PEM – 3 (Dra. Inés María de Torres Ramírez) Cristina Martín REACCIONES CELULARES PREMISAS - Los neutrófilos son las principales células efectoras en la inflamación aguda pero tienen una vida media corta. La activación del endotelio es un proceso imprescindible en la inflamación aguda. Los macrófagos y/o monocitos intervienen en menor número pero sobreviven mucho más tiempo. MARGINACIÓN Como ya hemos comentado anteriormente, la marginación es el proceso mediante el cual los leucocitos se acumulan en la periferia de los vasos sanguíneos, junto al endotelio, lo que les permite una mayor interacción con éste, muy necesaria para el siguiente paso de la respuesta inflamatoria: el rodamiento. RODAMIENTO (SELECTINA– GLUCOPROTEINA) El rodamiento es el proceso por el cual mediante adhesiones débiles transitorias los leucocitos ruedan sobre la superficie endotelial (rodadura). Para que se produzca este proceso son muy importantes unas moléculas de adhesión, en este caso de la familia de las selectinas: - Selectina E (CD26E) en células endoteliales Selectina P (CD26P) en endotelio y plaquetas Selectina L (CD26L) en leucocitos Las selectinas endoteliales normalmente se expresan en bajas concentraciones o no se encuentran presentes en las células normales. Para que su presencia incremente en la superficie celular es necesaria la interacción con mediadores específicos que activan la célula endotelial, por lo que la unión con los leucocitos queda restringida en gran parte a las zonas endoteliales próximas a los lugares de infección o de lesión tisular (donde se producen los mediadores). - P-Selectina: En células no activadas se encuentra almacenada en los cuerpos intracelulares de Weibel-Palade y aumenta su expresión en la superficie (redistribución) en presencia de histamina, trombina o factor activador plaquetario (PAF). - E-Selectina: No se expresa en el endotelio normal y es inducida tras la estimulación por mediadores inflamatorios como IL-1 y TNF. Por otro lado, es necesario que los leucocitos expresen en su superficie el ligando de estas selectinas para que se pueda realizar la adhesión. Estos ligandos son glicoproteínas, fundamentalmente de tipo mucinas. La expresión y redistribución de selectinas y sus ligandos viene regulada por citocinas que se elaboran como respuesta a la infección y la lesión. 10 PEM – 3 (Dra. Inés María de Torres Ramírez) Cristina Martín Estas débiles interacciones de rodamiento retrasan a los leucocitos y les dan la oportunidad de unirse de forma más firme al endotelio, que es el siguiente paso que deben realizar en el proceso inflamatorio: la pavimentación. Por tanto, la activación endotelial es un proceso imprescindible para el correcto desarrollo de la reacción inflamatoria. ADHESIÓN O PAVIMENTACIÓN (Ig – INTEGRINA) Una vez se han realizado las adherencias laxas y a medida que el leucocito va rodando por la superficie endotelial va formando adhesiones más fuertes con el endotelio, es lo que llamamos pavimentación. En este proceso participan las inmunoglobulinas ICAM-1 y VCAM-1 (en la superficie de las células endoteliales) y las integrinas LFA1, MAC1, VLA4 y LPAM-1 (en los leucocitos). ICAM-1 se une a LFA1 y MAC1, mientras que VCAM1 se asocia a VLA4 y LPAM1. Pero también son necesarias ciertas modificaciones en estas moléculas para que el proceso se pueda realizar correctamente: - Inmunoglobulinas: Son los ligandos de las integrinas. En la célula endotelial no activada se encuentran en bajas concentraciones en la membrana plasmática y aumenta su expresión en presencia de TNF y IL1. - Integrinas: Glucoproteínas heterodímicas que en condiciones normales se expresan en concentración baja en la membrana plasmática de los leucocitos y éstas son de baja afinidad. Cuando los leucocitos se encuentran con las quimiocinas (citocinas quimiotácticas secretadas en los focos de inflamación) expresadas en la superficie endotelial, éstos se activan y sus integrinas sufren cambios de conformación, pasando a una forma de alta afinidad. La unión de las integrinas a sus ligandos transmite señales a los leucocitos, que dan lugar a cambios del citoesqueleto implicados en una unión firme al sustrato. Por tanto, el aumento de intensidad de la fijación se hace principalmente mediante integrinas activadas y es imprescindible para que tenga lugar el siguiente proceso de la respuesta inflamatoria: la transmigración. Moléculas de adhesión a recordar Adhesión lábil (rodamiento): - Familia de las selectinas: Tres tipos (P, E y L). - Glucoproteínas (mucinas): Ligandos de las selectinas. Adhesión estable (pavimentación): - Familia de las integrinas: las encontramos en la superficie de los leucocitos y son: LFA1, MAC1, VLA4 y LPAM1. - Superfamilia de las Ig’s: Las encontramos en la superficie de las células endoteliales y son: ICAM1 i VCAM1. Ligandos de las integrinas. 