I. Introducción 1.1. Objetivos El objetivo de los ensayos realizados, planteado de la forma más general, ha consistido en el estudio del efecto de la administración de dos tratamientos farmacológicos y de sus posibles interacciones sobre ciertos parámetros biológicos medidos en un animal de laboratorio a caracterizar. El primer objetivo en el que nos debemos fijar es la caracterización del animal de experimentación utilizado. Consiste en determinar la especie, la variedad y el sexo de dicho animal. Discutiremos más adelante la elección de este tipo de animal dentro del diseño del experimento. El siguiente objetivo es comprobar la actuación individual de cada tratamiento sobre los diferentes parámetros del animal. Este objetivo se divide pues en dos, al estudiar cada tratamiento por separado: o Primer tratamiento: Alteraciones sobre la flora intestinal debidas a la administración de un antibiótico aminoglucósido (Kanamicina), así como efectos secundarios que se puedan derivar de dicha administración. o Segundo tratamiento: Efecto de la administración exógena de un glucocorticoide sintético (Dexametasona) a diferentes niveles. Dado la gran gama de actuaciones y efectos secundarios que pueden sucederse, observaremos el comportamiento del organismo de la rata tratada en cuanto a metabolismo, crecimiento e inmunomodulación a nivel global, de órganos individuales, celular y molecular. Como último objetivo, tendremos que comprobar las posibles interacciones entre ambos tratamientos. Para ello estudiaremos un tratamiento conjunto de ambos medicamentos, buscando potenciales diferencias con los tratamientos realizados separadamente. Este estudio se deberá realizar sobre aquellos parámetros sobre los que puedan actuar ambos medicamentos a la vez. 1.2. Antecedentes de los Glucocorticoides Los glucocorticoides son hormonas de origen esteroideo sintetizadas en la zona fascicular de la corteza suprarrenal (1). Son pues derivados del colesterol. En el hombre, la mayor parte de la actividad glucocorticoide corresponde al cortisol, mientras que en la rata predomina la corticosterona. Su principal acción recae sobre el metabolismo de glúcidos, aunque también poseen otras funciones (2)(3): afectan también al metabolismo de lípidos y proteínas, intervienen en procesos antiinflamatorios y comparten ciertas propiedades con los mineralocorticoides en cuanto a la regulación del balance de agua y electrolitos (3)(2). Además influyen poderosamente en el hígado, ya que es en este órgano donde sufren su metabolismo (4). Los glucocorticoides forman parte del sistema endocrino para el control del metabolismo de los nutrientes, junto con otras hormonas como insulina y glucagón, la hormona del crecimiento o las hormonas producidas por la médula adrenal (como la adrenalina). En especial, comparte efectos con el glucagón y las hormonas medulares, distinguiéndose de estas en que buscan resultados más a largo plazo (5). Los glucocorticoides se unen para su transporte a proteínas del plasma (4), lo que puede servir para controlar su distribución y como reservorio. 3 Vamos a analizar ahora más de cerca las diferentes funciones de estas hormonas: - Efectos sobre la glucemia y el metabolismo de hidratos de carbono: El órgano diana de estas hormonas con respecto al metabolismo de glúcidos es el hígado. Actúan incrementando la gluconeogénesis (formación de novo de glucosa) y la glucogenogénesis (formación de glucógeno a partir de glucosa) (5)(1)(4). Esta acción se realiza a través del aumento de síntesis y actividad de las enzimas necesarias para ambos procesos en el hepatocito y por la movilización de lípidos y proteínas extrahepáticos para su conversión en glucosa (4)(1)(2)(3). Además, tiene efectos negativos sobre la captura de glucosa a nivel celular y reduce la oxidación de la misma, al inhibir la oxidación del NADH, lo que baja los niveles de glucolisis (4)(5). Los dos efectos anteriores producen un aumento de la glucemia (5)(1)(4)(3) (concentración de glucosa en plasma), lo que puede traducirse en una diabetes suprarrenal (4)(2). - Efectos sobre el metabolismo de proteínas y lípidos: Al actuar los glucocorticoides el hígado necesita un mayor aporte de materia prima para realizar las síntesis de glucosa y glucógeno. Al no poder llegar ese aporte extra a través de la dieta, se dispara un aumento del catabolismo de proteínas en el músculo liso y de lípidos en el tejido adiposo. Los aminoácidos y ácidos grasos así conseguidos son movilizados hacia los hepatocitos (4)(1)(2). Esto