INTERCAMBIO CL

INTERCAMBIO CL-/HCO3-, Na+
INDEPENDIENTE EN LA
HIPERTROFIA MIOCARDICA
HIPERTENSIVA
Apellido : FARIAS
Nombre : FERNANDO
HOSPITAL ITALIANO DE LA PLATA
CATEDRA DE CARDIOLOGIA CLINICA
INTRODUCCION
El pH es definido como –log[H+]. Los protones provienen de la disociación
de las moléculas de agua (H2O ↔ H+ + O H -), por lo tanto están presentes en
todas las soluciones acuosas.
El pH intracelular (pHi) juega un rol central en la regulación de la función celular ,
modificando entre otras, la actividad enzimática, la permeabilidad iónica, el
crecimiento celular y las fuerzas que generan las fibras musculares al
contraerse.
La distribución y el movimiento de los H+ a través de las membranas biológicas
está gobernada por los mismos principios que gobiernan los otros iones. Si la
distribución fuera sólo en forma pasiva , el pHi teórico sería de 6,4; sin embargo,
este valor es para la mayoría de las células de 6,8 a 7,2 lo que sugiere algún
mecanismo de transporte activo.
En el mantenimiento del pHi dentro de los límites normales participan 4 proteínas
transportadoras ubicadas en la membrana celular. Estas se dividen en dos
grupos: a) las alcalinizantes, que comprenden el intercambiador Na+/H+ (NHE-1),
cotransporte Na+HCO3- ( NBC ) , b) las acidificantes como el intercambiador CL/HCO3-(AE) y el CL-/OH-(CHE) esquematizadas en la figura 1.
El NHE-1 es una proteína que responde a la acidificación con la eliminación de
un H+ e incorporación de un ion Na+. Contiene 12 dominios transmembrana con
dos posibles sitios de glicosilación en un rulo extracelular. El C-terminal
1
representa un largo dominio citoplasmático con sitios de fosforilación de residuos
de serina. Se cree que el C-terminal participa en la regulación, mientras que los
dominios transmembrana lo hacen en el transporte de Na+ y H+.
El AE es un transpotador electroneutro que intercambia un ion Cl- por HCO-3 ,
contiene 14 regiones transmembranas y un largo N-terminal. Presenta 3
isoformas, el AE1 que se encuentra en los eritrocitos (eAE1) y en el riñón
(kAE1), el AE2, ampliamente distribuido y el AE3 que se ubica en el cerebro, en
la retina (flAE3) y en el corazón (cAE3).En este último han sido detectados los
ARNm de las 3 isoformas, de la cual la AE3 es la más abundante.
Se ha demostrado previamente que NHE-1 está hiperactivo en el miocardio
hipertrófico de ratas hipertensas espontáneas (SHR)2, pero que el pHi se
mantiene en valores normales por una mayor actividad del AE1,5. Si bien la
mayor actividad del AE podría explicarse por una sobrexpresión de la isoforma
AE3 de la proteína transportadora, aún no se ha establecido la participación de
esta isoforma, ni se conoce el mecanismo responsable de la hiperactividad del
NHE-1.
El nivel de expresión de la proteína NHE-1 en el miocardio hipertensivo (MH) es
de similar magnitud al presente en el miocardio normal, sugiriendo entonces la
posibilidad de un mecanismo regulador de la actividad independiente de la
expresión proteica. Se ha sugerido una posible interacción alostérica del H+, así
como una fosforilación del dominio terminal ante la disminución del pHi4.
Dado que la actividad del NHE-1 aumenta marcadamente con la acidificación del
citoplasma, se planteó la posibilidad de que su mayor actividad en el MH fuese
2
un mecanismo compensador de la mayor actividad del AE. De resultar esta
hipótesis correcta, y dado que la inhibición de NHE-1 produce la regresión de la
hipertrofia en el MH, cabría esperar que la inhibición del AE, resultase en la
normalización de la actividad de NHE-1 y de la hipertrofia en el MH.
