Diapositiva 1

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Listeria monocytogenes
Aspectos relevantes e implicación en
la seguridad alimentaria
Dr. David Rodríguez Lázaro
Área de Microbiología. Facultad de Ciencias
Listeria spp.
•
•
•
•
Gram +
Catalasa positiva
Anaerobia facultativa
Contenido bajo en G-C
10 especies:
• L. monocytogenes
• L. innocua
• L. ivanovii
• L. seeligeri
• L. welshimeri
• L. grayi
Humanos, rumiantes
Rumiantes
4 nuevas especies: L. rocourtiae, L.marthii, L.fleischmannii and L.weihenstephanensis
¿Por qué es una bacteria tan interesante?
Bacterias Gram+ bajo % G+C
Lactobacillus casei
Streptococcus pyogenes
Eneterococcus faecalis
Listeria monocytogenes
Bacillus subtilis
Staphylococcus aureus
Mycoplasma pneumoniae
•
Múltiples biotopos
- suelo y materia vegetal descomposición
• Patógeno de origen alimentario
- alimentos procesados
- intestino de los vertebrados
- células animales
• Crecimiento a 4ºC
• Supervivencia en el ambiente
• Modelo en investigación biomédica
- análisis molecular del parasitismo intracelular
- respuesta inmune de base celular
- dinámica del citoesqueleto de actina
Listeria es un modelo para …
+ estudios de biología celular de organismos superiores
Para respuesta inmune de base celular
dinámica del citoesqueleto de actina
Conocimiento del metabolismo celular normal
Listeria es un modelo para …
+ estudios evolutivos
tanto meramente darwinianos como sobre patogenicidad
orfXorfZ
• L. monocytogenes
• L. innocua
• L. ivanovii
• L. welshimeri
• L. seeligeri
• L. grayi
prs prfAplcA hly
actA
plcB orfBorfA ldh
L. monocytogenes
L. innocua
L. welshimeri
L. ivanovii
prs
prs
i-inlB2
mpl
i-inlL i-inlK i-inlB
orfXorf
L
orfC orfD
i-inlJ
orfE
orfK
i-inlH i-inlG smcL
i-inlE
i-inlF
ORF6
ORF3 ORF5ORF7
LIPI-2
ORF6
L. monocytogenes
ORF3
ORF5
ORF7
ORF8
ORF9
ORF10
ORF11
L. seeligeri
ldh
dplcB
L. ivanovii
i-inlI
ldh
ORF9
Listeria es un modelo para …
+ estudios sobre patogenecidad y regulación microbiana
The PrfA virulence regulon
Positive regulatory factor
P
P4 P3 P2 P1
inlA
P
P
inlB
hpt
PrfA
inlC
P
P2 P1
prfA
(Positive Regulatory Factor)
plcA
PrfA
orfZ
P P2P1 P3
P2 P1
prs
prfA
plc A
P
hly
P
mpl
ac tA
plc B orfX
orfB orfA
TGTTTTCTGCATG
aTAACAAGTGTTAA TGACGGAAAGAGAGTATCTGGTTTATATTTTTA...
hpt
TTATGTTGAGGCA
CCCTTTATCGTCG
TGGGGTTAACTGA
AAATTTAGAAGAA
TTTTCGATTATTA
TAAAGGGTAGAGG
TTAACATTTGTTAA
TTAACAAATGTTAA
TTAACAAATGTTAg
TTAACAAATGTaAA
TTAACgCTTGTTAA
aTAACATAaGTTAA
hly
plcA
actA
mpl
inlC
inlA
CGACGATAAAGGGACAGCAGGACTAGAATAAAGCTAT
TGCCTCAACATAAAAGTCACTTTAAGATAGGAATA
AGAAAAATTAATTCTCCAAGTGATATTCTTAAAT
AGAATATCTGACTGTTTATCCATATAATATAAGCA
TTTAAACATCTCTTATTTTTGCTAACATATAA
TTCTTTTTTTTGGAAAAATAGTTATTATTATTTAA
TTAACANNTGTTAA
PrfA regula positivamente la expresión de los-41.5
factores de virulencia de LIPI-1
CONSENSUS
Positive regulatory factor
PrfA
Ambiente Extracelular
P
P2 P1
prfA
plcA
Genes de virulencia no necesarios
metabólico)
Forma PrfA no activa y poca cantidad
Genes PrfA dependientes no expresados
(gasto
Ingestión /inicio de invasión
Genes de virulencia empiezan a ser necesarios
Forma PrfA no activa y regulación sigmaB
Genes PrfA dependientes ligeramente expresados
Ambiente Intracelular
Genes de virulencia necesarios
Cambio conformación de PrfA y gran
Gran cantidad de PrfA
Genes PrfA dependientes activamente expresados
Mecanismo de regulación de PrfA
Ambiente extracelular
INACTIVO
prfA
Ambiente extracelular
COFACTOR
plcA
a
PrfA inactivo
PrfA Activo
prfA
b
plcA
c
d
ACTIVADO
Valencia 1989
P14
Madrid 1999
P14-A
Identificación de mutantes hiperhemolíticos de L. monocytogenes
Espontáneo (Ripio et al. 1996)
Inducido (Ermolaeva et al. 1997)
Mutantes hiperhemolíticos portan mutaciones puntuales
en prfA y sobre-expresan constitutivamente todos los
genes PrfA-dependientes
Mutantes Hly+++ portan una sustitución Gly145®Ser en
PrfA (mutación PrfA*)
1
M N A Q A E E F K K Y L E T N G I K P K Q F H K K
25
26
E L I F N Q W D P Q E Y C I F L Y D G I T K L T S
50
51
S
I S E N G T I M N L Q Y Y K G A F V I M S G F I D
75
76
T E T S V G Y Y N L E V I S E Q A T A Y V I K I N
100
101
E L K E L L S K N L T H F F Y V F Q T L Q K Q V S
125
126
Y S L A K F N D F S I N G K L G S I C G Q L L I L
150
151
F
S
