estudio de poblaciones naturales españolas de pinus pinaster ait. y

ESTUDIO DE POBLACIONES NATURALES ESPAÑOLAS DE PINUS PINASTER AIT. Y
PINUS HALEPENSIS MILL. MEDIANTE ADN MITOCONDRIAL.
AGÚNDEZ D.1, BURBAN CH.2, ROBLEDO J.J.3, GONZÁLEZ-MARTÍNEZ S.C. 1, PETIT R.J.2,
ALÍA R. 1
1INIA-CIFOR. Dpto de Mejora Genética y Biotecnología. Apdo 8111. 28080 Madrid. España. 2
INRA.BP 45, 33611 Gazinet cedex. Francia. 3Unidad de Anatomía, Fisiología y Genética, ETSIM,
Ciudad Universitaria s/n, 28040 Madrid. España.
E-mail: agundez@inia.es
RESUMEN
Diez poblaciones naturales de Pinus halepensis Mill. analizadas han resultado monomórficas
en los tres fragmentos de ADN mitocondrial considerados. En el caso del fragmento estudiado en
Pinus pinaster Ait., las poblaciones muestreadas revelan el mitotipo occidental europeo (Península
Ibérica y Francia), excepto la población de Las Gabarras (Girona), que muestra el mitotipo oriental
europeo (Sureste de Francia, Italia, Córcega y Cerdeña). Este resultado parece indicar un origen
singular de las poblaciones catalanas en el ámbito ibérico, apoyado por los resultados obtenidos con
otros marcadores y que se ha manifestado también en poblaciones de frondosas próximas.
PALABRAS CLAVE: PCR-RFLP-SSCP, diversidad genética, coníferas, conservación
recursos genéticos
SUMMARY: Ten analysed native populations of Pinus halepensis Mill. have turned out to be
monomorphic at each one of the three mitochondrial DNA fragments considered. The fragment
analysed in Pinus pinaster Ait. shows that all sampled populations share the western-European
mitotype (Iberian Peninsula and France), excepting Las Gabarras (Girona), which shows easternEuropean mitotype (south-eastern France, Italy, Corsica and Sardinia). This result suggests a singular
origin, in the Iberian Peninsula context, of the catalan population, supported by results provided by
other markers and also by analysis of closed broadleaved tree populations.
KEY WORDS: PCR-RFLP-SSCP, conifers, genetic diversity, genetic resource conservation
INTRODUCCIÓN
Pinus pinaster Ait. (pino negral) presenta una distribución fragmentada en la Península
Ibérica, habitando en condiciones ecológicas muy variables y manifestando una elevada variabilidad
genética entre sus poblaciones (ALÍA, et al., 1996). Los análisis efectuados con terpenos
(BARADAT & MARPEAU, 1988) muestran un patrón complejo en la distribución de la variación
para el conjunto de la especie, existiendo en la Península Ibérica poblaciones pertenecientes a los tres
grupos principales de razas definidos por los autores: atlántico, mediterráneo y magrebí. Los estudios
realizados con isoenzimas (GONZÁLEZ MARTÍNEZ et al., 2001; SALVADOR et al., 2000)
también apuntan a una estructura genética compleja en la Península Ibérica, con tres grandes grupos
de poblaciones: atlántico, meridional y oriental. El estudio de la variación genética de Matsucoccus
feytaudi Duc., cochinilla específica del pino negral, mediante ADN mitocondrial, reveló la existencia
de tres linajes distintos en la distribución del insecto: Europeo occidental, Andaluz y Marroquí
(BURBAN et al., 1999).
Los estudios de variación genética de Pinus halepensis Mill. (pino carrasco) también han
mostrado una clara estructuración geográfica de la variabilidad en la Península Ibérica. El análisis
mediante isoenzimas destaca dos poblaciones de Málaga y dos catalanas diferenciadas del resto
(AGÚNDEZ et al., 1997, 1999) y los microsatélites de cloroplasto (GÓMEZ, 1998) han sugerido
además la existencia de refugios glaciares de la especie en Málaga y Girona.
El ADN mitocondrial se transmite maternalmente en coníferas. La ausencia de recombinación
genética derivada de este hecho, unida al lento ritmo evolutivo del ADN mitocondrial en las plantas,
permite su utilización en la caracterización de los procesos de migración en especies de coníferas
como Pinus sylvestris L. (SORANZO et al., 2000; SINCLAIR et al., 1998, 1999) o Picea abies L.
