Mutantes HBV ¿Qué problemas se nos presentan actualmente en el diagnóstico de laboratorio de hepatitis B? Ciertos resultados de laboratorio pueden generar dudas respecto de su veracidad. • Pacientes con marcadores Anticuerpos Anti HBs Ag y Hbs Ag positivos • Pacientes con Anticuerpos Anti HBs Ag positivos y DNA HBV positivos • Donantes con serología negativa para AgHBs en bancos de sangre y HBV DNA positivo ¿Que son las mutaciones? • Las mutaciones constituyen un acontecimiento natural que ocurre durante la replicación viral en donde los cambios de ácidos nucleicos puede traducirse en cambios en la secuencia de amino ácidos en la proteína. • Esto se debe a la alta tasa de replicación y a la baja fidelidad de la polimerasa viral, debido a que carece de “proof –reading” Mutaciones del HBV Mutante Región mutada Mecanismo Agente Oportunidad Frecuencia E menos Gen preCore Presión inmune (selección) Respuesta natural o IFN Infección crónica Frecuente Superficie Gen S Presión inmune (escape) HBIg o Vacuna Inmunización en alta endemicidad Muy poco frecuente YMDD Gen pol Terapéutica (resistencia) LAM Infección crónica Frecuente Métodos: para cada una de ellas, pueden utilizarse diferentes métodos (LiPA, PCR primer específica, PCR/hibridación específica, etc.) pero el método de referencia es la secuenciación de la región genómica específica. (Pawlotsky, Gastroenterology 2002;22:1554--1568) 2002;22:1554 HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR Mutantes de escape HBsAg se han reportado e identificado como tales en la literatura desde 1990. No tienen distribución geografica especifica Oon y col. Mencionan una tasa de mutantes de escape del 4.6% (16 de 345) en neonatos vacunados nacidos de madres positivas para HBsAg. El porcentaje de re-infecion debido a mutantes de escape por inmunoprofilaxis (HBIG) en tranplansplantados hepáticos presenta un rango entre el 8.3% y el 57%. • Kalinina y col. Reportó la primera evidencia que mutantes en el gen S HBV como causa de una hepatitis fulminante. – Este fenomeno pudo haber disparado la muerte celular provocando la falla hepática. – La mutación Gly 145 Arg fue una de las implicadas en este caso. Kalinina, et al. 2000. A Dominant Hepatitis B Virus Population Defective in Virus Secretion Because of Several S-Gene Mutations from a Patient With Fulminant Hepatitis. Hepatology 34: 385 - 394. Wild-type gly at 145 Modelo de HsAg de Chen et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 1997-2001. Mutant arg at 145 Mutantes de Escape más frecuentes? • EL cluster de mutante HBsAg más común está presente entre los aa 111 - 145. La de mayor prevalencia esta reportada en gly-145arg en el segundo loop del determinante a del HBsAg. • Otras menos frecuentes que se encuentran externas al doble loop o dentro del mismo son: Thr1126-Ser ; Met133-Leu; Asp 144Ala; Gln129-His Importancia clínica • “Las variantes de escape a la vacuna en los amino ácidos 144/145 puede establecer infecciones persistentes en niños. • Cuando se compara pacientes transplantados de hígado infectados predominantemente con HBV salvaje con los infectados con mutantes de escape HBsAg (aa144/145), estos últimos presentan un curso clínico menos favorable y una sobrevida menor del graft” Locarnini, S. A. 1998. Hepatitis B Virus Surface Antigen and Polymerase Gene Variants: Potential Virological and Clinical Significance. Hepatology 27: 294 - 297. El 90% de los neonatos infectados con HBV serán portadores crónicos, con un porcentaje de mortalidad que oscila entre el 15-25 % EL CDC estima que 22,000 madres positivas HBV que dan a luz ,el porcentaje de mutantes de escape para HBsAg esta entre el 1 – 4.6 % Por lo tanto el potencial de mutantes en esta poblaciónde recien nacidos estaría entre 2001000 por año. ATENCION EN.......... • Individuos que solo presentan serologia positiva para Ac. anti HBc • Pacientes con HBsAg y Anti HBsAg positivos • Severa inmunosupresión en pacientes con Ac. anti HBsAg • Resultados discordantes de HBsAg con diferentes ensayos • Resultados serológicos como HBeAg positivo y HBsAg negativo – Indicación: solicitar DNA HBV por PCR y en lo posible secuenciación del loop del HBsAg • Detección de DNA HBV positivo por NAT y HBsAg con resultado negativo o divergente en bancos de sangre Implicancia: » evitar la donación » realizar estudios para mutación » seguimiento clínico del donante EVOLUCION DE MEDICINA TRANSFUSIONAL Pilares Básicos Screening de Donantes Transfusion Segura Test NAT & Test Serologicos Perspectives in Health • Vol. 10, No. 2 • 2005 Por que usar NAT en Bancos de Sangre • NAT PCR es positivo antes que la serología •Reduce el riesgo de transmitir infecciones •Elimina los costos en salud para el diagnóstico y tratamiento de los mismos •Mejora la confianza en la seguridad de las bolsas a transfundir Ventajas : • Marcadores negativos en el periodos de ventana • Immunovariantes de cepas virales no detectatos por los test serologicos • Chequeo de los procedimientos serologicos y viceversa. viceversa BUSCH, JAMA 289(8): 959-962. 2003 NAT HBV? •HbsAg esta ausente en: Disminución de la replicación y síntesis de proteínas de HBV posterior a coinfección con HCV Mutaciones en el dominio de la polimerasa que resultan en una ineficiente replicación HBsAg presente pero no detectable Presencia de inmunocomplejos circulantes Mutaciones en el loop hidrofilico mayor HBV Replicación 1 H B s A g (n g /m l) H B V -D N A (c o p ie s /m l) 1,00E+10 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0,1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 • Replicación : 2.56 días • Periodo de VentanaAg/AB : 56 días • Periodo de Ventana -NAT : 30 días Days after infection ASSAL, TRANSFUSION 2009; 49 : 301301-310 Riesgo Estimado de Transmitir HBV • HBV 1 : 90.000 (60.000-128.00) Reducción estimada del riesgo de transmisión por transfuciones HBV, por implementación de NAT Ventana estimada (Días ) HBV EIA NAT 56 30 Reduccion Riesgo Estimado % x 106 donations (95% CI) 27 8.3 (5.7 – 10.9) Metodologías disponibles • PROCLEIX® TIGRIS® Novartis • Cobas AmpliScreen y Cobas Taq Screen MPX ®Roche En nuestro laboratorio • Se corre la serologia y NAT en forma conjunta • NAT : Pooles de 6 bolsas o inferiores • El procesamiento dura 8 hs. • Se realizan análisis de correlación entre serologia y NAT • Repiticiones se realizan al día siguiente Nuestra experiencia ....... COBAS AMPLISCREEN HCV HIV HBV COBAS Amplicor Autoanalizer Amplificación y Detección Automatizada Integridad de los Resultados Internal control /Estandart Cuantificado •Demuestra que la amplificación ha ocurrido en cada muestra •Asegura que los resultados negativos son verdaderos AMPERASA • Especificamente detecta y destruye todo acido nucleico amplificado previamente sin afectar el target que uno desea amplificar Resultados Validación Ampliscreen Resultados: Correlación del 100% Sensiblidad Roche : limite de deteccion son 5 UI/ml o 30 copias/ml Sensibilidad Analítica 2 Muestra 24018 : 18 UI/ml Repeticiones Correlación Muchas gracias por su atención. Beatriz.livellara@ hospitalitaliano.org.ar