11 PEM – 3 (Dra. Inés María de Torres Ramírez) Cristina Martín ACTIVACIÓN ENDOTELIAL Mecanismos moleculares en la activación de la célula endotelial: 1. Redistribución de las moléculas de adhesión hacia la superficie celular (cuerpos de Weibel-Palade y P-Selectinas). 2. Inducción de las moléculas de adhesión sobre el endotelio por parte de las citoquinas (IL-1 y TNF) 3. Aumento de la intensidad de fijación a través de las integrinas activadas. 4. Transmigración a través de las uniones intercelulares de las células endoteliales a través de PECAM-1 (CD31) “platelet endothelial cell adhesion”. TRANSMIGRACIÓN Una vez adheridos a la pared endotelial, los leucocitos necesitan atravesarla. Este proceso, llamado transmigración o diapédesis, se realiza siempre en las vénulas postcapilares. Los leucocitos abandonan el vaso pasando por los espacios interendoteliales. En este mecanismo tiene una gran importancia la molécula de adhesión PECAM-1 (también llamada CD31), que está presente tanto en endotelio como en leucocitos y forma una especie de canal para que pase el leucocito. Una vez atravesado el endotelio, los leucocitos perforan la membrana basal mediante la secreción de colagenasas. ¿Cómo se mueve el leucocito? Para que tenga lugar la transmigración es necesaria la fijación de agentes quimiotácticos a receptores específicos del leucocito (el leucocito una vez empieza a transmigrar tiene que saber ya a donde se dirige). Esta unión ligando-recepto desencadena una cadena de activación que, mediante le fosfoinositol, dará lugar a la liberación de calcio citosólico. 12 PEM – 3 (Dra. Inés María de Torres Ramírez) Cristina Martín El leucocito emite un pseudópodo (lamelipodo) que posee un complejo de filamentos de actina-miosina. El calcio citosólico liberado interaccionará con proteínas reguladoras de la actina (filamina, gelsolina, profilina, calmodulina), lo que permitirá el ensamblaje de los filamentos y producirá contracción y movimiento, tirando de la célula en dirección a la extensión. Vemos la zona endotelial y el leucocito que va rodando, se fija establemente y en la última imagen ya lo encontramos transmigrando hacia fuera. RESUMEN RECLUTAMIENTO DE LEUCOCITOS AL FOCO INFLAMATORIO - Activación endotelial que incrementa la expresión de selectinas y sus ligandos. Rodamiento de los leucocitos facilitado por la adherencia o unión laxa de selectinas a sus ligandos de hidratos de carbono. Adherencia firme leucocitos-células endoteliales mediada por quimiocinas en las que las integrinas se unen a sus ligandos endoteliales. Transmigración de leucocitos entre las células endoteliales mediante las interacciones PECAM-1 y salida al espacio extravascular. Para que ocurran estos mecanismos de rodamiento, adhesión i transmigración lo más importante es que la célula endotelial tiene que estar activada y el leucocito también tiene que participar activamente. La marginación, rodamiento y adhesión son procesos intravasculares, la transmigración se da por diapédesis y la migración hasta el foco de la lesión es extravascular i recibe el nombre de quimiotaxis. QUIMIOTAXIS Una vez fuera del endotelio es necesario que los leucocitos avancen hacia el lugar de la noxa. Para ello se produce un fenómeno de quimiotaxis, que se define como la locomoción orientada de las células en el intersticio según gradiente químico. Esta quimiotaxis puede ser producida por dos tipos de mediadores químicos: - Exógeno: El producto bacteriano libera una serie de moléculas que son captadas e identificadas por unos receptores específicos de los leucocitos. Endógeno: Productos del propio leucocito. Básicamente son: o Elementos del sistema de complemento (C5a) o Productos de la vía de las lipooxigenasas del metabolismo del ácido araquidónico (leucotrieno B4) o Citocinas (IL-8) 13 PEM – 3 (Dra. Inés María de Torres Ramírez) Cristina Martín ¿Qué tipos de