(SPERISEN et al., 1998).
Las técnicas de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y RFLP (polimorfismo en la
longitud de fragmentos digeridos con enzimas de restricción) combinadas con SSCP (polimorfismo
en la conformación de la cadena sencilla) permiten una mayor resolución en la evaluación de
polimorfismos debidos a sustituciones que afectan a la conformación de la cadena sencilla (recogido
en DUMOLIN-LAPÈGUE et al., 1996).
En este trabajo se presentan los resultados obtenidos con Pinus halepensis Mill. y Pinus
pinaster Ait. en la Península Ibérica analizando ADN mitocondrial con el fin de comprobar la
existencia de posibles centros de migración de estas dos especies.
MATERIAL Y MÉTODOS
Material vegetal. El material procede de 9 poblaciones naturales de Pinus pinaster y 10 de
Pinus halepensis, seleccionadas de manera que representaran principalmente la región mediterránea
de su distribución en conexión con las masas del sudeste de Francia y con las del norte de Marruecos
(Tabla 1 y Figura 1).
Tabla 1. Poblaciones de Pinus pinaster y Pinus halepensis estudiadas
Población
Oña
Codos
Riopar
Estepona
Gaucín
Cómpeta
Pradell
Benicasim
Las Gabarras
Cabanellas
Tivisa
Guardiola
Zuera
Colmenar
Cucalon
Paterna
Carratraca
Frigiliana
Benicasim
Código
Especie
Región Procedencia
Latitud
Longitud
Altitud
BU
Ppr
S. de Oña
42º 45´ 04´´ N 3° 31’ 10’’ W
700
Z
Ppr
Sist. Ibérico Central 41º 17´ 35´´ N 1º 25´ 11´´ W
1100-1200
AB
Ppr
S. Segura-Alcaraz
38º 28´ 05´´ N 2º 27´ 31´´ W
1200
MA1
Ppr
S. Bermeja
36º 31´ 05´´ N 5º 07´ 11´´ W
500
MA2
Ppr
S. de Ronda
36º 32´ 10´´ N 5º 17´ 56´´ W
500-700
MA3
Ppr
S. Almijara-Nevada 36º 51´ 44´´ N 3º 53´ 33´´ W 1000-1500
T
Ppr
S. del Pradell
41º 10´ 00´´ N
0º 54´ 00´´ E
550-750
CS
Ppr
Benicasim
40º 05´ 04´´ N
0º 00´ 46´´ E
150-500
G
Ppr
Litoral Catalán
41º 54´ 51´´ N
3º 03´ 02´´ E
150-250
CAB
Php
Alta Cataluña
42º 14´ 08´´ N
2º 47´ 24´´ E
210
TIV
Php
Cataluña Litoral
41º 03´ 25´´ N 0º 45´ 45´´ W
400
GUA
Php
Cataluña Interior
41º 40´ 04´´ N
1º 45´ 41´´ E
420
ZUE
Php
Monegros-Ebro
41º 55´ 00´´ N 0º 55´ 04´´ W
575
COL
Php
Alcarria
40º 05´ 20´´ N 3º 20´ 10´´ W
750
CUC
Php
Maestrazgo-Serranos 39º 47´ 15´´ N 0º 36´ 44´´ W
575
PAT
Php
Betica Septentrional 38º 37´ 37´´ N 2º 16´ 37´´ W
1000
CAR
Php
Sur
36º 50´ 28´´ N 4º 50´ 04´´ W
650
FRI
Php
Sur
36º 49´ 00´´ N 3º 55´ 18´´ W
570
BIM
Php
Litoral Levantino
40º 04´ 52´´ N 0º 01´ 14´´ W
430
Ppr = Pinus pinaster ; Php = Pinus halepensis ; n = número de árboles analizados
n
10
10
10
10
10
10
10
10
10
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
Se ha recomendado muestrear un número reducido de individuos por población (2 ó 3) y
muchas poblaciones como estrategia de muestreo óptima en la estimación de la diferenciación entre
poblaciones utilizando marcadores haploides (PONS & PETIT, 1995). En este trabajo se han
analizado 10 individuos por población de Pinus pinaster y 5 individuos por población de Pinus
halepensis.