FIGURA 1: Esquema de los mecanismos que regulan el PHi. En condiciones de
anaerobiosis como la que ocurre durante la isquemia, el transporte de
lactato/ácido láctico también participa de la regulación.
3
OBJETIVOS:
1) explorar mediante un anticuerpo policlonal antiAE3 con acción inhibitoria, si
esta isoforma es responsable de la mayor actividad AE observada en el MH.
2) determinar si la hiperactividad AE causa hiperactividad compensatoria del
NHE-1.
3) Verificar si la inhibición prolongada de la AE modifica la hipertrofia del MH.
MATERIALES Y METODO:
Se usaron ratas machos Wistar normotensas (Wis) (n=5) y espontáneamente
hipertensas (SHR, n=9). Todos los animales se encontraban en idénticas
condiciones, con libre acceso a la comida y agua. A partir de los 3 meses se
comenzó a medir semanalmente la presión sistólica en la cola 6. Al cuarto mes
las SHR se dividieron en controles (n=4) y tratadas (n=5) durante 15 días con el
anticuerpo antiAE3 (anticuerpo policlonal contra la isoforma AE3 generado en el
laboratorio de la Cátedra de Fisiología ,UNLP). Se inyectaron diariamente en la
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vena de la cola 200µL de solución salina, conteniendo anticuerpo antiAE3 de
rata en una dilución 1:10. A las controles se les dio suero no inmunizado.
Al finalizar el tratamiento los animales fueron anestesiados y se les removió el
corazón. En los músculos papilares aislados, se midió el pHi por
epifluorescencia, utilizando el indicador de pH BCECF; y la actividad de AE,
mediante la velocidad de recuperación del pHi después de una carga alcalina
por exposición a trimetilamina (TMA).
PROCEDIMIENTO:
Previa anestesia con pentobarbital sódico (80 mg/Kg i.p.), se extrae rápidamente
el corazón, el que se coloca en una cámara para disección, conteniendo una
solución salina de la siguiente composición (en mM/L): ClNa 128; ClK 4.59;
Cl2Ca 1.35; NaHCO3 20.23; SO4Mg 1.05; glucosa 11. La solución se equilibrará
con 5% de CO2 en O2, siendo el pH de la solución 7,40 a 37 oC.
Se remueven la aurícula y el tejido conectivo adyacente.
Los músculos se montarán horizontalmente en una cámara de perfusión,
ubicada sobre la platina de un microscopio invertido (Olympus CK2), un extremo
de la preparación se sujeta a un soporte fijo, y el otro a un transductor de fuerza
(ver esquema en la (Fig 2). Una vez montados se estirarán hasta la longitud a la
cual producen el máximo desarrollo de tensión (Lmax).
.
5
Técnicas para la medición de pH intracelular mediante indicadores
fluorescentes
En los últimos años se ha difundido el uso de indicadores fluorescentes
para la medición de concentraciones iónicas. La característica en la cual se basa
su uso para determinar la concentración de un ion, es el hecho de que la
interacción entre ambos elementos determina una marcada modificación en la
intensidad de fluorescencia emitida, o un desplazamiento en el espectro de
excitación y/o emisión de fluorescencia. Un compuesto fluorescente es aquel
que emite luz de un espectro característico (espectro de emisión), luego de
haber sido excitado por la absorción de luz de una longitud de onda apropiada
(espectro de excitación). Hay indicadores fluorescentes (Fura-2, BCECF) en los
cuales la molécula cambia su espectro de excitación, al unirse al ion para el cual
son específicos (ej: H+ para BCECF), mientras permanece relativamente
constante la longitud de onda de la fluorescencia emitida. Esto puede
determinarse midiendo la intensidad de la fluorescencia emitida al excitar el
indicador con diferentes longitudes de onda, en presencia y ausencia del ion que
miden. Para el caso particular de BCECF, la señal de fluorescencia aumenta
durante la excitación con una longitud de onda cercana a 495 nm cuando
reacciona con el H+, mientras que la señal permanece relativamente constante
durante la excitación con longitud de onda 440 nm.