leucocitos migran? El tipo de leucocito que migra depende de la duración de la respuesta inflamatoria y del tipo del estímulo. En la mayoría de las formas de inflamación aguda predominan los neutrófilos durante las primeras 6 a 24 horas y son sustituidos por monocitos/macrófagos a las 24-48 horas. Esto es así porque las células inflamatorias (leucocitos, monocitos y en menor grado los linfocitos) responden a estímulos quimiotácticos a diferentes velocidades (los leucocitos más rápidamente y los macrófagos/monocitos más lentamente). Pero hay ciertas excepciones: - En la inflamación aguda por Pseudomonas el reclutamiento de neutrófilos es continuo durante varios días. Por eso son tan purulentas muchas veces las Pseudomonas. En las infecciones víricas los linfocitos son los primeros en activarse. En las infecciones parasitarias el reclutamiento es de eosinófilos, así como en las alergias (más adelante veremos que esto será un marcador que podemos encontrar en los análisis de sangre periférica). FAGOCITOSIS Una vez el leucocito llega al lugar de la noxa, lo siguiente que tiene que hacer es acabar con ella. Para esto se pone en marcha el mecanismo de fagocitosis, que tiene tres fases: 1. Reconocimiento y adhesión de la partícula: Los leucocitos expresan varios receptores que reconocen estímulos externos y emiten señales activadoras. Estos receptores capaces de reconocer los productos bacterianos son: a. Receptores de tipo señuelo/TLR: Para los productos microbianos b. Receptores acoplados a la proteína G: Reconocen péptidos bacterianos cortos, algunas quimiocinas y productos de degradación del complemento como C5a. c. Receptores para las opsoninas: Son los más importantes. La partícula que tiene que ser fagocitada se tiene que encontrar recubierta completamente por varios factores séricos llamados opsoninas que son básicamente el factor corto de la inmunoglobulina G, la C3b y las colectinas. Es decir, para que el producto bacteriano sea reconocido por un leucocito tiene que estar opsonizado y a la vez el leucocito tiene que tener receptores específicos para estas opsoninas: FcγR, las colectinas 1, 2, y 3 y la fracción C1 del complemento q. Cada uno de estos receptores reconoce específicamente alguna de las opsoninas. 14 PEM – 3 (Dra. Inés María de Torres Ramírez) Cristina Martín 2. Englobamiento de la partícula (interiorización): La célula (neutrófilo o monocito) emite extensiones citoplasmáticas o pseudópodos que rodean a la partícula hasta quedar englobada dentro de un fagosoma, cuya membrana procede de la membrana citoplasmática de la célula. Esta membrana del fagosoma se fusiona con la membrana limitante de un gránulo lisosomal produciéndose la descarga del contenido del lisosoma en el fagolisosoma (que no es más que el fagosoma con los gránulos lisosomales). El proceso de degradación de los agentes extraños puede realizarse mediante otros métodos a parte de la fagocitosis convencional (interiorización). Estos métodos consisten en procesos de degranulación paulatina del neutrófilo y/o monocito en que se produce un escape de las sustancias contenidas en los lisosomas al espacio extracelular. Esto se puede producir mediante varios mecanismos: - - Regurgitación durante la ingestión: Mientras se está produciendo la fagocitosis la vacuola fagocítica puede permanecer temporalmente abierta al exterior antes de que se complete el cierre del fagolisosoma, permitiendo la salida de contenido lisosomal. Endocitosis inversa: Captación de partículas ingeribles encima de superficies planas (endotelios). Citolisis: Muerte del leucocito. No se forma el fagosoma sino que directamente en cuanto reconoce la partícula a fagocitar se suicida, liberando todos los gránulos. Cada leucocito utilizará únicamente uno de éstos métodos (ej: uno de los leucocitos está haciendo fagocitosis y el vecino, viendo que éste ya está cubriendo esa función, se suicida y libera el contenido de sus gránulos para complementar la acción de su compañero). 3. Degradación y destrucción de la partícula: a. Mecanismos dependientes de oxigeno (el más importante): La fagocitosis estimula el consumo de O2 por parte del leucocito. En el interior del lisosoma tenemos la NADPH oxidasa que a partir de oxígeno forma un ión superóxido. El ion superóxido por una dismutacion espontánea se combina con hidrogeno y produce peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) en el interior del lisosoma que, a través de la mieloperoxidasa y junto a un ión cloro forma el radical hipocloroso (antimicrobiano y antioxidante). El radical hipocloroso es el bactericida más eficaz de los neutrófilos y es también uno de los componentes de la lejía. 