T Y V Y G K E T P D G I K I T L D N L T M Q E L G
175
176
Y S S G I A H S S A V S R I I S K L K Q E K V I V
200
201
Y K N S C F Y V Q N L D Y L K R Y A P K L D E W F
225
226
Y L A C P A T W G K L N
237
Mutaciones PrfA* aumentan la capacidad de unión a DNA de PrfA
a b
CIII
CIII
Mutaciones PrfA* aumentan la capacidad de unión a DNA de PrfA
PrfA*
normalised gene expression
45
PrfA
specific
non-specific
42.42
30
24.82
15.89
15
0
0.93
PrfA* HeLa /
PrfA-wt BHI
0.86
PrfA-wt HeLa /
PrfA-wt BHI
0.71
PrfA* BHI /
PrfA-wt BHI
2.67
1.31
1.71 1.08
1.58 1.21
PrfA* HeLa /
PrfA* BHI
PrfA* HeLa /
PrfA-wt HeLa
PrfA-wt HeLa /
PrfA* BHI
Listeria es un modelo para …
+ estudios de parasitismo intracelular
Entrada
Evasión de la vacuola fagocítica
y replicación citosólica
Movilidad intracelular y paso de célula a célula
Movilidad intracelular de Listeria monocytogenes
speed 150 ´ (0.3 m/s)
Listeria es un modelo para …
+ Patógeno alimentario
• Organismo ubicuo (=en todas partes)
• Organismo piscrotrofo (capaz de crecer a temperaturas de refrigeración)
• Amplio rango de pH (de pH próximos a 4 hasta 9)
• Moderadamente resistente a concentraciones de sal
• Ligeramente resistente a tratamientos de pasteurización baja
• Capaz de producir BIOPELÍCULAS
• Aislado en todas las sectores alimentarios (cárnico, lácteo, pesquero …)
• Elevada mortalidad (superior al 25% y llegando hasta el 60%)
• Capaz de pasar la barrera hematoencefálica ð LESIONES Y SÍNTOMAS
NERVIOSOS
• Capaz de pasar la barrera hematoplacentaria ð ABORTOS Y LESIONES
EN EL FETO
• Requiere más de 5 días para su detección
Ecología de Listeria monocytogenes
Suelo (vegetación en descomposición) ? ® ambiente rural (abono, etc) ® cadena alimentaria
Patofisiología de la infección por Listeria (Listeriosis)
- enfermedad severa, mortalidad media 20-50 % en humanos
- Dos formas clínicas:
perinatal (1/3) (mujeres embarazadas, fetos, y recién nacidos)
pacientes adultos (2/3) (>40 años)
placentitis, abortos y sepsis neonatal
meningoencefalitis
Epidemias de listeriosis de origen alimentario
Location
date
cases
strain
food
Boston
Canada (N. Scotia)
Massachussets
California
Switzerland (Vaud)
United Kingdom
Gran Canaria
France
1979
1981
1983
1985
1983-87
1987-1989
1992
1992
23
41
49
142
122
>300
24
279
4b
4b
4b
4b
4b
4b
4b
4b
vegetables?
coleslaw
milk?
cheese
cheese
pâté
cheese?
pork tongue in aspic
France
Illinois
France
Italy
France
…………..
Canada
Austria
1993
1994
1995
1996
1997
……….
2008
2009-10
38
45*
35*
39
14
….
43 (22 V)
34 (8V)
4b
1/2b
4b
1/2b
4b
…..
“rillettes”
chocolate milk
cheese
rice salad
cheese
…………
RTE delis
Cheese
* gastroenteritis
Relevancia en la salud pública
USA
9,388,075 casos
Relevancia en la salud pública
USA
Casi 19% muertes
29% bacterianas
Desde el punto de vista legislativo
Tolerancia cero (AUSENCIA): EE.UU., Canadá, Japón
En función de la capacidad del alimento de soportar el
crecimiento de Listeria: EU
ðAquellos que no lo soportan: 100 ufc/g
ðAquellos que lo soportan: 100 ufc/g
Cómo se analiza?
Cómo se analiza?
Dos apuntes finales de los dos últimos brotes serios …
CASO ESTUDIO:
Brote de Listeriosis en Canadá
Verano 2.009
Patatas Meléndez S.L.
Valladolid, 26 de Enero 2.009
Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008
Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008
Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008
Reacciones:
Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008
Reacciones:
Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008
Reacciones:
Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008
Reacciones:
Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008
Lección aprendida por la empresa ð Actitud pro-activa
y de liderazgo
Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008
Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008
Brote de Listeriosis en Austria – verano 2.009
EMPRESA
OFICIAL / UNIVERSIDAD
Brote de Listeriosis en Austria – verano 2.009
Nivel de contaminación: < 5 cfu / 100g
ò
Probabilidad de detección 45-60%
(usando 5 muestras de 25g)
Probabilidad de detección <20%
(usando 1 muestra de 25g)
Probabilidad de detección usando ISO 11290-2 <1%
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