6
El control de las variaciones de pHi puede hacerse por los cambios en la
fluorescencia emitida por BCECF al unirse al H+, cuando se excita en longitud de
onda 495 nm. Sin embargo, habitualmente se prefiere el uso del cociente entre
fluorescencias obtenidas excitando con 2 diferentes longitudes de onda
(cociente 495/440). Este método ofrece la ventaja de independizar la medición
de la cantidad de indicador presente y/o de la mayor o menor amplificación del
sistema detector de la fluorescencia, además de anular posibles artefactos de
movimiento.
La Figura 2 muestra un esquema de la disposición del instrumental y
permite una sencilla explicación de la técnica de epifluorescencia a utilizar.
Los músculos se cargarán con el indicador mediante el método permeante,
basado en la incorporación del indicador a la célula bajo la forma de ésteres
acetoximetilados, los cuales por ser muy lipofílicos atraviesan muy fácilmente la
membrana celular7 . Una vez dentro de la célula son hidrolizados por las
estearasas intracelulares que liberan la forma libre del compuesto. Algunas de
las dificultades de este método son la posibilidad de una hidrólisis parcial del
compuesto, lo cual podría provocar que la forma no hidrolisada participe de la
señal fluorescente, pudiendo la misma ser variable en el transcurso del
experimento, así como la posibilidad de su permeabilización al interior de
mitocondrias y retículo sarcoplasmático.
Los músculos, se incubarán durante 30 minutos en la solución salina control
descripta anteriormente, conteniendo 10 µM de BCECF a 34°C. Posteriormente
7
se procederá a lavar el espacio extracelular con solución libre de indicador
durante 30 minutos.
Los músculos son iluminados (luz excitante) por un rayo proveniente de una
lámpara de Xenon (Oriel arc lamp model 68806). El rayo de luz atraviesa un filtro
de banda única selectivo (495 ó 440 nm). El rayo incide en un espejo dicroico
(515 nm) y es reflejado sobre el músculo,iluminando un área de
aproximadamente 1.5 mm de diámetro. La luz fluorescente emitida por el
indicador, es recibida por el objetivo, transmitida por un espejo dicroico (DII) (LP
580 nm) y filtrada a 535 nm hacia un fotomultiplicador (FM) 3527 Hammamatsu)
colocado en una cápsula sellada y opaca a la luz ambiente. La señal proveniente
del fotomultiplicador, es filtrada a 100 Hz y dirigida a una PC IBM compatible, a
través de un convertidor analógico/digital (2801-A Data Translation). Las señales
se almacenan en la computadora, para luego calcularse el cociente de la
fluorescencia.
Evaluación de la actividad de los intercambiador Na+/H+ y Cl-/HCO3- Na+
independiente
I) La actividad del intercambiador Na+/H+ se determinará por los siguientes
procedimientos:
a) Valor del pH intracelular basal en condiciones en las cuales el
intercambiador Na+/H+ sea el único mecanismo que participa en el control del
pHi. Esta condición se cumple en: 1) ausencia de HCO3- en el espacio
8
extracelular y 2) cuando los mecanismos de transporte de HCO3- hacia y desde
el citoplasma están inhibidos por inhibidores específicos.
b) La velocidad de recuperación a una sobrecarga ácida: dado que
las variaciones del pH extracelular (pHo) pueden modificar la actividad de los
mecanismos reguladores del pHi, la sobrecarga ácida se hará manteniendo el
pHo constante8 . Existen distintas maneras para provocar una carga ácida a pHo
constante. Una de ellas consiste en la introducción de CO2, el cual, debido a la
alta permeabilidad de la membrana celular, difunde rápidamente al citoplasma
donde forma CO3H2.
II) La actividad del intercambiador Cl-/HCO3- Na+ independiente: Se mide
durante la sobrecarga celular alcalina. Los gradientes Cl-o/Cl-i y HCO3-o/HCO3-i
determinan el intercambio de HCO3- intracelular por Cl- extracelular, con lo cual
el pHi disminuye (modo foward de operación del intercambiador). Este es el
modo operativo del intercambiador durante la alcalosis intracelular y, para
explorarlo, se provoca una alcalosis celular mediante la exposición de los tejidos
a una base débil como la trimetilamina .
