C-209-docu

CANAL VACUOLAR TIPO SV COMO UN MODELO PARA EL ESTUDIO DE
LOS FUNDAMENTOS DEL FUNCIONAMIENTO DE CANALES UNITARIOS
Enríquez-Figueroa RA, Marmolejo-Murillo LG, Velarde-Buendía A, Dobrovinskaya
O, Pottosin I. (raenfig@hotmail.com)
Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas, Universidad de Colima.
El registro y análisis de canales unitarios mediante la técnica de patch-clamp es la
vía más directa para enseñar las bases del funcionamiento de los canales iónicos.
En este estudio presentamos el canal SV de vacuolas vegetales como un modelo
versátil y atractivo. Los canales SV se expresan abundantemente (>1 canal/ µm 2)
en la membrana vacuolar en todos los tejidos y tipos celulares de plantas
superiores. En la planta-modelo Arabidopsis es codificado por el único gen
AtTPC1, que forma un canal de Ca2+ de doble poro. La secuencia homologa ha
sido identificada originalmente en células de mamíferos, donde se expresan en los
endolisosomas. En plantas se forma un canal de alta conductancia (100-200 pS)
activado por potenciales positivos y por Ca2+ citosólico y regulado a la baja por el
Ca2+ vacuolar. Aislamos las vacuolas (~50 mm en diámetro, intensamente
coloreadas) mecánicamente desde la raíz del betabel (Beta vulgaris), la cual es
fácil de adquirir y conservar, además de su bajo costo. Es fácil formar sellos de
alta resistencia (>10 GOhm) con la pipeta de patch en vacuolas de betabel.
Aprovechando la cinética lenta de apertura y cierre de canales SV, aplicamos la
técnica de rampas de voltaje para obtener la relación corriente-voltaje (I/V) del
canal unitario en parches aislados. La estabilidad de la membrana vacuolar
permite variar el voltaje en un rango amplio (de -200 a +200 mV). Utilizamos las
relaciones I/V para demostrar: a) secuencias de la permeabilidad absoluta y
relativa para cationes monovalentes (Li+, Na+, K+, Rb+, Cs+, NH4+ y N-metilglutamina) y b) bloqueo dependiente de voltaje por los iones de amonio
cuaternarios (TMA+, TEA+ y TBA+). El aumento de tamaño del ión de TMA+ a TEA+
resulta en variación del patrón de la dependencia de voltaje del bloqueo (el TMA +
es permeable a potenciales altos y TEA+ no). TBA+ bloqueó el canal con mayor
afinidad (en rango de micromoles) comparado con TMA+ y TEA+, lo que nos
permite resolver directamente los actos del bloqueo y desbloqueo para evaluar las
constantes de velocidad para estos dos procesos a potenciales fijos. En otra serie
de mediciones de la cinética estacionaria del SV en parches multi-canales, al
analizar los histogramas de amplitud que resultan, encontramos que las aperturas
de los canales vecinos están interrelacionados de manera anti-cooperativa, así
que la apertura de un canal dificulta la apertura de los siguientes. La mayoría de
los datos presentados arriba no han sido publicados hasta la fecha. Nuestro
modelo experimental permite también ilustrar la modulación de la activación
voltaje-dependiente por cationes bivalentes (específica) y por fuerza iónica y
potencial de superficie (inespecífica), demostrar el bloqueo asimétrico desde
ambos lados de la membrana por una gran variedad de bloqueadores, así como
construir las cinéticas de las corrientes macroscópicas utilizando los registros de
canales unitarios, entre otras.
Apoyado por fondos de CONACyT y Universidad de Colima.