herramientas para el diagnóstico,
seguimiento y tratamiento en
Hepatitis B
Fabián Fay
CIBIC
Rosario – Argentina
ffay@cibic.com.ar
HBV - Marcadores Serológicos
HBsAg: Antígeno de Superficie
Anti-HBc (total): Anticuerpo anti-core total
Anti-HBc (IgM): Anticuerpo anti-core a clase IgM
Anti-HBs: Anticuerpo anti-HBs
HBeAg: Antígeno e
Anti-HBeAg: Anticuerpo anti-e
HBV - Marcadores Moleculares
►
►
►
►
►
HBV-DNA cualitativo.
HBV-DNA cuantitativo – Carga Viral.
Mutantes de Resistencia a antivirales.
Genotipos de HBV.
TAN en banco de sangre.
Hepatitis B
• Importante establecer:
– Hepatitis Aguda vs Hepatitis crónica
– En Hepatitis crónicas: estratificación del
estado de replicación viral
– Respuesta a tratamiento antiretrovirales y
desarrollo de resistencia
– Estado de replicación residual.
– Marcadores subrogantes del ccc-DNA del
HBV
Ciclo Replicativo del HBV
Marcadores de HBV
HBV
Aplicación
Anti-HBs
Inmunidad
Anti-HBcore
Exposición
HBsAg
HBV-DNA Infección
HBeAg
HBV-DNA Replicación
IgM-Anti-HBcore HBV-DNA
Infeccion aguda Enfermedad
¿ Cómo comenzar el diagnóstico de una
infección por HBV ?
HBsAg y antiHBc
1) HBsAg anti-HBc -
2) HBsAg +
antiHBc +
3) HBsAg +
antiHBc -
4) HBsAg antiHBc +
1) HBsAg anti-HBc -
Sin
contacto
con HBV
Analizar
Vacunación
2) HBsAg +
antiHBc +
Caso
confirmado de
Hepatitis B.
Anti HBc IgM
Reactivo
No reactivo
Infección
aguda por
HBV
Infección
crónica por
HBV
3) HBsAg +
antiHBc -
Resultado reactivo para ambos
marcadores, pasa al esquema anterior
Repetir en nueva
muestra y/o en 30
dias HBsAg
anti-HBc
Caso probable de
infección por HBV
HBsAg +
antiHBc -
Resultado negativo para ambos
marcadores
Evaluar status
replicativo
Caso
DESCARTADO
4) HBsAg antiHBc +
Síntomas
anti-HBe
HBeAg
antiHBs
HBV-DNA
No
reactivo
Reactivo
Hepatitis B resuelta
(infección pasada)
anti-HBc (Total)
IgM anti-HBc
anti-HBs
HBsAg
Vacunar
Repetir Anti HBs a los 30
días post primera dosis.
Reactivo
No reactivo
(Puede repetirse el proceso con una
segunda dosis de vacuna)
Hepatitis B resuelta
(infección pasada)
antiHBc
"aislado"
Carga
viral HBV
0
4
8
12
16
20
24
28
32
36
52
100
Diagnóstico de Hepatitis B
Marcadores de Tamizaje: HBsAg y Anti-HBc
IgG
HBsAg (-)
Anti-HBCore (-)
Sin contacto
Con HBV
Evaluar
Vacunación
HBsAg (-)
Anti-HBCore (+)
Ampliar los estudios
(*1)
HBsAg (+)
Anti-HBCore (-)
Poco probable
Infección aguda
Temprana o
Falso Positivo o
Contaminación
HBsAg (+)
Anti-HBCore (+)
Infección por HBV
Ver si es aguda
Anti-HBc IgM
Si Anti-HBc IgM (-)
Evaluar status crónico
de la infección
¿Qué marcadores usar para caracterizar una
Hepatitis B crónica?
• HBeAg
• Anti HBeAg
• HBV-DNA cuantitativo.
Las 4 Fases de la infección
Crónica por HBV
Fase de Inmuno-tolerancia
◦ HBeAg positivo; alto HBV DNA (2 x 108-11 IU/mL); ALT normal
Hepatitis Crónica HBeAg-positivo (inmuno clearance)
◦ Intermedio a alto HBV DNA (200,000 - 2 x 109 IU/mL); ALT alta o
fluctuante; inflamación activa en biopsia hepática
Portador Inactivo de HBsAg (fase de baja replicación)
◦ HBeAg negativo; bajo HBV DNA (< 2000 IU/mL); ALT normal
◦ HBsAg puede volverse indetectable
Hepatitis Crónica HBeAg-negativo (fase de reactivación)
◦ Intermedio a alto HBV DNA (200,000 - 2 x 109 IU/mL); ALT alta o
fluctuante; inflamación activa en biopsia hepática. HBeAg negativo con
o sin Anti-HBe.