La extracción de ADN total se realizó a partir de semillas germinadas o plántulas siguiendo el
método de DELLAPORTA et al. (1983) o DOYLE & DOYLE (1990), no habiendo encontrando
diferencia entre ellos.
Los fragmentos de ADN mitocondrial amplificados y su tamaño aparecen en la Tabla 2, junto
con las secuencias de los cebadores utilizados. En Pinus pinaster solo se ha utilizado Nad1-intron2,
al ser el único fragmento que mostrara polimorfismo en análisis previos de la especie sobre distintos
fragmentos de ADN mitocondrial (BURBAN, com. pers.). Para la amplificación se ha seguido con
modificaciones a MOREAU et al. (1994). La cantidad de 20ng de ADN molde se incorporan en un
volumen total de 25 μl que contienen 0.2 μM de cada cebador, 0.2 U de Taq polimerasa (Red
Goldstar de Eugentec), 2mM de MgCl2, 0.4 mM de cada dinucleótido dATP, dGTP, dCTP,
dTTP, tampón 1x (Eugentec 10x) y 4.4μg/ml de BSA. La amplificación se realizó en un
termociclador Techne PHC3, con el siguiente programa: 1 ciclo de 94º C durante 1’, 35 ciclos de 45’’
a 94º C, 45’’ a la temperatura de duplicación, y una elongación de 2’ o 2’ 15’’ a 72º C.
Tabla 2. Fragmentos de ADN mitocondrial y cebadores utilizados.
Fragmento
nad 1
intron 2
nad 4
intron 3
nad 5
intron 1
Cebador 1
Cebador 2
nad 1 exon 2 F
nad 1 exon 3 R
nad 4 exon 3 F
nad 4 exon 4 R
nad 5 exon 1 F
nad 5 exon 2 R
Secuencia de los
cebadores
gca tta cga tct gca gct ca
gga gct cga tta gtt tct gc
gga gct ttc caa aga aat ag
gcc atg ttg cac taa gtt ac
ttt ttt cgg acg ttt tct ag
ttt ggc caa gta tcc tac aa
Tamaño
(pb)
2200
Tª
(ºC)
57
Tiempo de
elongación
2’ 15’’
2100
49
2’ 00’’
2600
47
2’ 15’’
Referencias
DEMESURE
et al. (1995)
DUMOLIN et al.
(1997)
DUMOLIN et al.
(1997)
pb = pares de bases; secuenciado para nad1, tamaño aproximado en nad4 y nad5 (Burban, com. pers.)
Tª = temperatura de duplicación.
La digestión de 10 μl de producto de PCR con la enzima de restricción Hinf1 se realizó en un
volumen total de 25 μl. Los fragmentos resultantes se analizaron mediante la técnica SSCP, descrita
en ORITA et al. 1989, BASSAM et al. 1991 y recogida en BODÉNÈS et al. 1996.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El análisis de nueve poblaciones ibéricas de Pinus pinaster Ait.en el fragmento NAD1-Intron2
del ADN mitocondrial mediante técnicas RFLP-SSCP ha revelado la existencia de dos haplotipos
distintos. Ocho de las poblaciones comparten un único haplotipo, apareciendo el segundo
exclusivamente en la población de Las Gabarras, situada en el límite oriental de la distribución de la
especie en España (Figura 1). Las diez poblaciones de pino carrasco han resultado monomórficas en
los tres fragmentos de ADN mitocondrial compartiendo todas ellas el mismo haplotipo. La menor
variación entre poblaciones de Pinus halepensis Mill. encontrada en este estudio en relación con la de
Pinus pinaster Ait. confirma observaciones previas sobre la menor variabilidad genética del pino
carrasco respecto a otras especies del género (ALÍA et al. 1999).
La población de Pinus pinaster de Las Gabarras destaca con un mitotipo único entre todas las
poblaciones ibéricas analizadas. Este mitotipo es igual al encontrado en poblaciones de pino negral de
Francia suroriental, Italia, Córcega, Cerdeña y Túnez (BURBAN, com. pers.). La diferenciación
hallada mediante análisis de isoenzimas de 47 poblaciones naturales de Pinus pinaster, muestra la
población de Las Gabarras (Girona) con frecuencias alélicas intermedias entre las poblaciones del
este peninsular y las poblaciones del sudeste francés y de Italia, en cuyo grupo queda incluida
(BARBA et al., 2001).