15 PEM – 3 (Dra. Inés María de Torres Ramírez) Cristina Martín b. Mecanismos independientes de oxigeno: Por sustancias contenidas en los gránulos de los leucocitos como: 1) Proteína bactericida por incremento de la permeabilidad (BPI), 2) Lisozima, 3) Lactoferrina, 4) Proteína Básica principal y 5) Defensinas. Estas enzimas son capaces de actuar gracias a la disminución del pH (pH = 4-5) que se produce como consecuencia del estallido oxidativo de los mecanismos dependientes de oxígeno. Gránulos ESPECÍFICOS: Lactoferrina Lisozima Fosfatasa alcalina Colagenasa tipo IV Moléculas de adhesión Activación del plasminógeno Fosfolipasa A2 Gránulos AZURÓFILOS: Mieloperoxidasa Lisozima Proteínas catiónicas Elastasa BPI Defensinas Catepsina G Fosfolipasa A RESUMEN DEL PROCESO DE INFLAMACIÓN AGUDA De forma resumida, el proceso de inflamación consta de las siguientes fases: 1. Tras la aparición de una noxa inicialmente se da una vasoconstricción seguida inmediatamente de una vasodilatación, un aumento de flujo y un aumento de permeabilidad. Estos cambios provocan una salida de líquido plasmático al espacio extracelular: si salen proteínas plasmáticas en el momento en que hay más acumulo de proteínas fuera que dentro del vaso se produce un desequilibrio hidrostático que favorece la salida de fluido (agua e iones), causando un edema. A su vez esta pérdida de líquido aumenta la viscosidad de la sangre (aumento relativo de hematíes) y provoca una disminución de la velocidad de circulación del flujo, dando lugar al ESTASIS SANGUÍNEO. Cabe destacar que en vénulas el flujo es normal. 16 PEM – 3 (Dra. Inés María de Torres Ramírez) Cristina Martín 2. Una vez se han dado estas modificaciones hemodinámicas los leucocitos empiezan a situarse en la periferia del vaso, junto al endotelio, quedando así los hematíes en la parte central del vaso. Este proceso recibe el nombre de MARGINACIÓN. 3. Debido a diversos mediadores químicos (principalmente factor plaquetario e histamina), el endotelio se activa, expresando en su superficie selectinas que se unirán a las selectinas presentes en la membrana de los leucocitos mediante adhesiones lábiles. Durante este proceso el leucocito rodará literalmente por el endotelio, lo que recibe el nombre de RODAMIENTO. 4. Debido a citoquinas presentes en la superficie endotelial los leucocitos se activarán y cambiaran la conformación de sus integrinas, que se unirán a las integrinas del endotelio mediante unas adhesiones mucho más estables. Es lo que llamamos PAVIMENTACIÓN. 5. Una vez llegan al foco inflamatorio, los leucocitos atraviesan el endotelio por diapédesis. Este proceso recibe el nombre de TRANSMIGRACIÓN. 6. Ya fuera del vaso los leucocitos se desplazan hacia el foco de la lesión a lo largo de un gradiente químico producido por mediadores químicos. Es lo que llamamos QUIMIOTAXIS. 7. Finalmente, una vez llegan al lugar de la lesión comienza el proceso de FAGOCITOSIS. 8. Tras 6-24h estos leucocitos morirán por apoptosis y, si aún no se ha resuelto el proceso inflamatorio, serán sustituidos a las 24-48h por otras células, normalmente monocitos/macrófagos. TAKE HOME MESSAGES Las fases moleculares de la inflamación aguda son: la activación endotelial, la marginación y rodamiento de los leucocitos, la adherencia leucocito-endotelio, la transmigración por diapédesis, la quimiotaxis y la fagocitosis. En todos estos procesos intervienen mediadores químicos que activan receptores y ligandos específicos. Si bien en la mayoría de las formas de inflamación aguda el reclutamiento es a expensas de neutrófilos (en las primeras 6-24h), hay algunas excepciones a recordar. En la degradación y destrucción de la partícula en el proceso de fagocitosis, existen los mecanismos dependientes e independientes de oxígeno. Existen muchas enfermedades causadas por la disfunción leucocitaria en la respuesta inflamatoria. 