disminuye las reservas proteicas de la mayoría de células corporales, aumentando sin embargo el contenido en aminoácidos en hepatocitos, plasma y tubo digestivo (4)(3), debido a que el transporte de aminoácidos se ve favorecido hacia las células hepáticas y restringido hacia el resto del organismo (4). El músculo cardíaco y el cerebro están protegidos contra estos efectos sobre glúcidos, lípidos y proteínas, debido a su especial dependencia de la glucosa como fuente de energía (1)(5). La disminución de tejido adiposo es el primer factor que influye en el adelgazamiento general que sufre el sujeto. - Efectos sobre la Ingesta: Los glucocorticoides presentan efectos contrarios sobre la ingesta de alimentos: por un lado, el aumento del metabolismo produce un aumento de la demanda energética, por lo que se estimula la producción del neuropéptido Y, estimulador del apetito. Por otra parte, la actuación de los glucocorticoides sobre el sistema nerviosos central produce una disminución de la ingesta. El equilibrio entre ambos efectos depende de cada individuo, pudiendo llevar a la obesidad o a una anorexia nerviosa (6). - Efectos sobre el crecimiento: En casos de un exceso de glucocorticoides y como consecuencia de sus acciones metabólicas, se experimenta una inhibición del crecimiento, manifestándose como una disminución del peso y las dimensiones corporales, así como del tamaño de los órganos. - Efectos sobre el estrés: Los glucocorticoides son primordiales para la respuesta del organismo frente a cualquier tipo de traumatismo físico o psíquico (7)(2). 4 El estrés estimula la secreción de ACTH por la adenohipófisis, que a su vez estimula la secreción de glucocorticoides (7)(4). No se conoce con seguridad el mecanismo por el cual los glucocorticoides protegen al organismo del estrés, pero puede tener que ver con la movilización rápida reservas proteicas y lipídicas (4). - Efectos antiinflamatorios: Los glucocorticoides inhiben la respuesta inflamatoria frente a lesiones tisulares interviniendo activamente en la regulación de diversos mediadores de la inflamación, como prostaglandinas y leucotrienos (7)(4)(8)(1). Así, los glucocorticoides permiten una estabilización de las membranas lisosómicas, evitando su rotura (4)(2); además, reduce la permeabilidad capilar, la vasodilatación y la movilidad de leucocitos a la zona (inhibiendo la expresión de moléculas de adhesión) (8)(9) , disminuyendo también su capacidad fagocítica (4)(2)(8) y la secreción de histamina (4)(3)(8) ; también disminuye la fiebre y como veremos a continuación, suprime el sistema inmunitario (4)(2). (7)(4)(2)(3) - Inmunomodulación: En general, los glucocorticoides producen inmunodepresión (4)(7)(2)(3), reduciéndose los niveles de eosinófilos, basófilos, monocitos y linfocitos en sangre (4)(8) ya que se fomenta su muerte por apoptosis (9). La formación de anticuerpos y la inmunidad mediada por células se ven suprimidas(7)(8), debido a que los glucocorticoides reducen la transcripción de genes de citocinas y genes que intervienen en la clonación de células T (8)(9), como las linfocinas (1)(8). Se produce también una destrucción de linfocitos T y B inmaduros, acompañada de una atrofia de los órganos linfoides(7)(3), disminuyendo pues el tamaño y la función del timo y los nódulos linfoides(7). - Efectos de retroalimentación negativa sobre hipófisis e hipotálamo: El eje hipotálamo – adenohipófisis – suprarrenales posee una vía de regulación descendente en la que el hipotálamo estimula a través de la CRH la producción de ACTH en la adenohipófisis, que a su vez estimula la producción de glucocorticoides por parte de la corteza suprarrenal (7)(8)(4). Para controlar mejor este proceso existe una segunda vía de regulación ascendente, en la que los glucocorticoides realizan una retroalimentación negativa sobre la secreción de CRH y ACTH(7)(8)(4). La administración de glucocorticoides exógenos deprime la secreción de CRH y ACTH, inhibiendo la Figura 1: Eje Hipotálamo-Hipofisariosecreción de glucocorticoides propios , lo que Adrenal produce la atrofia de la corteza suprarrenal (8)(7). Además, altas concentraciones de glucocorticoides pueden producir otros efectos secundarios, como debilidad muscular y osteoporosis (1)(10), atrofia de tejidos y adelgazamiento de la piel (2) e incluso nefrotoxicidad (11). La Dexametasona es un glucocorticoide sintético en el que la actividad mineralocorticoide ha sido reducida al mínimo gracias a una serie de modificaciones en su molécula (4)(10). Por efecto de estas mismas modificaciones, su actividad como glucocorticoide es muy superior a la de los glucocorticoides naturales, tanto a nivel 5 del metabolismo de hidratos de carbono como en cuanto a las respuestas antiinflamatorias e inmunosupresoras, presentando una acción más inmediata y con un tiempo de actuación más largo (4)(10). 