Figura 1. Distribución de haplotipos de Pinus pinaster y Pinus halepensis en las
poblaciones de la Península Ibérica analizadas (los códigos de las poblaciones se definen
en la Tabla 1).
Las especiales características genéticas de las poblaciones situadas en esta región geográfica
se han manifestado igualmente en Pinus halepensis. GÓMEZ (1998) identifica un posible refugio de
esta especie en Cabanellas (Girona) tras el análisis de diversidad con microsatélites de cloroplasto.
Quercus suber L. también muestra un haplotipo característico y fijado en 3 poblaciones estudiadas en
Girona (Begur, Santa Coloma y Figueras) y una en Valencia (Pinet), analizadas mediante PCR-RFLP
con ADN de cloroplastos (JIMÉNEZ, 2000). Estos resultados hacen pensar en la existencia en esta
zona de una dinámica postglaciar independiente de la de otras regiones peninsulares para distintas
especies vegetales. Si se considera además la elevada diversidad de especies forestales en la región
catalana (VALLEJO et al. 2000), ésta se manifiesta como un importante elemento a considerar en la
estrategia española de conservación de los recursos genéticos forestales.
En Pinus pinaster, el mitotipo oriental caracteriza poblaciones sensibles al ataque de
Matsucoccus feytaudifuertemente afectadas (sudeste de Francia), recientemente afectadas (norte de
Italia y Córcega) o zonas donde el insecto no está presente (Túnez); en la Península Ibérica está
presente en todas las masas muestreadas a excepción de la de Córdoba (BURBAN et al., 1999). En
este estudio no se incluyeron poblaciones catalanas por lo que no se realizó seguimiento del insecto,
si bien sería interesante comprobar su presencia; en el caso de presencia del insecto, se trataría de
poblaciones resistentes a la cochinilla cuya utilización como fuente de semilla para las repoblaciones
de la parte oriental del área de distribución sería recomendable; si la cochinilla no estuviera aún
presente, habría que tener un cuidado especial para no introducirla en esta región, de tal forma que no
sufrieran el mismo destino que las masas del sudeste de Francia.
REFERENCIAS
AGÚNDEZ, D., DEGEN, B., VON WUEHLISCH, G., ALÍA, R.; (1997). Genetic variation of
Aleppo pine (Pinus halepensis Mill.) from Spain. Forest Genetics 4(4): 201-209.
AGÚNDEZ, D., DEGEN, B., VON WUEHLISCH, G., ALÍA, R.; (1999). Multilocus analysis of
Pinus halepensis Mill. from Spain: Genetic diversity and clinal variation. Silvae Genetica 48(3-4):
173-178.
ALÍA, R., MARTÍN, S., DE MIGUEL, J., GALERA, R., AGÚNDEZ, D., GORDO, J., SALVADOR,
L., CATALÁN, G., GIL, L.; (1996). Regiones de procedencia. Pinus pinaster Aiton. Organismo
Autónomo Parques Nacionales. Madrid.
ALÍA, R., GALERA, R., MARTÍN, S., AGÚNDEZ, D., DE MIGUEL, J., IGLESIAS, S.; (1999).
Mejora genética y masas productoras de semilla de los pinares españoles. Instituto Nacional de
Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA). Madrid. Monografías INIA: Forestal
N.1.
BARADAT, Ph., MARPEAU, A.; (1988). Le pin maritime Pinus pinaster Ait. Biologie et génétique
des terpènes pour la conaissance et lamélioration de l´espèce. Thèse. Université Bordeaux I.
Bordeaux.
BARBA D., GONZÁLEZ-MARTÍNEZ S.C., RIBEIRO M.M., AGÚNDEZ D., SALVADOR L.,
ALIA R., GIL L.; (2001). Variación genética de Pinus pinaster Ait.:Aplicación a la identificación
y caracterización del Material Forestal de Reproducción (MFR). (en este congreso).
BASSAM B.J., CAETENO-ANOLLES G., GRESSOF P.M., (1991). Fast and sensitive silver
staining of DNA in polyacrilamyde gels. Annals of Biochemistry 196: 80-83.
BODENES C., LAIGRET F., KREMER A.; (1996). Inheritance and molecular variation of PCRSSCP fragments in pedunculate oak (Quercus robur L.). Theoretical and Applied Genetics 93:
348-354.