Lok AS, et al. Hepatology. 2007;45:507-539.
Pungpapong S, et al. Mayo Clin Proc. 2007;82:967-975.
Las 4 Fases de la infección
Crónica por HBV
Immune
Tolerance
<
Immune
Clearance
HBeAg+
HBV DNA
2 x 108 2 x 1011 IU/mL
Low Replicative
Phase
><
Reactivation
Phase
HBeAg-/anti-HBe+ (precore/core promoter variants)
> 2000 IU/mL
< 2000 IU/mL
200,000 - 2 x 109 IU/mL
ALT
Normal/mild
CH
Moderate/severe CH
Cirrhosis
HBeAg+
chronic hepatitis
Normal/mild CH
Moderate/severe CH
Inactive cirrhosis
Cirrhosis
Inactive-carrier state
HBeAgchronic hepatitis
>
Estratificación de las Hepatitis
crónicas a HBV
HBV Crónica HBeAg-Negativo vs
Status de portador inactivo
HBsAg positivo
Anti-HBe positivo
Anti-HBc positivo
HBV DNA
ALT
Hepatitis Crónica
HBeAg-Negativo
Portador
Inactivo
> 2000 IU/mL*
Elevada†
< 2000 IU/mL
Normal
*Fluctuaciones menores a < 2000 IU/mL pueden ocurrir.
† Pueden ser elevadas en forma permanente o intermitente.
Keeffe EB, et al. Clin Gastroenterol Hepatol. 2008;6:1315-1341.
Niveles de HBV-DNA en suero
en diferentes status de la infección
Herramientas moleculares en HBV
• Detección del HBV-DNA
– Cualitativo
– Cuantitativo – Carga Viral
• Detección de mutaciones de resistencia al
tratamiento con antivirales
• Determinación del Genotipo de HBV
• Nuevos horizontes: ccc-DNa, marcador subrogante
del ccc-DNA, poblaciones minoritarias, fenotipos de
HBV y su impacto en el tratamiento
Detección del HBV-DNA en suero
• Métodos cualitativos: HBV-DNA PCR
– Resultado de tipo SI-NO
• Métodos cuantitativos: Carga Viral de HBV
– Resultado númérico expresado en UI/ml
Sondas y primers para la detección de
HBV-DNA en suero
Deben estar dirigidas a regiones altamente conservadas del genoma de
HBV
Estas regiones no deben contener ninguna porción del gen S o del gen de
la polimerasa que potencialmente pueden ser afectadas por mutaciones
que aparezcan como consecuencia de la resistencia a drogas
Detección de HBV-DNA cualitativo
• Aplicaciones:
– Definición de replicación activa del HBV en pacientes con
patrón compatible con infección crónica
– Definición de infección HBV oculta (HBsAg negativa)
– Monitoreo de respuesta de tratamiento antiviral
• Métodos: comerciales, no comerciales
• Límites de detección: 5 - 50 copias/ml (contra que
standards? Como se compara entre laboratorios?)
• Aplicación principal: TAN en bancos de sangre con
métodos comerciales específicos para este objetivo
diagnóstico
Detección de HBV-DNA cuantitativo –
Carga Viral
Permite detectar y cuantificar la viremia
Sólo se utilizan métodos comerciales
Estandardización de las unidades de cuantificación del
HBV DNA en UI/ml
La alta sensibilidad de métodos como Taqman
permiten usarlo como test cualitativos (Sensibilidad
analítica de 6 UI/ml)
Carga Viral de HBV
Ensayos HBV DNA disponibles
Aspectos importantes a tener en cuenta en
métodos cuantitativos
• Siempre usar el mismo método cuando se maneja a un
mismo paciente.
• Nunca informar valores mayores a un límite, sino
realizar diluciones hasta obtener el valor real.
• El ensayo es lineal en log/log. Si bien los ensayos se
informan en copias el valor a comparar debe ser el valor
en logs. Diferencia de carga viral con implicancia clínica:
> a 1 log.