III) Determinación del flujo neto de H+ (JH+) y de HCO3- (JHCO3-). La mayor o
menor velocidad de recuperación del pHi luego de una sobrecarga ácida o
alcalina es un indicador del grado de actividad de los mecanismos regulatorios
del pHi. A mayor actividad de los mecanismos extrusores de H+ (o equivalentes
ácidos) cabe esperar una recuperación más rápida del pHi. Sin embargo no es
siempre así debido a la capacidad buffer de los tejidos. Un tejido con alta
9
capacidad buffer puede tener una menor velocidad de recuperación del pHi que
otro con menor capacidad buffer, aunque ambos presenten igual grado de
activación de los mecanismos regulatorios. Es por ello que se vuelve necesario
determinar la cantidad neta de H+ (o equivalentes ácidos) expulsados de la
célula por unidad de tiempo:
JH+/HCO3-= -= ∆ pHi x β.
β es la capacidad buffer intrínseca, brindada principalmente por las proteínas
celulares
FIGURA 2:
Músculo papilar de VI de rata montado entre un transductor de fuerza y un punto
fijo, lo que permite registrar la fuerza generada por contracciones isométricas.
El preparado es ubicado en una cámara de perfusión, colocada en la platina de
un microscopio invertido, adaptado para técnicas de fluorescencia. El músculo
es cargado con un indicador fluorescente pH-sensible (BCECF esterificado),
para las determinaciones de pHi.
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RESULTADOS:
TABLA 1
Grupo
TAS(mmHg)
Peso
Peso corazón
Peso corazón/
corporal(g)
(g)
corporal (mg/g)
Wistar
(n=5)
120±3
352.2±17.3
0.82±0.08
2.32±0.13
176±3#
303.7±13.2
1.05±0.02#
3.48±0.12#
SHR
(n=4)
# p<0,05
En la tabla 1 se resumen las características generales de las ratas usadas en
este estudio.
Las ratas SHR presentaban HTA estable, y sus corazones eran más pesados
que las Wistar, no habiendo diferencia en el peso corporal.
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FIGURA 3
Valores promedio de pHi en ausencia (panel A) y presencia (panel B) de
bicarbonato en ratas WIS y SHR. En ausencia de bicarbonato en el medio
extracelular ( como ocurre cuando se usa buffer HEPES ), el principal
mecanismo regulatorio del pHi es el NHE-1. En estas condiciones, el pHi fue
mayor en SHR que en WIS ( 7,30 ± 0,02 vs. 7,12 ± 0,01, p<0,05). Considerando
que la capacidad amortiguadora es similar en ambos casos, este dato está
revelando la hiperactividad del NHE-1 en el MH. La diferencia de valores de pHi
entre SHR y WIS, desapareció en presencia de bicarbonato ( 7,14±0,01 vs. 7,09
± 0,03 respectivamente), sugiriendo la compensación por un mecanismo
acidificante dependiente de bicarbonato, como el AE.
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FIGURA 4
Efecto inhibitorio sobre la actividad de AE producido por la administración de
anticuerpo antiAE3 en ratas SHR.
(A) Se muestra un experimento representativo en ratas SHR controles, en el
que se determinó la actividad de AE, midiendo la velocidad de
recuperación del pHi, que se produce luego de una sobrecarga alcalina
brusca ( línea de trazo grueso ).
(B) La velocidad de recuperación de la carga alcalina se redujo
marcadamente en las SHR que fueron tratadas con anticuerpo antiAE3
( 0,154 ± 0,023 vs. 0,059 ± 0,014 unidades de pH/min, p<0,05, reducción
del JHCO3- de 1,66 ± 0,41 a 0,51 ± 0,12 mmol/L(min)-1, p<0,05 ), indicando
que esta isoforma está involucrada en la mayor actividad de AE que se
observa en la hipertrofia de MH.