1.3. Antecedentes de los Aminoglucósidos Los aminoglucósidos son sustancias antibióticas en su mayoría de origen natural, producidas por diferentes especies del género Streptomyces (1)(2)(8)(12) o de actinomicetos del género Micromonospora (1). Se trata de compuestos policatiónicos de naturaleza muy polar (8)(1), constituidos por un anillo aminociclitol central unido por enlaces glicosídicos a dos o tres aminoazúcares, que confieren las diferencias estructurales entre los diferentes aminoglucósidos (1)(12). En cuanto a su espectro antibacteriano, presentan gran eficacia frente a microorganismos gram negativos, usándose con frecuencia sobre bacterias entéricas (8)(1)(12) . También poseen acción sobre algunos microorganismos gram positivos y han sido utilizados en el tratamiento de la tuberculosis (1)(8)(12). Su mecanismo de acción se basa en la inhibición de la síntesis de proteínas bacterianas (8)(12)(2)(1), presentando un marcado efecto bactericida en bacterias en fase de crecimiento (1). La mayoría de aminuglucósidos se unen a la subunidad 30s del ribosoma, interfiriendo en su función y por tanto impidiendo la traducción (1)(12)(2). Además, inducen fallos de lectura durante la traducción, dando lugar a la síntesis de péptidos extraños. Dada su naturaleza polar, su penetración a través de la membrana bacteriana precisa de un mecanismo en tres fases (1): en la primera, el antibiótico se unen iónica y reversiblemente a ciertos sitios aniónicos de la membrana, atravesando ésta a través de una porina (1). Desde el espacio periplasmático, el antibiótico pasará al interior de la bacteria mediante un fenómeno de captación activa (1)(8) que constituye las dos fases siguientes. La segunda fase es previa a la inhibición de la síntesis proteica y requiere de la actuación de la cadena transportadora de electrones, siendo la entrada de electrones proporcional al potencial de membrana (1). La captación de aminoglucósido en esta fase es muy pequeña. En la última fase se produce una entrada importante y linealmente creciente de antibiótico, para lo que se precisa la existencia de síntesis proteica y energía proveniente del transporte electrónico y la hidrólisis de ATP (1)(8). En esta fase, los fallos en la lectura producidos por la unión del aminoglucósidos a ribosomas activos producen proteínas aberrantes, algunas de las cuales pasan a formar parte de la membrana. Allí, su plegado anormal originará canales acuosos que podrían actuar como transportadores específicos, facilitando el paso del antibiótico (1). Se produce así una aceleración autocatalítica de la captación del aminoglucósido, ya que la entrada del mismo incrementa la formación de canales para que entre más. La gran concentración de antibiótico en el interior celular terminará por producir la parada total de la síntesis proteica además de la pérdida de funcionalidad de la membrana (1). Además, parte del transporte de los aminoglucósidos a través de la membrana depende de la presencia de oxígeno, por lo que su acción sobre microorganismos anaerobios se ve disminuida (8). La resistencia a aminoglucósidos puede deberse a diferentes mecanismos, como la alteración de los receptores ribosomales, interferencias en la incorporación al interior 6 bacteriano o inactivación por enzimas microbianas, siendo esto último la causa más común (1)(8). En cuanto a la farmacocinética, cabe destacar que los aminoglucósidos apenas se absorben en el tracto intestinal (8)(1)(2), por lo que normalmente se administran por vía muscular o intravenosa (8)(2). Su penetración en las células es casi nula (8). Su eliminación se realiza mayoritariamente vía filtración glomerular (1)(8). Si falla la función renal, pueden llegar a concentraciones tóxicas (1)(8), ejerciendo los efectos más graves sobre el órgano vestibular del oído , la cóclea y el riñón, pudiendo también un bloqueo neuromuscular (1)(8)(2). La Kanamicina o Kantrax es un aminoglucósido de origen natural (1)(2) producido por el crecimiento de Streptomyces kanamyceticus (2) que se utiliza en forma de sulfato (2). Es muy efectivo sobre bacterias aerobias, mientras que no posee actividad sobre estreptococos, Branhamella, Pseudomonas y Clostridium (2). 7