17 PEM – 3 (Dra. Inés María de Torres Ramírez) Cristina Martín DEFECTOS EN LA FUNCIÓN LEUCOCITARIA DEFECTOS EN EL NÚMERO DE LEUCOCITOS (LEUCOPENIA) Se considera leucopenia cuando hay menos de 5.000 leucocitos por ul. Se producen leucopenias por ejemplo en tratamientos con inmunosupresores (en pacientes trasplantados, con cáncer,…) o en enfermedades de inmunidad deprimida, como el VIH. Estos enfermos se infectan constantemente o tienen predisposición a infectarse y a que la infección sea duradera. DÉFICIT DE ADHERENCIA LEUCOCITARIA El número de leucocitos es correcto pero estos no se fijan bien al endotelio, por lo que no podrán hacer la transmigración, parándose el proceso de inflamación. Esto pasa en personas que tienen defectos genéticos de moléculas de adhesión, ya sea de las que participan en la adhesión laxa o fija: - LAD1: Déficit de integrinas β2 o CD18 LAD2: Déficit del carbohidrato receptor selectinas DEFECTOS DE LA MIGRACIÓN Y QUIMIOTAXIS Estos defectos pueden ser debidos a: - Anomalías intrínsecas de los leucocitos: o Diabetes: Los leucocitos no presentan los receptores adecuados que les permiten identificar los mediadores. Es por esto que los pacientes diabéticos tienen que vigilar mucho con las heridas, ya que presentan una predisposición a las infecciones. o Síndrome de Chédiak-Higashi: Enfermedad autosómica recesiva producida por la mutación del gen regulador del tráfico lisosomal (LYST). Destaca la presencia de lisosomas gigantes en varios tipos de células (neutrófilos) con agranulocitosis i disfagocitosis (no operativos). Quienes sufren esta enfermedad presentan infecciones de repetición ya desde pequeños, defectos somáticos y neurológicos y suelen presentar albinismo. También pueden Lisosomas gigantes presentar abscesos fríos. Defectos en la generación de factores quimiotácticos (congénitos o adquiridos del C5 o Ig) o Síndrome del leucocito perezoso: Los leucocitos no responden a los estímulos quimiotácticos llegando al foco demasiado despacio. Destaca una neutropenia periférica severa pero en la médula ósea el número es igual que en los test cutáneos. Cuando existe este tipo de discordancia hay que pensar que el defecto reside en el paso de los leucocitos desde la médula ósea a la sangre. 18 PEM – 3 (Dra. Inés María de Torres Ramírez) o Cristina Martín Síndrome de Job: Hiperinmunoglobulinemia de IgE (AS-HIES) Su causa es desconocida y afecta sobretodo a niñas pelirrojas. Destaca un aumento de IgE circulante en sangre >2000ui/mL (biomarcador diagnóstico). Quienes sufren esta enfermedad presentan infecciones bacterianas recurrentes (piel y pulmón) por Stafiloccocus Aereus, rash cutáneo eccematoso, eosinofilia i abscesos fríos cutáneos con poca respuesta inflamatoria. - Inhibidores séricos del quimiotaxtismo, como inactivadores del C5 - Inhibidores de la motilidad de los leucocitos o Fármacos como la cloroquina (cáncer) o Factores séricos en enfermedades como la artritis reumatoide (antes se utilizaban fármacos que reducían la motilidad de los leucocitos y daban como resultado más infecciones de lo normal) DEFECTOS DE LA FAGOCITOSIS En estos defectos se produce la ingestión del agente patógeno pero su digestión es defectuosa o no se produce por (la fase de descarga de gránulos lisosomales se encuentra alterada). Las causas pueden ser: - Defecto celular intrínseco: Como en la diabetes - Déficit de Ig o complemento (Co): La opsonización será defectuosa, por lo que las partículas no podrán ser reconocidas por los leucocitos. DEFECTOS EN LA ACTIVIDAD MICROBICIDA Se trata de defectos genéticos hereditarios que codifican componentes de los mecanismos oxígenodependientes, por lo que no se puede formar el radical hipocloroso: - Defecto de la NADPH oxidasa. Puede ser: o Ligada al cromosoma X (gp91phox) Enfermedad granulomatosa crónica: Se trata de un defecto en la función oxidante de los gránulos leucocitarios. La padecen con más frecuencia los niños. P Para diagnosticarla se realiza un test de laboratorio llamado NBT test, que consiste en añadir gránulos de nitrato B tetrazolio (colorante) a leucocitos en cultivo. Cuando todo funciona correctamente (NBT test normal) el colorante fagocitado se oxida y cambia de color de amarillo a azul negruzco, formando lo que llamamos “gránulos de farmazac”. Será patológico cuando estos gránulos no se formen (marcador diagnóstico) o - Autosómica recesiva (p47phox yp67phox) Déficit de mieloperoxidasas Déficit de glucosa 6 fosfato-deshidrogenasa: También participa en el ciclo, aunque este defecto es mucho más raro. 19