Utilidad clínica de la medición del HBVDNA durante el tratamiento
Predecir respuesta
Monitorear eficacia
Eleccion del tratamiento
Monitorear respuesta
Ciclo Replicativo del HBV
SITIO DE ACCIÓN DE LOS
ANTIVIRALES
Acción de los antivirales
(inhibidores de la RT)
Los análogos nucleósidos son moléculas virostáticas.
Al inhibir la acción de la polimerasa del HBV, impiden la
liberación de nuevos virus, pero no frenan la síntesis de
proteínas virales ni atacan el pool de ccc-DNA
La eliminación definitiva del HBV sólo puede llevarse a cabo
si la respuesta inmune del paciente es los suficientemente
fuerte en el contexto de una potente inhibición de la
producción del HBV.
Toda variante de escape de la polimerasa al antiviral,
permite aumentar el pool de ccc-DNA pero además,
conteniendo dichas variantes de escape
Acción de los antivirales
(inhibidores de la RT)
Efecto de análogos nucleosídicos sobre los
marcadores virales. Ejemplo: HBeAg(+)
Pre-Rx
Intra Rx
HBsAg
+
+
+
HBeAg
+
+
-
-
-
Alta
ND
Anti-HBc
+
+
+
+
Anti-HBs
-
-
-
-
Anti-HBe
Carga Viral
Fin Rx
R
NR
+
Seguimiento
RS Resistencia
+/-
+
+
-
+
+
-
+
-
ND
Alta
ND
Alta
+
-/+
+
-
Evaluación de respuesta en análogos
de alta barrera genética - Definiciones
Breaktrough virológico: rebote de la carga viral sérica en mas de
1 log10 por encima del límite de detección (nadir)
Resistencia genotípica: detección de mutaciones conocidas por
conferir resistencia durante la terapia
Breaktrough virólogico con resistencia genotípica: rebote en la
carga viral, asociado a mutaciones causantes de resistencia
antiviral.
No Respuesta primaria (fracaso primario): la carga viral luego de
los 3 meses de tratamiento, no disminuyó mas de 1 log10
respecto al valor normal.
Respuesta parcial o sub-óptima: la dismunición de la carga viral
durante el tratamiento no lo transforma en no detectable
Zoulim & Perillo, J Hepatol 2008; EASL CPG, J Hepatol 2009
Evaluación de respuesta en análogos
de alta barrera genética
Drogas antivirales
Cambios en el DNA--HBV
(log10 UI/mL)
1.0
Respuesta primaria o fracaso
primario
0
“breakthrough”
virológico
-1.0
Respuesta subóptima
-2.0
-3.0
1 log
Nadir
-4.0
0
3
6
12
Meses
Lok AS, et al. Hepatology. 2007;45:507-539.
18
Respuesta Virológica
completa o subótima
Mutaciones asociadas a desarrollo de
resistencia a antivirales
Resistencia
HBV
DNA
ALT
3 Bioquímica
2 Virológica
1 Genotípica
DNA
Aumento
>1 log
Limite de
detección
Início
Año 1
Resistencia fenotípica
Año 2
Año 3
Confirmaçión in vitro de que una mutación
disminuye su eficacia al tratamiento
Tecnologías utilizadas para el
seguimiento de pacientes con
antivirales y definición de patrones de
resistencia
Secuenciación : gold-standard
INNO-LiPA HBV Drug Resistance Assay
PCR-RFLP para búsqueda de
mutaciones mas comunes en el sitio
YMDD
INNO-LiPA HBV DR Assay
– Puede detectar polimorfismos
en:
• codones 528, 552 y 555 de HBV
pol
• codones 171, 172, 195, 196,
198 y 199 de HBsAg
– Altamente sensible y fácil de
usar
• Permite detectar mutaciones
YMDD 3-6 semanas antes de la
secuenciación
Mutaciones del HBsAg secundario a
mutaciones en la polimerasa
Cepas resistentes a Drogas y su implicancia en
la Salud Pública general
Pueden infectar a
personas no
vacunadas (naïve)
(anti-HBs-)
Individuo con
HBV Crónica
tratado con
análogos de
nucleós(t)idos
Selección de
mutantes que
no son
protegidos por
la vacunación
Pueden infectar a
personas inmunizadas
contra la Hepatitis B
(anti-HBs+)
1 Thibault V, et al. AIDS 2002; 16: 131-133
2 Torresi J, et al. Virology 2002; 293: 305-313
Genotipos HBV
Existen descriptos 8 genotipos de
HBV: A – H
Para su definición debe existir una
diferencia > 8% en su secuencia
completa.