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FIGURA 5
Valores promedio de pHi en miocardio de SHR controles y SHR tratadas con el
anticuerpo antiAE3 .
(A) La inhibición del AE3 por el anticuerpo, fracasó en normalizar la actividad
del NHE-1, no mostrando el valor de pHi en ausencia de bicarbonato,
diferencias significatvas entre el grupo tratado y control.
(B) La inhibición de la actividad AE producida por el anticuerpo antiAE3,
suprimió la compensación del pHi por el AE, ya que en estos animales el
valor de pHi en presencia de bicarbonato, es más alcalino que en las
SHR no tratadas ( 7,26 ± 0,03 vs. 7,14 ± 0,01, p<0,05), y no difiere del
valor que se tiene cuando este mecanismo está ausente ( buffer HEPES )
14
TABLA 2
Grupo
TAS(mmHg)
Peso corporal(g)
Peso corazón (g)
Peso corazón
/corporal (mg/g)
No tratadas
(n=4)
176±3
303.7±13.2
1.05±0.02
3.48±0.12
186±9
306.9±9.4
1.05±0.05
3.42±0.07
Ac. antiAE3
(n=5)
Como era de esperar del fracaso en corregir la hiperactividad del NHE-1, el
tratamiento, con el anticuerpo no modificó el grado de hipertrofia en el MH.
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DISCUSIÓN:
Este estudio aumenta la comprensión de la hiperactividad del NHE-1 en ratas
hipertróficas, y provee evidencia experimental de la implicancia de la isoforma
AE3 en dicho mecanismo.
De nuestros resultados se infiere, que la isoforma AE3 es responsable de la
mayor actividad del AE en el miocardio hipertrófico de las ratas
espontaneamente hipertensas.
El anticuerpo antiAE3 no distingue entre las variantes flAE3 y cAE3, ya que va
dirigida hacia un rulo extracelular de la secuencia de aminoácidos común a
ambos.
Se sospecha que la variante flAE3, puede ser la responsable de la mayor
actividad del AE3 en ratas SHR con hipertrofia, basado en las siguientes
evidencias:
1. El ARNm del flAE3 está sobreexpresado en el miocardio hipertrófico1 ya
que se produce una reexpresión de los genes fetales.
2. Una actividad exagerada de la angiotensina, aumenta la actividad del AE
a través de la fosforilación (PKC) de la variante flAE3.
3. El aumento de la actividad del AE3 se normaliza por inhibición de la PKC.
La administración diaria de un anticuerpo antiAE3, es una estrategia efectiva
para inhibir el AE, pero falló en normalizar la hiperactividad del NHE-1.
Se desconoce cuál es el mecanismo de la hiperactividad, pero no se debe ni al
aumento de la cantidad del transportador, ni a una modificación del PHi inducida
por el incremento de la actividad del AE3.
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Sin embargo, confirmamos que la hiperactividad del NHE-1 es compensada por
el aumento de la actividad de un mecanismo dependiente de bicarbonato (AE).
Estos resultados concuerdan con los reportes preliminares de Perez et al 1995,
Cingolani 20011,5.
Como la inhibición del AE3 no normaliza la actividad del NHE-1, no se produjo
una reducción de la hipertrofia.
A pesar de que se reportan resultados negativos, éstos contribuyen a un mejor
entendimiento de las alteraciones que afectan el PHi del miocardio en la
hipertensión.
Nuestro estudio refuerza el lazo entre la hiperactividad del NHE-1 y la hipertrofia
miocárdica, de la misma manera que excluye a la mayor actividad del AE como
responsable de la hiperfunción del NHE-1
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CONCLUSIONES:
Los resultados nos permiten establecer que:
1) La isoforma AE3 es responsable de la mayor actividad de AE en el MH.
2) La inhibición prolongada de la AE3 no corrige la hiperactividad del NHE-1
ni la hipertrofia observada en el MH.
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BIBLIOGRAFIA
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