modificación del punto isoeléctrico del interferón felino

MODIFICACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DEL INTERFERÓN FELINO
RECOMBINANTE PARA SU PURIFICACIÓN EN UN PASO A PARTIR DE
SOBRENADANTES DE CULTIVO DE CÉLULAS DE INSECTO
1
2
2
Alexandra Marisa Targovnik ;Marcela Solange Villaverde ; Gerardo Claudio Glikin , Liliana María
2
1
1
Elena Finocchiaro , Osvaldo Cascone ;María Victoria Miranda
1
Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología. FFyB. UBA, Junín 956 piso 6, Buenos Aires,
2
Argentina. Unidad de Transferencia Genética; Área Investigación. Instituto de Oncología “Ángel H.
Roffo”, Universidad de Buenos Aires, Argentina
El Interferón felino (FeIFN) es una proteína glicosilada de 171 aminoácidos con un punto isoeléctrico (pI) de 6,5.
Se ha demostrado que la aplicación de FeIFN recombinante (rFeIFN) en gatos mejora la sintomatología y
prolonga la supervivencia de estos animales infectados con diversos virus felinos. El tratamiento con FeIFN es
más efectivo a largo plazo que el Interferón alfa humano usado tradicionalmente en estos casos. Por otro lado se
ha podido comprobar la efectividad del FeIFN en el tratamiento de neoplasias felinas y algunas caninas. El
rFeIFN no se produce ni comercializa en Argentina. El objetivo de este trabajo fue modificar el punto isoeléctrico
(pI) del rFeIFN para facilitar su purificación por cromatografía de intercambio iónico a partir de sobrenadantes de
cultivos en el sistema baculovirus-células de insectos.
El gen sintético de rFeIFN se clonó bajo el promotor de poliedrina y el péptido señal viral GP67, utilizando el
vector de transferencia pAcGP67 (Pharmingen). Además se agregó en el extremo 3’ del gen una secuencia que
codifica para 8 residuos de arginina. Se obtuvieron los baculovirus recombinantes por cotransfección con el
plásmido de transferencia y el ADN viral BaculoGoldTM Brigth en células de insecto Sf9 cultivadas en medio
Sf900 II suplementado con 1% de suero fetal bovino. El título viral se amplificó en sucesivos pasajes hasta
8
obtener un stock de trabajo de 1 x 10 ufp/ml. El rFeIFN8xarg se cosechó el día 4 post infección (MOI 1) a partir
6
del sobrenadante de cultivo de 1,5x10 células/ml.
7
El nivel de expresión alcanzado fue de 2,5x10 U/ml de cultivo (156 mg/litro) determinado por la capacidad del
rFeIFN8xarg de inhibir el efecto citopático del virus VSV sobre la línea celular felina CRFK (riñón felino normal).
El pI del rFeIFN8xarg fue de 9,15. Se acondicionó el sobrenandante de expresión en buffer Tris HCl 10 mM pH
8,5 y se sembró en una matriz de SP-Sepharose. El rFeIFN8xarg eluyó con buffer Tris-HCl 10 mM pH 8,5, NaCl
8
350 mM. Se obtuvo un rendimiento del 70% con una actividad específica de 1,8x10 U/mg y un factor de
purificación de 60.
El rFeINF purificado presentó actividad antiviral similar al estándar comercial (Virbagen Omega, Virbac, Francia).
Además, presentó alta actividad citotóxica sobre la línea tumoral de carcinoma mamario felino (Al).
Con el esquema de expresión/purificación optimizado se logró en un solo paso obtener rFeINFX8arg con
actividad biológica antiviral y antitumoral intacta.
La modificación del pI del rFeIFN con el agregado de la etiqueta de argininas resultó efectivo para la purificación
por cromatografía de intercambio iónico a partir del medio de expresión quedando el producto libre de
contaminantes presentes en el suero, en especial la albúmina y libre de partículas virales (baculovirus
recombinante).