BURBAN C., PETIT R.J., CARCREFF E., JACTEL H.; (1999). Rangewide variation of the maritime
pine bast scale Matsococus feytaudi Duc. (Homoptera: Matsucoccidae) in relation to the genetic
structure of its host. Molecular ecology 8: 1593-1602.
DELLAPORTA, S.L., WOOD J., HICKS J.B.; (1983). A plant minipreparation: Version II. Plant
Molecular Biology Reporter 1: 19-21.
DEMESURE, B., SODZI, N., PETIT, R.J.; (1995). A set of universal primers for amplification of
polymorphic non-coding regions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants. Molecular
ecology 4: 129-131.
DOYLE, J.J., DOYLE, J.L.; (1990). Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12: 13-15.
DUMOLIN-LAPÈGUE, S., BODÉNÈS, C., PETIT, R.J.; (1996). Detection of rare polymorphisms in
mitochondrial DNA of oaks with PCR-RFLP combined to SSCP analysis. Forest Genetics 3(4):
227-230.
DUMOLIN-LAPÈGUE, S., PEMONGE, M.H., PETIT R.J.; (1997). An enlarged set of consensus
primers for the study of organelle DNA in plants. Molecular ecology 6: 393-397.
GÓMEZ, A.; (1998). Análisis de la variabilidad genética mediante marcadores moleculares de ADN
en poblaciones españolas de Pinus halepensis Mill. Tesis Doctoral. Universidad Politécnica de
Madrid.
GONZÁLEZ MARTÍNEZ, S.C., AGÚNDEZ, D., ALÍA, R., SALVADOR, L., GIL, L.; (2001).
Geographical variation of gene diversity of Pinus pinaster Ait. in the Iberian Peninsula. En:
Müller-Starck, G. (ed.). Genetic response of forest systems to changing environmental conditions.
Kluwer Academic Press, Dordrecht.
JIMÉNEZ, M.P.; (2000). Análisis de la variabilidad genética de Quercus suber L. mediante
marcadores moleculares y su aplicación a la conservación de recursos genéticos. Tesis doctoral.
Universidad Politécnica de Madrid.
MOREAU F., KLEINSCHMIT J., KREMER A.; (1994). Molecular differentiation between Quercus
petraea and Quercus robur assessed by random amplified DNA fragments. Forest Genetics 1: 5164.
ORITA M., IWAHANA H., KANAZAWA H., HAYASHI K., SEKIYA T.; (1989). Detection of
polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation
polymorphisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 86: 2766-2270.
PONS, O., PETIT, R.J.; (1995). Estimation, variance and optimal sampling of gene diversity. I.
Haploid locus. Theor Appl Genet 90: 462-470.
SALVADOR, L., ALÍA, R., AGÚNDEZ, D., GIL, L.; (2000). Genetic variation and migration
pathways of maritime pine (Pinus pinaster Ait) in the Iberian peninsula. Theor Appl Genet 100:
89-95.
SINCLAIR, W.T., MORMAN, J.D., ENNOS, R.A.; (1999). The postglacial history of Scots pine
(Pinus sylvestris L.) in western Europe: evidence from mitochondrial DNA variation. Molecular
Ecology 8: 83-88.
SINCLAIR, W.T., MORMAN, J.D., ENNOS, R.A.; (1998). Multiple origins for Scots pine (Pinus
sylvestris L.) in Scotland: evidence from mitochondrial DNA variation. Heridity 80: 233-240.
SORANZO, N., ALÍA, R., PROVAN, J., POWELL, W.; (2000). Patterns of variation at a
mitochondrial sequence-tagged-site locus provides new insights into the postglacial history of
European Pinus sylvestris populations. Molecular Ecology 9: 1205-1211.
SPERISEN, C., BÜCHLER, U., MÁTYÁS, G.; (1998). Genetic variation of mitochondrial DNA
reveals subdivision of norway spruce (Picea abies (L.) Karst.). En: Karp, A., Isaac, P., Ingram, D.
(eds.). Molecular tools for screening biodiversity. Pp. 413-417. Chapman & Hall, London.
VALLEJO, R., SÁNCHEZ DE RON, D., DE TUERO, M., ALÍA, R.; (2000). Los recursos genéticos
forestales en España. Investigación Agraria, Sistemas y Recursos Forestales. Fuera de Serie,
número 2: 21-43.