Difieren en la distribución
geográfica
Están asociados a diferentes
frecuencia y patrones de
mutaciones del HBV
Contribuye a las variaciones
epidemiológicas, de historia
natural, resolución clínica, eficacia
del tratamiento en diferentes
partes del mundo
Genotipos HBV
Potenciales diferencias biológicas entre los
genotipos de HBV
Tasa de replicación del HBV
Eliminación natural del HBeAg.
Expresión y reconocimiento de los epitopes inmunes.
Evolución de la enfermedad Hepática
Patogénesis
Asociación con desarrollo de cirrosis y hepatocracinoma
Sensibilidad a la terapia antiviral.
Genotipo HBV
• Metodología de
determinación:
– Gold Standart: secuenciación,
puede ser tanto del genoma
completo como de una región
particular (HBsAg,
HBCore/HBeAg, HBV-pol)
– Para la aplicación clínica se
utilizan técnicas mas simples
como RFLP o InnoLipa.
HBV Genotyping
Line Probe Assay
marker line
conj. control
amp. control
Genotype A
Genotype B
Genotype C
Genotype D
Genotype E
Genotype F
Genotype G
Genotype H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Genotipo HBV
La determinación del genotipo de HBV no tiene hoy
aplicación clínica
No se ha incluido su determinación en ninguna guía
de consenso
Su aplicación como herramienta prospectiva en el
seguimiento de la historia natural y la respuesta a los
tratamientos disponible demostrará en un futuro si
puede alcanzar la importancia potencial que se le
asigna.
La utilización de la secuenciación para resistencia
permite definir el genotipo de HBV infectante
Nuevos horizontes en la biología
molecular aplicada al HBV
Detección y cuantificación del ccc-HBV-DNA
HBsAg cuantitativo: Marcador subrogante de cccHBV-DNA?
Detección de variantes minoritarias de escape al
tratamiento
Fenotipo HBV – Ensayo biológico
¿ HASTA DONDE HEMOS LLEGADO HOY EN
LA APLICACIÓN DE LABIOLOGÍA MOLECULAR
EN EL MANEJO CLÍNICO?
Valores indetectables de HBV-DNA sérico, aún con
ensayos de alta sensibilidad, no implican la ausencia o
clearence de los virus ni de la infección viral
La evaluación de la carga viral en diferentes
momentos del tratamiento es utilizada como
marcador de efectividad de la actividad antiviral y la
persistencia de la respuesta
Hasta el momento, no existen marcadores que
identifiquen el logro de que el sistema inmune del
paciente logra controlar efectivamente la infección
viral y el progreso de la enfermedad
ccc-HBV-DNA
Su detección es dificultosa
–
–
–
–
Tipo de muestra: biopsia de hígado
Cuantificación: copias/células
Estandarización técnica
Homogeneidad de su expresión en tejido.
NECESIDAD DE UN MARCADOR SÉRICO
SUBROGANTE
ALTERNATIVA EN ESTUDIO
HBsAg CUANTITATIVO
Serum
HBV-DNA
Viriones
HBsAg
Viriones + Partículas
defectivas
(exceden a los viriones por un
factor de 103 a 105)
Replicación
Disminución del nivel
Del HBV-DNA sérico
Reducción de la replicación
MARCADOR DE
REPLICACIÓN VIRAL
Replicación
Transcripción del ccc-DNA
Traslación del mRNA
Disminución del nivel
Del HBsAg sérico
Reducción de la cantidad de ccc-DNA
Reducción de la transcripción de ccc-DNA
Reducción de la traslación del m-RNA
MARCADOR DE
ccc-DNA ACTIVO
Nuevos Horizontes
Detección de variantes minoritarias: impacto de las
nuevas tecnologías (Next Generation Sequencing)
que permitirán detectar poblaciones en % inferiores
al 1%
Ensayos biológicos de fenotipos del HBV, permitirán
correlacionar los hallazgos genotípicos minoritarios
con respuesta biológica y sentido clínico de las
mismas.
Muchas Gracias.